猪胚胎早期卵裂时间与其发育潜能关系的初步研究

旨在探讨初次卵裂时间对猪孤雌胚胎发育潜能及其基因相对表达水平的影响。本试验从健康母猪卵巢上抽取卵母细胞进行体外成熟培养，将猪孤雌激活胚胎分为早期卵裂组（16~22 h）与晚期卵裂组（26~32 h）统计比较卵裂率和囊胚率，并对囊胚的多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4等和凋亡相关基因Bcl-xl、Bax、Caspase-3的相对表达水平进行分析检测。结果表明，猪孤雌激活胚胎在16~22 h发生卵裂的为50%~60%，而26 h之后发生卵裂的不到20%，在18 h前完成第一次卵裂的胚胎囊胚发育率为79%，42 h后发生初次卵裂的胚胎无法发育至囊胚期。猪孤雌激活胚胎早期卵裂组的囊胚发育率显著高于晚期卵裂组（P<0.05）。早期卵裂组囊胚的Oct4、Nanog、Sox2、Klf4基因的表达量显著高于晚期卵裂组（P<0.05），Oct4、Sox2、Klf4基因的相对表达量极显著高于晚期卵裂组（P<0.01），Bax和Caspase-3基因的相对表达水平极显著低于晚期卵裂组（P<0.01），而Bcl-xl作为保护因子其表达量相对于晚期卵裂胚胎（26~32 h）显著上调（P<0.05）。结果显示，初次卵裂时间较早的猪孤雌激活胚胎发育潜能显著高于较晚卵裂胚胎，其囊胚多能性相关基因表达上调，凋亡相关基因表达下调，卵裂时间可作为鉴定猪孤雌激活胚胎发育潜力的重要参数。     

细胞松弛素B对猪孤雌胚胎和体外克隆胚胎发育能力的影响

为探讨细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)对猪孤雌胚胎和克隆胚胎发育能力的影响,本研究通过在猪体外胚胎培养基中添加不同浓度CB以及不同孵育时间的处理,筛选出CB对猪早期胚胎发育的最适浓度和最佳孵育时间,同时通过Hoechst33342染色检测猪体外囊胚孵化期的细胞数差异,进一步研究CB对孤雌胚胎和克隆胚胎发育的影响。结果显示,培养基中添加CB浓度为7.5μg/mL时孤雌胚胎和克隆胚胎的卵裂率分别为85.00%和90.23%,囊胚率为35.68%和42.58%,均显著高于其他各组(P0.05);采用7.5μg/mL CB处理电激活后的孤雌胚胎和克隆胚胎,孤雌胚胎孵育4 h组的卵裂率(83.80%)和囊胚率最高(35.39%),与其他各组差异显著(P0.05),而克隆胚胎孵育6 h组的卵裂率(83.98%)和囊胚率最高(55.62%),与其他各组差异显著(P0.05)。此外,Hoechst33342染色结果显示,未添加CB处理的孤雌胚胎在囊胚孵化期的细胞平均数为28个,CB处理组的孤雌胚胎和克隆胚胎细胞平均数分别为36和52个,处理组和未处理组细胞数差异显著(P0.05)。结果表明,猪体外孤雌胚胎用7.5μg/mL CB处理4 h可获得较高的卵裂率和囊胚率;体外克隆胚胎用7.5μg/mL CB处理6 h卵裂率及囊胚率最高,且囊胚期内细胞团细胞总数最多。CB处理有利于体外胚胎早期发育,提高克隆胚胎移植受孕率。     

