外源EGFP和hTH基因在恒河猴骨髓源神经干细胞内的稳定表达

目的构建携带人酪氨酸羟化酶(hTH)的荧光真核表达质粒-pEGFP-C2-hTH,转染骨髓基质细胞源神经干细胞(BMSCs-D-NSCs),观察外源EGFP和hTH基因在BMSCs-D-NSCs中的表达情况。方法应用基因重组技术,将pWAV2-TH中的TH目的基因亚克隆到荧光真核表达载体 pEGFP-C2,以酶切和测序鉴定重组质粒pEGFP-C2-hTH的正确性:pEGFP-C2-hTH经NucleofectorTM 核转染仪转染培养的恒河猴BMSCs-D-NSCs,24 h后观察绿色荧光蛋白的瞬时表达情况,10 d后行 TH单克隆抗体的免疫组化和TH基因的RT-PCR。结果 (1)酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性;(2)细胞转染24 h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达,观察到 80％的转染细胞发出绿色荧光;转染10 d后细胞的RT-PCR检测到hTH基因的表达,TH单克隆抗体免疫组化结果显示转染细胞呈阳性染色,同时在荧光显微镜下观察到绿色荧光。结论构建的 hTH荧光真核表达重组质粒pEGFP-C2-hTH,经电转染方法转染至BMSCs-D-NSCs内,成功表达hTH 和EGFP,为BMSCs-D-NSCs基因治疗提供了实验基础。     

TH基因修饰细胞脑内移植治疗猴帕金森病的实验研究

目的 评价包囊化酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroylase,TH）基因修饰的基因工程细胞脑内移植治疗帕金森病的疗效。方法 将pcDNA3/hTH质粒转染人神经母细胞瘤细胞系SYTY细胞，筛选出阳性克隆，微包囊化处理后的含有TH基因修饰细胞植入PD猴模型脑内，观察其行为、CSF中DA含量的变化，用免疫组化法检查移植细胞的存活情况。结果 （1）pcDNA3/hTH基因经亚克隆，提取纯化的质粒，经ECORI酶切后产生1.9Kb和5.5Kb的片段。转基因后的SY5Y细胞免疫细胞化学染色显示TH染色强阳性；（2）移植后PD猴症状明显改善，脑脊液中DA含量升高；（3）SABC免疫组化发现移植区存在大量TH阳／性细胞。结论 构建的TH基因工程细胞体外和体内均表达人类TH基因；微包囊化处理后的基因工程细胞在PD猴脑内存活并发挥治疗作用。     

重组质粒pcDNA3.1 his-hTH与pEGFP-C2共转染骨髓基质细胞源神经干细胞的实验研究

目的 构建携带人酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)目的基因片段的真核表达重组质粒-pcDNA3．1his-hTH，与pEGFP-C2共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，观察hTH基因在骨髓源神经干细胞中的表达情况。方法 应用基因重组技术，将pWAV2-TH中TH基因亚克隆到pcDNA3．1his真核表达载体，以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3．1his-hTH的正确性；将pcDNA3．1his-hTH和pEGFP-C2经电击穿孔法共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，24h后观察EGFP瞬时表达情况，10d后进行hTH基因RT-PCR，以及hTH和6His单克隆抗体的免疫组化检测。结果 (1)酶切和测序结果均证实pcDNA3．1his-hTH的正确性；(2)细胞转染24h后，荧光显微镜下可观察到EGFP的表达，80％以上细胞发出绿色荧光；10d后RT-PCR检测到细胞内有hTH基因的表达，免疫组化结果显示细胞有hTH和6His抗原表达。结论 成功构建的pcDNA3．1．his-hTH和pEGFP-C2能够共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，hTH、EGFP和6His基因在细胞内有效表达。该系统可以作为体外检测转染率、细胞移植治疗帕金森病活体跟踪移植细胞的技术平台。     

pEGFPN1-GDNF真核表达载体的构建及其表达

目的 构建人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因真核表达载体并观察其在COS-7细胞内的表达.方法 应用RT-PCR从U251细胞总RNA中扩增GDNF cDNA,将其克隆至真核表达载体pEGFPN1,经酶切鉴定及序列分析后,以Fugene HD介导转染COS-7细胞,应用免疫细胞化学和Western blot鉴定其在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为650bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-GDNF经双酶切产生650bp和4.7kb的片段,测序分析结果与文献报道结果完全一致.将其转染COS-7细胞后,免疫细胞化学、Western blot结果表明GDNF蛋白能在COS-7细胞中正确表达.结论 成功构建了pEGFPN1-GDNF真核表达载体,为进一步开展帕金森病的基因治疗研究奠定了基础.     

