一种基于过敏性反应机制的抗植物病毒侵染策略

基于植物的过敏性反应机制,构建了PVY Nib基因和来自于细菌Bacillus amy—loliquefaciens的一类Rnase基因Barnase基因的融合基因的植物表达载体。在此表达载体内两基因的拼接处,保留了原来PVY蛋白酶识别PVYNIb和CP蛋白剪切位点的七肽保守序列。通过农杆菌介导获得此融台基因的转基因烟草植株。病毒侵染试验表明,转基因植物在病毒侵染后,发病症状被改变。少部分转融合基因的植株对病毒侵染表现局部抗性。     

TMV和PVY外壳蛋白双基因融合干涉及烟草转化

为了降低烟草花叶病毒(fobacco mosaic virus,TMV)和马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)复合侵染对烟草带来的危害,本实验找到TMV-CP和PVY-CP基因部分保守序列,将保守序列进行双基因融合,此双基因即为RNAi的靶序列,用限制性内切酶将双基因从pMD18-T载体上切下,正反向连接到pUCCRNAi载体后,经酶切鉴定后定向连接到含超强启动子的pC2300-35S-OCS表达载体上,利用冻融法将此表达载体导入只含辅助质粒的根癌农杆菌中,构建含靶序列反向重复结构的RNAi双元载体系统,提取转化质粒,经酶切验证鉴定表明TMV和PVY外壳蛋白基因植物表达双元载体构建成功.并转化烟草,获得了3株对TMV和PVY抗性显著提高的转基因烟草.     

外源RNA干涉基因在烟草中的转化及表达

依据RNA干涉机制,以TMV复制酶基因为靶标基因,针对TMV 5个株系复制酶基因间高度同源序列设计引物,经RT-PCR反应获得靶序列,构建靶序列反向重复结构的RNA干涉双元载体.用根癌农杆菌介导将外源基因转化至烟草品种K326基因组中,培育RNA干涉转基因烟草.人工接种病毒验证转基因烟草中外源基因在植物抗病毒能力方面的表达效果,实时荧光定量PCR分析转基因烟草抗病毒能力.结果表明,实验培育的RNA干涉转基因烟草67%对TMV呈现高度抗性;荧光定量PCR分析显示,对TMV具高度抗性的转基因烟草中病毒复制酶基因转录产物mRNA存在很大程度的降解,证实了RNA干涉技术在培育抗病毒烟草品种中的效果.     

转小麦冷胁迫蛋白截短基因烟草及其抗病性分析

TA3-13是克隆于小麦冷胁迫蛋白基因的截短片段。原核表达的TA3-13蛋白能够诱导烟草产生显著的抗烟草花叶病毒(TMV)的作用。文章将TA3-13基因片段克隆到植物表达载体pBI121上,构建成转基因重组体pB-3-13,通过冻融法转化农杆菌EHA105,构建成转基因侵染菌株。采用叶盘法将pB-3-13转化三生烟草,经卡那霉素抗性筛选,获得48株T0代再生植株。通过PCR检测,鉴定出33株转基因单株,收获了20株种子作为T1代株系。PCR-Southern杂交结果显示,PCR阳性条带与TA3-13探针有特异性杂交,说明外源基因被转化到烟草的基因组中。选取两个T1代株系的烟草植株用于各项测定。GUS组织化学活性鉴定和RT-PCR检测结果显示,外源基因可以成功地表达。接种TMV病毒后,转基因烟草抗TMV的能力较转空载体烟草提高3～5倍。转基因烟草具有抗TMV侵入和抗病毒病害发展的作用,同时转基因烟草可以抗细菌软腐病菌的扩展。     