曲古抑菌素A和5-氮杂-2’-脱氧胞苷对猪孤雌胚胎发育的影响

为了研究曲古抑菌素A(TSA)和5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对猪孤雌胚胎发育及胚胎质量的影响,试验采用猪卵母细胞孤雌激活的方法,孤雌激活后在胚胎培养液中分别添加不同浓度TSA和5-Aza-CdR,比较其对猪孤雌胚胎发育的影响。结果表明:40 nmol/L TSA处理24 h能显著提高孤雌胚胎的囊胚率及囊胚细胞个数(P<0.05),卵裂率无明显变化(P>0.05);30 nmol/L5-Aza-CdR处理48 h能显著提高孤雌胚胎的囊胚率(P<0.05),卵裂率与囊胚细胞个数均无明显变化(P>0.05)。说明在一定浓度条件下,TSA和5-Aza-CdR对猪孤雌胚胎发育的囊胚率有显著促进作用,5-Aza-CdR处理对卵裂率、囊胚细胞个数的影响不大,但TSA处理可以明显提高囊胚细胞个数,从而提高胚胎质量。     

冷、热应激对猪孤雌胚胎体外发育的影响

为研究持续不同时间的冷、热应激对猪孤雌胚胎体外发育的影响,本研究以猪孤雌胚胎为材料,采用免疫荧光染色、实时荧光定量PCR技术检测不同时间的冷(31℃)、热应激(41℃)处理对猪孤雌胚胎发育后囊胚发育率、细胞数、细胞凋亡率、自噬相关基因及细胞凋亡相关基因mRNA转录水平的影响。结果显示,热应激12h后囊胚发育率显著低于对照组(P0.05),冷应激18h后囊胚发育率显著低于对照组(P0.05),而冷应激组囊胚发育率高于热应激组。热应激12h和冷应激18h后均导致囊胚内细胞数显著低于对照组(P0.05),细胞凋亡率显著高于对照组(P0.05),且冷应激组的细胞凋亡率低于热应激组。冷、热应激组自噬相关蛋白LC3的表达均高于对照组;冷、热应激中自噬相关基因Atg6和Atg8的表达均极显著高于对照组(P0.01),Lamp2基因的表达均显著高于对照组(P0.05),热应激组中的Atg6和Atg8基因的表达高于冷应激组。通过检测细胞凋亡相关基因mRNA的转录水平发现,冷、热应激组中细胞凋亡相关基因Bak、Casp-3、Fas的表达均极显著高于对照组(P0.01),Bcl-xl基因的表达均显著低于对照组(P0.05)。综上,猪孤雌胚胎对冷应激(31℃)的耐受性比对热应激(41℃)强,且热应激可诱导体外培养的猪孤雌胚胎自噬及凋亡相关基因的表达,从而降低孤雌胚胎发育的能力。     

细胞松弛素B对猪孤雌胚胎和体外克隆胚胎发育能力的影响

为探讨细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）对猪孤雌胚胎和克隆胚胎发育能力的影响,本研究通过在猪体外胚胎培养基中添加不同浓度CB以及不同孵育时间的处理,筛选出CB对猪早期胚胎发育的最适浓度和最佳孵育时间,同时通过Hoechst33342染色检测猪体外囊胚孵化期的细胞数差异,进一步研究CB对孤雌胚胎和克隆胚胎发育的影响。结果显示,培养基中添加CB浓度为7.5 μg/mL时孤雌胚胎和克隆胚胎的卵裂率分别为85.00%和90.23%,囊胚率为35.68%和42.58%,均显著高于其他各组（P < 0.05）;采用7.5 μg/mL CB处理电激活后的孤雌胚胎和克隆胚胎,孤雌胚胎孵育4 h组的卵裂率（83.80%）和囊胚率最高（35.39%）,与其他各组差异显著（P < 0.05）,而克隆胚胎孵育6 h组的卵裂率（83.98%）和囊胚率最高（55.62%）,与其他各组差异显著（P < 0.05）。此外,Hoechst33342染色结果显示,未添加CB处理的孤雌胚胎在囊胚孵化期的细胞平均数为28个,CB处理组的孤雌胚胎和克隆胚胎细胞平均数分别为36和52个,处理组和未处理组细胞数差异显著（P < 0.05）。结果表明,猪体外孤雌胚胎用7.5 μg/mL CB 处理4 h可获得较高的卵裂率和囊胚率;体外克隆胚胎用7.5 μg/mL CB 处理6 h卵裂率及囊胚率最高,且囊胚期内细胞团细胞总数最多。CB处理有利于体外胚胎早期发育,提高克隆胚胎移植受孕率。     