帕金森病脑内移植基因工程细胞系的构建

目的 为进行帕金森病（PD）的转基因细胞治疗，在实验室构建人类酪氨酸羟化酶（hTH）基因表达工程细胞系。方法 重组质粒pcDNA3/hTH经亚克隆、纯化后，用脂质体法转染到人类神经母细胞瘤细胞系SH－SY5Y细胞内，经G418筛选、克隆，分离培养经免疫细胞化学分析。结果 转染pcDNA3/hTH的SH－SY5Y细胞免疫细胞化学染色明显，与仅呈非特异性染色的对照组SH－SY5Y细胞形成鲜明的对比。结论 转染pcDNA3/hTH的SH－SY5Y细胞能够有效地表达hTH，在PD治疗的非人类灵长目实验中具有潜在的应用价值。     

GDNF基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

目的 建立脑源性神经营养因子(GDNF)基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞.方法以RT-PCR扩增GDNF基因编码序列,将其克隆至质粒pEGFPN1构建重组质粒pEGFPN1一GDNF,经酶切鉴定及序列分析后,以FuGENE HD转染试剂介导转染大鼠胚胎中脑神经干细胞.免疫细胞化学、western blot鉴定GDNF的表达,诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力.结果 RT-PCR产物为650bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-GDNF经酶切产生650bp和4.7kb的片段,序列分析结果与文献报道一致.免疫细胞化学、western blot表明GDNF基因修饰细胞能正确表达GDNF且基因修饰不影响其增殖与分化.结论建立GDNF基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞,为进一步应用其开展帕金森病的细胞移植治疗研究奠定基础.     

构建睫状神经营养因子和绿色荧光蛋白基因转导的重组腺病毒载体

目的 以重组腺病毒(rAd)为载体构建腺病毒-睫状神经营养因子-内部核糖体进入位点-绿色荧光蛋白(Ad-CNTF-IRES-GFP).方法 先构建Psp-CNTF-IRES-GFP质粒,再制备PDC316-CNTF-IRES-GFP质粒,然后在脂质体的作用下,用构建好的PDC316-CNTF-IRES-GFP质粒与骨架质粒PBHG在293-LP细胞中构建Ad-CNTF-IRES-GFP腺病毒,并扩增、纯化,鉴定病毒活性.最后,将Ad-CNTF-IRES-GFP转染人源性骨髓间充质细胞(MSCs),观察MSCs的CNTF表达情况.结果 成功扩增CNTF基因,扩增后的CNTF基因与基因文库序列完全相符;成功制备PDC316-CNTF-IRES-GFP质粒及Ad-CNTF-IRES.GFP腺病毒,测得Ad-CNTF-IRES-GFP腺病毒的病毒活性单位(pfu)为2.3x1011;构建好的Ad-CNTF-IRES-GFP成功转染MSCs,而凡转染后的MSCs表达CNTF的量为未转染MSCs表达量的20倍.结论 本方法能够成功构建Ad-CNTF-IRES-GFP腺病毒载体,而且转染后的MSCs高度表达CNTF.     