毛头鬼伞真菌具有抗烟草花叶病毒活性的y3基因的克隆及对烟草的转化

【目的】蛋白质Y3具有抗烟草花叶病毒(TMV)活性并由y3基因编码。本文的目的是从真菌毛头鬼伞(Coprinus comatus)中克隆y3基因全长并在植物体中展现其对TMV的抑制活性。【方法】我们利用试剂盒5′-Full RACE Core Set(TaKaRa)扩增了y3基因cDNA5′-端未知序列,通过RT-PCR获得了全长序列,并把该全长序列与CaMV 35 S启动子和NOS终止子一起插入多克隆位点(MCS)构建了植物表达载体pCAMBIA1301-y3,用于农杆菌介导的烟草转化。【结果】y3基因全长534碱基对,包含1个开放阅读框(ORF),编码一条含130个氨基酸残基的肽链(GenBank检索号:GQ859168;EMBL:FN546262)。其cDNA序列和由它推到的氨基酸序列均与已发表的y3基因部分片段有高度相似性(94%)。Northern杂交分析证实了y3基因在转基因烟草中得到表达。接种TMV的转基因植株表现出抗TMV的活性。【结论】我们克隆了y3基因全长并得到了转基因植株。在转基因植株中,由于y3基因的表达改善了植株的抗病毒活性。y3基因的克隆和表达无疑为该基因的进一步研究奠定了基础。     

烟草花叶病毒装配起始位点反义RNA表达型中间载体的构建

利用基因工程方法培育抗病毒植物新品种的途径之一,是在植株中建立一个产生病毒基因组功能片段的反义RNA的系统。本工作设计并合成了一段烟草花叶病毒(TMV)装配起始位点反义RNA的基因,再以pBR 325为基本质粒,构建了包含带有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和PolyA信号的反义RNA表达单元,以及为筛选转基因植株所必须的NPT-Ⅱ表达单元的中间载体,为以后经土壤农杆菌而获得转基因烟草植株打下了基础。     

表达黄瓜花叶病毒卫星RNA的转基因烟草耐烟草花叶病毒

表达黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA的转基因烟草可以抗CMV的侵染.为了决定这些植物对其它病毒,如烟草花叶病毒(CMV)的安全性,我们对这些植物接种CMV.结果发现 卫星RNA可减弱TMV引起的症状,井降低病情指数,然而却对TMV在植物中的积累没有明显影响.这一发现有助于对卫星RNA抗病机制的理解,有助于含卫星RNA的生防制剂及表达病毒卫星RNA的转基因植物的应用.本文在国际上首次报道卫星RNA可减弱非相关病毒引起的症状.1 材料和方法1.1 病毒及植物烟草花叶病毒(TMV),烟草G140种子及枯班三生烟种子均为中国科学院微生物研究所病毒室保存;含黄瓜花叶病毒卫星RNA-R1基因的烟草G140(烟Sat-G140)为中国科学院微生物研究所病毒室培育,所用材料为第三代种子.     

表达黄瓜花叶病毒卫星RNA的转基因烟草耐烟草花叶病毒

表达黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA的转基因烟草可以抗CMV的侵染.为了决定这些植物对其它病毒,如烟草花叶病毒(CMV)的安全性,我们对这些植物接种CMV.结果发现 卫星RNA可减弱TMV引起的症状,井降低病情指数,然而却对TMV在植物中的积累没有明显影响.这一发现有助于对卫星RNA抗病机制的理解,有助于含卫星RNA的生防制剂及表达病毒卫星RNA的转基因植物的应用.本文在国际上首次报道卫星RNA可减弱非相关病毒引起的症状.1 材料和方法1.1 病毒及植物烟草花叶病毒(TMV),烟草G140种子及枯班三生烟种子均为中国科学院微生物研究所病毒室保存;含黄瓜花叶病毒卫星RNA-R1基因的烟草G140(烟Sat-G140)为中国科学院微生物研究所病毒室培育,所用材料为第三代种子.     

马铃薯Y病毒HC-Pro中心区域在病毒协生作用中的主导地位

利用PCR方法获得了马铃薯病毒中国株系（PVY－C）HC－Pro基因的5个缺失突变体,构建了相应的植物表达载体。通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化了烟草品种K326(Nicotina tabacum cv.k326)。PCR和Southern blot分析证明了HC－Pro基因及其缺失突变体已整合到烟草基因组中,Western blot表明它们在转基因烟草中得到了表达。侵染性试验发现HC－Pro中心区域介导转基因烟草中PVC－C和黄瓜花叶病毒（CMV）、PVY－C和马铃薯X病毒（PVX）之间的协生作用,从而明确了PVY－C HC－Pro中心区域为病毒协生作用的功能区域。     