亚甲基蓝对猪卵母细胞体外发育的影响

为研究亚甲基蓝(MB)对猪卵母细胞体外发育的影响,选取500个猪卵母细胞随机分为5组,各组添加亚甲基蓝浓度为0、10、50、100和200 nmol/mL,培养成熟44 h～46 h后,观察不同浓度的亚甲基蓝对卵母细胞成熟率影响;孤雌激活2 d～7 d后,观察胚胎卵裂率和囊胚率以及活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、母系表达基因含量的变化。结果表明,亚甲基蓝能显著提高猪卵母细胞孤雌激活后胚胎卵裂率和囊胚率,提高孤雌胚中GSH含量,降低ROS含量,增加孤雌激活胚中母系基因细胞周期素B1表达量。结果提示,一定剂量的亚甲基蓝可有效改善猪卵母细胞在体外的发育能力。     

曲古抑菌素(Trichostatin)A对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育能力的影响

曲古抑菌素A（Trichostatin A,TSA）是一种组蛋白去乙酰化抑制剂,用TSA处理鼠核移植胚胎可显著提高胚胎的囊胚率。检验TSA对猪卵母细胞体外成熟以及孤雌胚胎发育的影响。在猪卵母细胞体外成熟液及胚胎培养液中添加TSA,比较不同浓度TSA对卵母细胞成熟的影响,不同浓度TSA对孤雌胚胎发育能力的影响以及TSA处理不同时间对孤雌胚胎发育能力的影响。结果发现：（1）5nmol／LTSA处理对卵母细胞体外核成熟无显著影响,却显著提高了卵母细胞孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率（P〈0．05）;（2）50nmol／LTSA处理显著提高了孤雌胚胎的卵裂率及囊胚率（P〈0．05）;（3）50nmol／LTSA处理24h能显著提高胚胎的卵裂率及囊胚率（P〈0．05,82．1％&#177;2．6％和37．4％&#177;3．1％）。结果表明TSA对猪卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎发育具有显著的促进作用。5nmol／L的添加量对卵母细胞的体外胞质成熟具有促进作用;胚胎培养基中添加50nmol／LTSA处理24h能提高孤雌胚胎的发育能力。     

冷、热应激对猪孤雌胚胎体外发育的影响

为研究持续不同时间的冷、热应激对猪孤雌胚胎体外发育的影响,本研究以猪孤雌胚胎为材料,采用免疫荧光染色、实时荧光定量PCR技术检测不同时间的冷（31℃）、热应激（41℃）处理对猪孤雌胚胎发育后囊胚发育率、细胞数、细胞凋亡率、自噬相关基因及细胞凋亡相关基因mRNA转录水平的影响。结果显示,热应激12 h后囊胚发育率显著低于对照组（P<0.05）,冷应激18 h后囊胚发育率显著低于对照组（P<0.05）,而冷应激组囊胚发育率高于热应激组。热应激12 h和冷应激18 h后均导致囊胚内细胞数显著低于对照组（P<0.05）,细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05）,且冷应激组的细胞凋亡率低于热应激组。冷、热应激组自噬相关蛋白LC3的表达均高于对照组;冷、热应激中自噬相关基因Atg6和Atg8的表达均极显著高于对照组（P<0.01）,Lamp2基因的表达均显著高于对照组（P<0.05）,热应激组中的Atg6和Atg8基因的表达高于冷应激组。通过检测细胞凋亡相关基因mRNA的转录水平发现,冷、热应激组中细胞凋亡相关基因Bak、Casp-3、Fas的表达均极显著高于对照组（P<0.01）,Bcl-xl基因的表达均显著低于对照组（P<0.05）。综上,猪孤雌胚胎对冷应激（31℃）的耐受性比对热应激（41℃）强,且热应激可诱导体外培养的猪孤雌胚胎自噬及凋亡相关基因的表达,从而降低孤雌胚胎发育的能力。     