HSV-1 VP22及microdystrophin基因融合表达重组质粒的构建及其生物学特性的初步研究

目的 构建人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)病毒蛋白22(VP22)及microdystrophin基因融合表达重组质粒,体外研究其表达及HSV-1 VP22介导的蛋白转导特性,为进一步利用此重组质粒治疗Duchenne型肌营养不良症(DMD)奠定基础.方法 从质粒pSINrep5-VP22中PCR扩增HSV-1 VP22全长基因.然后克隆至真核表达载体pAVX1中,构建重组质粒pAVP22:再用Not I酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因,片段回收后定向插入质粒pAVP22中,获得重组质粒pAVP22-MICDYS:然后将重组质粒pAVP2-MICDYS转染至小鼠成纤维细胞3T3细胞.通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光检测microdystrophin基因的转录及蛋白表达;最后收集转染后3T3细胞上清,感染人间充质干细胞(MSCs),检测重组蛋白在人MSCs中的表达情况来分析HSV-1 VP22是否可以介导VP22-microdyslrophin融合蛋白的转导.结果 成功构建了含有HSV-1 VP22和microdystrophin基因的重组质粒.并在体外得到了很好表达:同时也证实HSV-1 VP22提高了microdystrophin基因在3T3细胞中的表达效率,并可介导VP22-mizrodystrophin蛋白从3T3细胞到人MSCS间的转导.结论 该重组质粒的构建及体外成功表达和蛋白转导特性的确定为下一步用该重组质粒进行DMD疾病治疗研究奠定了基础.     

pcDNA3-hNGFb真核表达载体的构建及其表达

目的构建人神经生长因子β（NGF-β）基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表达。方法以RT-PCR从人脑组织总RNA中扩增NGF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD-NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NGF-β在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒pcDNA3-hNGFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人NGF-βcDNA完全一致。将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NGF-β及其前体proNGF-β能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hNGFb,为后续的研究奠定基础。     

GFP-Nurr1基因修饰神经干细胞的建立及过表达Nurr1对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响

目的利用慢病毒载体建立GFP-Nurr1基因修饰的原代神经干细胞(NSCs)模型并观察Nurr1过表达后NSCs向多巴胺神经元的分化影响。方法利用基因重组构建pLenO-DCE-Nurr1慢病毒载体,用慢病毒转染第三代NSCs,转染72 h后荧光检测转染效果;设置空白对照组、空载体组及DCE-Nurr1组,分别用Western blot及PCR检测Nurr1的表达差异;并将转染后的NSCs分化培养7 d后分别用免疫细胞化学检测、Western blot及PCR检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果慢病毒转染NSCs 72 h后,转染率可达90%,与对照组相比DCE-Nurr1组高表达Nurr1。经慢病毒载体感染后的NSCs仍具备分化潜能,分化培养后发现DCE-Nurr1组分化的神经细胞中TH阳性细胞分化率90.60%,对照组为21.2%。结论慢病毒载体可高效转染NSCs过表达Nurr1;Nurr1基因过表达可以促进中脑腹侧来源NSCs向TH阳性多巴胺能神经元方向分化。     

小分子干扰RNA介导RhoA沉默优化骨髓间充质干细胞的培养

以往骨髓间充质干细胞的培养方法存在衰老和分化率低等问题。 目的：检测是否可以通过沉默RhoA基因的方法优化骨髓间充质干细胞培养。 方法：体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达，分为3组培养：干细胞组(未转染小分子干扰RNA)、经随机打乱顺序的小分子干扰RNA 转染干细胞组、经小分子干扰RNA 转染的干细胞组。用RT-PCR，Western blot检测骨髓间充质干细胞在转染前后RhoA基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、MTT比色法观察细胞生长的优化作用，采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。 结果与结论：与干细胞组、经随机打乱顺序的小分子干扰RNA 转染干细胞组比较，经小分子干扰RNA 转染的干细胞组RhoA基因和蛋白表达量明显降低(P < 0.05)，细胞的生长速度明显增快，细胞周期G0/G1期减少，S期细胞数增多(P < 0.05)。说明通过沉默RhoA基因的方法可以促进骨髓间充质干细胞增殖，优化培养方法。     