马铃薯Y病毒CP基因RNAi载体构建与干涉效果测定

RNA沉默(RNAi)介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略.马铃薯Y病毒(PVY)在世界范围内引起马铃薯、烟草等重要经济作物的病害,并且造成严重的经济损失.本文以PW的外壳蛋白(CP)基因为模板扩增300 bp和354 bp两个片段,正向和反向分别插入植物表达载体pROKⅡ的35S启动子下游,从而构建了以PVY的CP基因为靶标的RNAi植物表达载体pROKY300,转入农杆菌EHA105中,以农杆菌渗入法在本氏烟中瞬时表达与PVY CP同源的hairpin RNA.结果表明,瞬时表达的hairpinRNA有效干涉了PVY侵染.     

马铃薯Y病毒蚜传辅助成分介导PVX/PVY协生作用

构建了马铃薯Y病毒中国株系（PVY－C）蚜传辅助成分（HC－Pro）基因的正义、反义和缺失三种植物表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草品种NC89。Southern blot分析表明,HC－Pro基因及其突变体已经整合到烟草染色体中,Western blot分析证明,正义HC－Pro基因及其缺失突变体在转基因烟草中有表达产物,攻毒试验结果表明,转正义,HC－Pro基因及其缺失突变体不仅能够提高T1转基因烟草中PVY－C的病毒积累和致病,而且对异源病毒PVX具有同样的作用,而转反义HC－Pro基因烟草对PVY－C和PVX的致病性无影响,因此,PVY－C HC－Pro基因介导PVX／PVY的协作作用。     

通过导入病毒基因获得的植物免疫

康奈尔大学生物技术研究所的M.Zaitlin等发现,当把致病病毒的专一性基因序列插入烟草植株时,植物获得了对该病毒病的完全免疫.他们认为,这一试验可在其它植物、甚至动物上进行. 在对烟草花叶病毒(TMV)侵染烟草植株时产生的蛋白的分析中,Zaitlin等发现一段这种TMV基因序列编码一种蛋白,该蛋白在侵染的植株中未出现过.除研究抗病方法的目的外,更主要是出于科学探索的目的,Zaitlin等决定利用土壤杆菌介导的转化系统,用上     

Biosource公司用植物生产疫苗获得成功

Biosource Technologies公司和马里兰州贝塞斯达纳瓦尔医学研究所的研究人员协作研究,获得了位于重组烟草花叶烟草花叶病毒组(TMV)表面的疟疾表位。他们用遗传工程方法,使疟疾序列在TMV外壳蛋白内表达。将筛选的B-细胞疟疾表位插入TMV外壳蛋白表面环状区或与其C-末端融合。用任意一种形式的这种修饰过的病毒侵染烟草植株时,都产生高浓度外壳蛋白。Thomas Turpen及其同事认为,重组植物病毒有可能满足大规模及有经济效益地生产亚基疫苗(易于贮藏及管理)的需要。一般情况     

植物遗传工程

920268抗病毒植物的遗传工程〔英〕/Godoni,F一ZAreh.Virol一2990,115(i一2)一i~22〔译 自DBA,1991,10(9),91一05050] 讨论的主要内容包括:用于交叉保护的外壳蛋 白序列对植物的转化,表达病毒外壳蛋白的转基因植物的田间试验,抗病毒侵染的反义RNA技术,病毒卫星RNA在植物中的表达,ribozyme和锤头RNA机制,作为受体专性抗病毒荆的抗个体基因型的抗体;人干扰素基因在转基因植物中的克隆和表达。构建了抗下列病毒的转基因植物,烟草花叶病毒、首藉花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒等。外壳蛋白介导的保护是最广泛采用的…     

黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒在双抗转基因线辣椒内的增殖

本试验以转化CMV-CP和TMV-CP基因的转基因线辣椒纯合系植株作为研究试材,比较了单独 或混合接种CMV和TMV后,转化线辣椒的抗病性表达特点,并测定了两种病毒在植株体内的病 毒含量.结果表明转化线辣椒不仅能抵抗CMV和TMV的单独侵染,而且还能抵抗CMV和TMV的 复合侵染.转化线辣椒表现为系统症状延迟出现7-15d,显症株率和病害严重度级别大幅度降低, CMV和TMV在接种叶、新生叶中的病毒含量明显减低.转基因线辣椒原生质体作为研究试材接 种CMV,测定病毒含量结果表明CMV病毒的增殖在转基因线辣椒原生质体内受到明显抑制. 在CMV接种浓度为40μg/mL,感染原生质体48h后,CP(-)植株原生质体内CMV是CP(+)的4.2倍 .这一结果揭示了转基因线辣椒具有抑制病毒增殖的抗病性.     