胰岛素和白血病抑制因子对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎的影响

为探讨胰岛素(Insulin)和白血病抑制因子(Leukemia inhibit factor,LIF)对猪卵母细胞体外成熟(IVM)和猪孤雌激活胚胎(PAEs)的影响,在卵母细胞体外成熟或者胚胎培养基中添加Insulin和LIF,研究卵裂率和囊胚率的变化。结果:添加了5μg/mL Insulin后猪卵母细胞体外成熟效果显著提高,但成熟后孤雌激活发育能力与非添加组相近;而胚胎培养基中添加Insulin对孤雌胚的卵裂和囊胚的形成也没有明显促进作用;添加1 000 U/mL的LIF后,卵母细胞核成熟率没有明显提高,反而孤雌激活后囊胚率急剧下降,但对卵裂率以及囊胚总细胞数影响不大;在胚胎培养基中添加LIF后,孤雌胚的卵裂和囊胚形成并没有明显的提高。表明:Insulin对卵母细胞体外成熟有益,但是对孤雌胚胎的最佳处理程序还需要摸索;本文所采用的LIF处理对猪卵体外成熟以及孤雌胚胎体外发育没有帮助,还需要进一步研究其他浓度和处理程序对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎发育能力的影响。     

丙戊酸钠促进猪再克隆胚胎体外发育

对VPA处理的最佳处理时间和处理浓度进行探索,希望通过VPA处理来改善再克隆胚胎的发育能力.结果表明,使用1 mmol/L VPA处理16 h,可以获得较高的囊胚形成率.然后通过免疫荧光检测发现,囊胚时期acH3K9的乙酰化水平在处理组中高于非处理组.多能性因子Oct4、Nanog、Sox2和Klf4的实时定量检测结果则显示,它们之间的表达水平同样差异不显著.结果表明VPA能够显著提高猪再克隆胚胎体内发育能力.     

卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响

为探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的添加浓度及脱卵丘细胞时间对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响.试验通过在体外成熟液中添加不同浓度(0、10、15、20、30、40 ng/mL)的EGF来研究其对培养44 h的卵母细胞成熟率以及孤雌胚胎发育的影响;在培养开始后的不同时间(18、24、38、44 h)进行脱卵丘细胞处理来研究不同时间脱卵丘处理对培养44 h的卵母细胞成熟率以及孤雌胚胎发育的影响.结果表明,成熟培养基中添加10 ng/mL EGF能显著提高卵母细胞的卵裂率和囊胚率(P <0.05).共培组和独培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞成熟率均低于44 h,但差异不显著(P >0.05);共培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞的卵裂率和囊胚率显著高于培养44 h(P <0.05);独培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞的卵裂率与44 h无显著差异(P >0.05),但囊胚率显著高于培养44 h后脱卵丘细胞(P <0.05).添加10 ng/mL EGF对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育较好;卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞可提高孤雌胚胎早期发育能力.     

Scriptaid对猪移植体细胞核在胚胎外发育的影响

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)是调控基因的关键蛋白酶,乙酰化是一种可逆的蛋白共价修饰。组蛋白去乙酰化酶可以改变特定基因的转录和表达水平,诱导细胞的分化和凋亡。为了检测一种低毒新型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对克隆猪胚胎发育的影响,进行了不同浓度和不同时间的处理,并在体外检测了胚胎分裂率和囊胚发育能力。研究以对照试验作为基础,以凌源禾丰种猪场长白猪胎儿成纤维作为供体细胞,然后通过体细胞核移植(SCNT)技术获得体外发育胚胎。将重构胚胎以不同浓度(0、200、500、700、900 nmol/L)Scriptaid处理后,并进行不同时间(0、15、36、72 h)的培养,然后通过观察不同处理浓度和处理时间下胚胎在2细胞阶段分裂率和囊胚发育率。再通过Real-time PCR检测2细胞阶段未处理组与Scriptaid处理组的Oct4、Sox2两个因子的相对表达变化。通过统计学分析发现,与未处理组相比,500 nmol/L Scriptaid处理15 h囊胚发育率显著增加(P0.05),但2细胞阶段分裂率基本不变,而未处理组克隆胚胎在囊胚期Oct4基因表达的倍数明显低于经过Scriptaid处理的克隆胚胎在囊胚期的表达倍数(P0.05),这说明经过500 nmol/L Scriptaid处理后,克隆胚胎的Oct4表达量明显提高。未经过处理的克隆胚胎在囊胚期Sox2基因的表达倍数和经过Scriptaid处理的克隆胚胎在囊胚期Sox2基因的表达倍数有差异但是差异不明显,这说明经过500 nmol/L Scriptaid处理之后,基因Sox2表达虽然有提高,但总体来说和未处理的胚胎相比差异不大(P0.05)。     

SAHA处理对猪手工克隆胚胎体外发育潜能的影响

为了探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对德保猪手工克隆胚胎(HMC)发育潜能的影响,试验摸索SAHA的适宜处理浓度[0(对照),1.0,2.5,5.0,7.5,10.0μmol/L]和时间(0,6,12,24 h);之后分为4组,SAHA组、体外受精(IVF)组、孤雌激活(PA)组、对照(HMCC)组,分别在体外发育的1细胞期、2细胞期、4细胞期、囊胚期收集胚胎,在相同时期下比较各组胚胎组蛋白H4K8乙酰化(Ac H4K8)水平差异和相关基因(HDAC1、HAT1、ASF1A、OCT-4)相对表达量。结果表明:7.5μmol/L SAHA处理囊胚率显著高于对照(P0.05),12 h囊胚率显著高于0 h(P0.05);所以适宜处理浓度为7.5μmol/L,适宜处理时间为12 h。在1细胞期、2细胞期、囊胚期,SAHA组Ac H4K8水平接近IVF组水平(P0.05)。在囊胚期,SAHA组HDAC1基因相对表达量接近IVF组(P0.05);在囊胚期,SAHA组OCT-4基因相对表达量接近IVF组(P0.05)。说明SAHA可以使HMC胚胎Ac H4K8水平接近IVF水平,并纠正克隆胚胎乙酰化的异常,从而提高克隆胚胎发育潜能。     

电激活参数与渗透压阶段培养法对孤雌胚胎发育能力的影响

试验旨在摸索猪卵母细胞孤雌激活的电场强度和脉冲时间,并探索渗透压阶段培养法对孤雌胚胎后期发育的影响。猪卵母细胞成熟培养42~44 h后,分别在电场强度2.1、2.3、2.5 kV/mm和脉冲时间30、60、90 μs的9组电激活参数下进行孤雌激活试验;卵母细胞在2.1 kV/mm和30 μs的参数下进行孤雌激活后,分别培养于渗透压为271、280、290、302 mOsm的PZM-3中,48 h后移入渗透压280 mOsm的PZM-3中继续培养96 h;孤雌胚胎于电激活后先在含2 mmol/L 6-DMAP的PZM-3中培养4~6 h,然后移入不含6-DMAP的PZM-3中继续培养。试验结果表明,电场强度和脉冲时间两个参数间无显著的交互作用(P>0.05),脉冲时间相同条件下,卵裂率在不同电场强度条件下均无显著差异(P>0.05),2.1和2.5 kV/mm的电场强度条件下,脉冲时间为30 μs时的卵裂率显著高于60和90 μs(P<0.05),而2.3 kV/mm电场强度下3个脉冲时间试验组的卵裂率无显著差异(P>0.05),各试验组的囊胚率无显著差异(P>0.05);孤雌胚胎在渗透压为290~310 mOsm的PZM-3中培养48 h,卵裂率得到显著提高(P<0.05),渗透压对囊胚率无显著影响(P>0.05);6-DMAP对孤雌胚胎卵裂率无显著影响(P>0.05),但可以显著提高囊胚率(P<0.05)。结果提示,猪卵母细胞孤雌激活需要较高的电场强度(2.1~2.3 kV/mm)而脉冲时间不宜过长(30 SymbolmA@s);48 h的高渗培养和6-DMAP的辅助激活有助于孤雌胚胎的后期发育。     