反转录病毒介导基质金属蛋白酶特异性组织抑制剂1基因转染骨髓间充质干细胞的成骨能力

背景：间充质干细胞成骨分化早期是成骨性细胞外基质细胞外间质的堆积,其主要成分均是基质金属蛋白酶特异性组织抑制剂1(tissue Inhibitor of Metalloproteinases 1,TIMP-1)作用的基质金属蛋白酶作用底物,通过增加TIMP-1的表达,是否可以抑制基质金属蛋白酶的活性,进而影响间充质干细胞的成骨分化能力？ 目的：观察反转录病毒介导TIMP-1基因转染骨髓间充质干细胞的成骨能力。 方法：设计In-Fusion引物扩增TIMP-1基因片段,与酶切后线性化的pBABE-Puro反转录病毒表达载体进行位点同源重组,构建TIMP-1基因反转录病毒表达载体,RT-PCR和测序验证,并使用GP-293细胞进行包装。通过密度梯度法分离人下颌骨来源骨髓间充质干细胞,流式细胞仪验证其表面标记。将TIMP-1反转录病毒包装液感染骨髓间充质干细胞并筛选稳定表达TIMP-1细胞株,RT-PCR和蛋白电泳验证其表达,并使用成骨诱导液诱导10 d,观察其对成骨能力的影响,RT-PCR验证其成骨相关基因的表达。 结果与结论：经测序证实,RT-PCR所获得的TIMP-1基因 cDNA 序列与NM_003254.2(624 bp)序列完全一致;通过表面标记鉴定证实成功分离了人骨髓间充质干细胞,并具良好的成骨、成脂能力;RT-PCR和Western Blot验证反转录病毒载体成功介导TIMP-1转染骨髓间充质干细胞,RT-PCR表明成骨诱导10 d时,TIMP-1基因感染组成骨增加,RUNX-2和COL1 mRNA表达增加。提示TIMP-1基因可通过反转录病毒成功转染人骨髓间充质干细胞,并能促进其成骨。     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向

背景：在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有显著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果。骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想。 目的：观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成。 材料：清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供。腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增。 方法：胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组。各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100。 主要观察指标：转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色结果,Western blotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达。 结果：与未转染组比较,转染后7,14,21d Ad-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明显增高（P < 0.01）,且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著。Ad-BMP2转染组von Kossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达。Western blotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达。 结论：大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞。     

骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白4/7基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性差异的比较**☆

背景：有文献报道骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)异源二聚体比同源二聚体的活性高，目前国内外尚无BMP-4/7异源二聚体与BMP-4同源二聚体间诱导成骨活性比较的报道。 目的：观察不同基因BMP-4、BMP-4/7对骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨活性的差异，探讨融合基因BMP-4/7的生物学活性。 方法：经脂质体转染分离培养的兔BMSCs，G418筛选出稳定表达株，利用RT-PCR法证明目的基因在BMSCs中的表达情况；以BMP-4和BMP4/7融合基因修饰的AAV载体，转染兔BMSCs，MTT法检测不同基因转染细胞的增殖能力；以BMP-4单基因和BMP-4/7融合基因修饰的AAV载体转染兔BMSCs 7 d后，测定两组细胞内碱性磷酸酶及骨钙素水平，观察成骨活性的变化。 结果与结论：实验成功构建高滴度的分别携带BMP-4单基因、BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒载体AAV-BMP-4、AAV-BMP-4/7；RT-PCR结果证明目的基因能够在BMSCs中得到稳定表达。AAV-BMP-4及AAV-BMP-4/7载体转染效率分别为68.20%、72.18%；转染BMSCs后，细胞增殖能力均明显提高，BMP-4/7融合基因的细胞增殖能力活性高于BMP-4单基因。以BMP-4和BMP-4/7融合基因修饰的AAV转染细胞7 d后，细胞内碱性磷酸酶活性明显上调，骨钙素水平升高，成骨活性均增强；两种基因比较，BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因(P < 0.01)。提示BMP-4、BMP-4/7修饰的AAV载体转染效率高，对BMSCs均有成骨活性，其中BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因。     