巴西橡胶树HbWRKY1基因的克隆及转化烟草的初步研究

利用RACE结合RT-PCR技术,从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)总RNA中扩增得到长度为1234 bp的WRKY基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对,该序列推导的氨基酸序列与蓖麻、白杨的WRKY同源性分别为79%和73%,表明分离的cDNA序列为橡胶树WRKY基因,命名为HbWRKY1。通过构建pCAMBIA1304-HbWRKY1植物表达载体,经农杆菌GV3101介导,将HbWRKY1基因导入烟草(Nicotiana tabacum)中,对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR鉴定。结果表明,HbWRKY1基因已整合到65株转基因植株中。干旱胁迫试验表明,HbWRKY1的过量表达可以明显提高转基因烟草对干旱胁迫的耐受能力。这说明WRKY基因与橡胶树抗旱能力之间存在一定的关系。     

激发子基因peaT1转化三生烟及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有激发子基因peaT1的植物表达载体pCAM-BIA2300-G4AS-peaT1转化三生烟,获得了转基因烟草植株。用PCR检测确认了阳性转化株,用Southern杂交、RT-PCR和Western杂交进一步证实了peaT1基因的整合、转录和表达。对T1代转基因阳性株进行TMV接种试验,结果显示,与非转基因对照相比,表达peaT1的烟草叶片枯斑数量减少,表明蛋白激发子基因peaT1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

秋茄KcRD22基因的克隆与功能分析

本文以用200 mmol/L NaCl处理24 h后的秋茄幼苗为材料提取秋茄叶片总RNA,利用RT-PCR方法克隆获得KcRD22基因的全长cDNA,通过构建pCAMBIA-2300-KcRD22过表达载体,利用农杆菌侵染的方式获得过表达KcRD22的烟草转基因株系,并对转基因株系的耐盐性做出初步分析.实验结果显示:KcRD22基因的ORF长1 131 bp,编码1个等电点为9.07、分子量为39.8 kD、由375个氨基酸组成的蛋白.PCR及RT-PCR鉴定结果表明,KcRD22基因已经分别整合到8株烟草的染色体中,并在两个株系中获得表达.对转基因烟草进行光合作用测定,结果显示100 mmol/L NaCl处理显著降低了野生型烟草的净光合速率,而转基因植株叶片的光合作用受到的影响较小.盐浓度达到200 mmol/L时,转基因植株及野生型烟草净光合速率都明显降低,但盐胁迫解除后,转基因烟草光合作用的恢复情况明显好于野生型烟草,说明KcRD22的过表达提高了烟草的抗盐性.本文初步确定了KcRD22基因对植物耐盐性的贡献,这为进一步深入研究该基因在耐盐机制中的功能奠定了良好基础.     

CMV抑制PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性

以前曾报道用RNA介导的抗病毒策略,获得了高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVY^N CP)的转基因烟草,并对T1、T2代转基因植株进行了遗传和抗病性分析。此次以T,代转基因植株为试验材料,在筛选高度抗病植株并证明其抗病性是基于转基因沉默的基础上,采用Northern杂交的方法,证明CMV侵染抑制了转基因植株中PVY^N CP基因的沉默,而且CMV对PVY^N CP基因沉默的抑制部位是发生在接种后的新生叶上,接种叶及其下部叶片中PVY^N CP基因沉默则未受到影响。采用ELISA方法对CMV PVY^N复合接种的转基因植株进行PVY^N检测,结果表明,接种叶及下部叶没有检测到PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为抗病。而在CMV接种后植株新生叶中则检测出了高滴度的PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为感病。该文报道了在表达PVY^N CP基因的RNA介导抗性转基因植株中,异源病毒侵染抑制了转基因的沉默,并导致转基因植株的抗病性丧失。