DMSO和FBS对绵羊孤雌胚胎发育的影响

为进一步优化绵羊卵母细胞孤雌胚胎的体外发育系统,试验研究了二甲基亚砜(DMSO)和胎牛血清(FBS)对绵羊孤雌胚胎发育能力的影响。结果表明:化学激活液中DMSO的含量增加到1%,卵裂率(80.92%)和囊胚率(15.45%)极显著提高(P0.01);在有糖的胚胎发育液中添加FBS,囊胚率(26.13%)极显著提高(P0.01)。     

猪孤雌激活胚胎的体外培养

试验研究了不同培养体系对猪体外成熟卵母细胞电激活后的体外发育的影响。试验1比较了猪孤雌发育胚胎在NCSU 23、G 2.2添加氨基酸(G 2.2-aa)和G 2.2培养体系中的体外发育效率,结果表明,3个组卵裂率差异不显著(P>0.05),NCSU 23体系的囊胚率显著高于其他2组(14.37±3.77 vs.2.67±2.68和3.13±0.45,P<0.01),但3组间囊胚细胞数差异不显著(21.29±5.27 vs.19.33±2.54和20.27±4.72,P>0.05)。试验2探讨了胚胎培养72h后更换培养液对孤雌发育胚胎的影响,结果显示,培养液更换对卵裂率和囊胚细胞数的影响差异不显著(P>0.05),但更换组囊胚率显著下降(12.50±1.49 vs.5.56±1.89、6.25±1.13、4.64±1.56,P<0.05)。试验3研究了在G 2.2-aa添加胰岛素、亚牛磺酸和半胱氨酸对孤雌激活胚胎发育的影响,结果显示,以上添加剂对卵裂率和囊胚细胞数无显著影响(P>0.05);在G 2.2-aa添加胰岛素、亚牛磺酸和半胱氨酸能明显提高囊胚发育率(6.38±1.00、6.20±2.08、8.73±1.03 vs.2.99±2.21,P<0.05),但以上各组的囊胚率明显低于NCSU 23体系(P<0.05)。结论:NCSU 23是猪孤雌激活发育胚胎较为理想的培养液。     

3种中药单体成分对猪孤雌激活胚胎体外发育效果的影响

为了建立良好的猪胚胎体外培养体系,以体外成熟培养的卵母细胞为材料,研究中药单体成分川芎嗪（Lig）、小檗碱（BR）和淫羊藿苷（Ica）对猪孤雌激活胚胎体外培养效果的影响。以NCSU-23基础培养液为对照组,采用同一种孤雌激活方案,在培养液NCSU-23中分别添加中药单体成分川芎嗪、小檗碱和淫羊藿苷的小、中、大剂量（Lig1、Lig2、Lig3;BR1、 BR2、BR3;Ica1、Ica2、Ica3）为3个试验组,比较了各组猪孤雌激活早期胚胎的发育效果,从而进行中药单体成分最佳浓度的筛选。结果显示：①孤雌激活胚胎体外发育至48 h的卵裂率和第7天的囊胚发育率, Lig1组与对照组和Lig2组之间差异显著（P< 0.05）,与Lig3组差异极显著（P<0.01）。②BR2组的卵裂率与对照组和BR3组之间差异显著（P<0.05）,与BR1组无显著差异（P>0.05）。第7天囊胚发育率BR2组显著高于其他各组（P<0.05）,其他各组之间无显著差异（P>0.05）。③Ica2组胚胎发育至48 h的卵裂率和第7天的囊胚发育率均显著高于其他各组（P<0.05）,而其他各组之间无显著差异（P>0.05）。由此可见,在NCSU-23基础液中添加3种中药单体成分最佳浓度均能显著提高猪孤雌胚体外发育效果。     

小鼠孤雌激活胚胎早期发育过程中胞吞作用相关蛋白的动态表达分析

为探索哺乳动物孤雌激活胚胎早期发育过程中胞吞作用相关蛋白的动态表达,通过体外生产小鼠孤雌激活胚胎,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测不同发育时期小鼠孤雌激活胚胎胞吞作用相关蛋白Cav1、Cav2基因和蛋白相对表达水平,并采用免疫荧光技术进行不同发育时期小鼠孤雌激活胚胎中Cav1、Cav2表达定位分析。结果表明,在小鼠孤雌激活胚胎不同时期均可检测到Cav1、Cav2基因及其蛋白的表达,其中囊胚和桑椹胚中该2个基因的表达水平最高,4-8细胞时期次之,2细胞最低;各发育时期孤雌激活胚胎中Cav1、Cav2蛋白主要定位在胚胎细胞胞质内;囊胚中内细胞团(ICM)细胞中Cav1的荧光强度高于滋养层细胞。说明胞吞作用相关蛋白Cav1、Cav2可能参与小鼠早期胚胎发育的生理调控,桑椹胚和囊胚时期可能是其发挥生理功能的重要时期,并且在囊胚时期对内细胞团发育的调控作用更为显著。研究结果可为探索胞吞作用参与哺乳动物胚胎早期发育的调控机制提供重要参考。     

猪孤雌激活早期胚胎线粒体分布及mtDNA拷贝数变化的研究

本研究通过线粒体分子探针标记技术检测孤雌激活早期胚胎线粒体的分布变化,运用实时荧光定量PCR技术检测mtDNA拷贝数的变化,揭示早期胚胎发育过程中线粒体分布、mtDNA拷贝数变化趋势。结果表明,成熟卵母细胞电激活后,由2-细胞胚胎开始,卵裂球内线粒体分布均匀且密集,每个细胞均有分布,卵裂球之外的空隙未见线粒体分布,直到囊胚形成,线粒体均有分布。孤雌激活4-细胞胚胎mtDNA拷贝数显著高于8-细胞胚胎mtDNA拷贝数(907210.77±145520.77,186224.33±103308.00,P<0.05),但显著低于2-细胞胚胎、桑椹胚、囊胚的mtDNA拷贝数(1563422.54±224666.51、1697626.25±176999.53和1752301.29±101146.64,P<0.05)。孤雌激活扩张囊胚mtDNA拷贝数最高,为2812545.67±156819.31,显著高于其他发育时期胚胎的mtDNA拷贝数(P<0.05)。由此可见,孤雌激活早期胚胎发育进程中线粒体分布及mtDNA拷贝数会发生变化。     

小型猪克隆胚胎体外培养阶段的优化

本试验从卵母细胞卵丘多少和初次卵裂时间早晚2个方面进行研究,旨在改善小型猪克隆方案的体外培养环节,提高克隆效率。将卵母细胞按卵丘多少分成3组,比较卵母细胞的成熟效果,取成熟效果好的卵母细胞进行后续试验;PA和SCNT试验均按初次卵裂时间早晚分成3组,在体外培养条件下,比较胚胎的卵裂率和囊胚率。结果表明,卵丘多的卵母细胞体外成熟39～40 h和卵丘少的卵母细胞体外成熟41～42 h,比不区分卵丘多少的卵母细胞体外成熟39～42 h的成熟效果要好;初次卵裂时间发生在26 h以前的胚胎比26 h之后的胚胎在数量和质量上都明显优越,前者胚胎的卵裂率和囊胚率显著高于后者,此结果在孤雌激活(parthenogenetic,PA)胚胎和体细胞核移植(somatic cell nucleartransfer,SCNT)胚胎的体外试验中均得到验证。本研究完善了小型猪克隆方案的体外培养环节,为器官异种移植提供相关技术参考。