慢病毒介导的EphrinB2基因转染大鼠骨髓间充质干细胞表达的实验研究

目的将携带Ephrin B2基因慢病毒转染至骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测其过表达水平及细胞形态学变化,并探讨Eph B4/Ephrin B2是否具有促进大鼠BMSCs体外迁移活性的作用。方法单纯贴壁法分离大鼠BMSCs,倒置显微镜观察细胞生长形态。携带Ephrin B2慢病毒以感染复数3和10感染BMSCs分为低浓度转染组(MOI=3)和高浓度转染组(MOI=10),对照组采用未转染组、阴性转染组,利用q PCR检测Ephrin B2基因表达及Western blot检测Ephrin B2蛋白水平。观察Ephrin B2基因转染后BMSCs形态学变化。15 d后通过免疫荧光检测MAP2表达了解细胞分化。进一步Transwell实验检测细胞迁移能力来了解Eph B4/Ephrin B2在调节干细胞迁移的作用。结果培养BMSCs为多角形或棱形呈漩涡状排列生长。Ephrin B2-BMSCs经q PCR和Western blot检测证实有外源性Ephrin B2表达。Ephrin B2基因转染后BMSCs 24 h,BMSCs胞体开始收缩细胞有突起伸出,72 h后可见典型的神经样细胞形态改变。15 d后,BMSCs分化成为MAP2神经元,与阴性转染组相比,低浓度转染组和高浓度转染组MAP2表达率上升(P0.05)。Transwell实验结果显示:低浓度转染组与高浓度转染组较未转染组及阴性转染组穿膜细胞数量明显增加(P0.05)。结论慢病毒介导Ephrin B2能高效感染BMSCs,并随着时间延长分化成神经样细胞,同时Eph B4/Ephrin B2在调节BMSCs迁移具有重要作用。     

携带增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体感染人脂肪源性干细胞的有效性**☆

背景：细胞移植前,将目的基因转染干细胞可增强细胞治疗效果。但要实现目的基因的高效转移并适度表达,载体系统的选择是关键。 目的：将携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体感染人脂肪源性干细胞,检测病毒感染效率及感染后的细胞活力。 方法：利用脂质体转染法获取慢病毒原液。设定不同感染复数(1,5,10,15,20),将带有增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体感染人脂肪源性干细胞。荧光显微镜下观察病毒转染后人脂肪源性干细胞内增强绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪测定病毒感染效率。茜素红染色及油红O染色鉴定病毒转染后人脂肪源性干细胞的多向分化潜能。MTT法检测转染后人脂肪源性干细胞的增殖情况。 结果与结论：随病毒感染时间及感染复数值的增加,人脂肪源性干细胞内绿色荧光表达明显增强,感染后第3天,感染复数为20时人脂肪源性干细胞内可见明显绿色荧光表达,病毒感染效率为60%;第5~7天,病毒感染效率可达90%~95%。转染后人脂肪源性干细胞经成骨及成脂诱导液培养后,茜素红染色及油红O染色阳性,表明病毒感染未影响人脂肪源性干细胞的多向分化能力。病毒感染后,人脂肪源性干细胞的增殖能力未受明显影响。说明携带增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体可以有效感染人脂肪源性干细胞。     

重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染骨髓间充质干细胞对其成骨分化的影响

背景：在许多情况下,人体组织修复是多因子共同协调作用的结果,因而共表达多基因载体的构建能够满足多因子基因治疗的需要,是近年来基因治疗的新思路。 目的：观察重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的表达及其对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响,为骨缺损的联合基因治疗奠定基础。 方法：使用全骨髓培养法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志抗原的表达;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒经酶切鉴定后,在脂质体介导下将其转入大鼠骨髓间充质干细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测;茜素红染色检测转染后大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。 结果与结论：流式细胞仪检测显示CD90表达强阳性,CD45表达阴性;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,并获得有效共表达;转染后第14天,茜素红染色阳性,能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,为骨缺损的联合基因治疗奠定了基础。     

NGF-β、GFP基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

目的建立神经生长因子β（NGFβ）基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞。方法以质粒pcDNA3-hNGFb、pEGFPN1共转染大鼠胚胎中脑神经干细胞，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）在细胞内的表达，免疫细胞化学、Westernblot鉴定NGF-β在细胞内的表达。体外诱导分化，免疫细胞化学鉴定其分化能力。结果GFP在基因转染12h后开始表达，免疫细胞化学、Westernblot结果表明NGF-β能在细胞中正确表达且NGF-β、GFP基因修饰不影响其增殖与分化。结论成功建立NGF-β、GFP基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞。