IL35慢病毒质粒的提取

[目的]构建可以大规模提取IL35的新型质粒p LVX-IRES-Zs Green1-mus-IL35。[方法]质粒p LVX-IRES-Zs Green1和p UC57-mus-IL35-拼接用XhoⅠ和NotⅠ进行双酶切,将回收纯化的目的片段mus-IL35-拼接(NotⅠ/XhoⅠ)与回收纯化的载体p LVX-IRES-Zs Green1(NotⅠ/XhoⅠ)连接,连接产物命名为p LVX-IRES-Zs Green1-mus-IL35-拼接。连接产物转化DH5α感受态细胞,涂布LB Amp平板,37℃温箱培养过夜。[结果]检测慢病毒p LVX-IL35滴度为:6×10~7TU/ml,提取质粒浓度为1～2 mg/ml。鉴定引物为测序的通用引物,上游引物和下游引物离MCS区域加上目的序列,目的PCR条带大约1 600 bp,送鉴定正确菌液测序。测序结果比对正确。[结论]采用新型超量无内毒素质粒提试剂盒,可以大规模方便快速提取相关质粒。     

巢式PCR克隆猪T细胞表面抑制性受体PD-1全长基因

为了获得猪T细胞表面抑制性受体PD-1的全长基因,本研究根据猪T细胞表面抑制性受体PD-1的c DNA序列,设计合成2对引物P1/P2、P3/P4,并在P1和P2的5'端分别引入Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点。应用巢式PCR技术从感染猪瘟病毒(CSFV)石门株的猪外周血单个核细胞中,扩增获得了大小为866 bp的基因片段。将扩增的目的基因回收、纯化,克隆至p MD-18 T克隆载体,转化宿主菌DH5α。菌液PCR和质粒PCR选择可疑阳性重克隆质粒,抽提质粒,然后用Eco RⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定,最后进行基因序列测定。结果表明,成功构建猪PD-1全长基因的重组质粒(p MD-PD1)。     

幽门螺杆菌STM文库重组质粒的构建

目的:应用信号标签突变技术(Signature tagged mutagenesis,STM)构建幽门螺杆菌突变体文库重组质粒。方法:采用平末端内切酶随机酶切幽门螺杆菌基因组DNA,并回收300～500bp片段(记作Fr),基因重组技术构建重组质粒pID700-Fr,电转化E.coliDH5α筛选阳性克隆,提取重组质粒酶切鉴定。结果:成功构建了1200个幽门螺杆菌STM文库重组质粒。结论:STM技术可用于幽门螺杆菌致病以及耐药相关基因的筛选,为幽门螺杆菌致病及耐药机理的研究奠定了基础。也将为幽门螺杆菌的治疗提供新的药物靶点。     

非洲爪蛙prmt5.L基因的克隆及时空表达谱分析

[目的]克隆非洲爪蛙prmt5. L基因并分析其在胚胎发育中的时空表达谱。[方法]收集胚胎,提取总RNA,反转录制备c DNA。设计特异引物,PCR扩增prmt5. L基因的ORF序列,连接到p CS2+载体构建p CS2+prmt5. L重组质粒,连接位点为EcoRⅠ和XhoⅠ。经双酶切和测序验证成功构建p CS2+prmt5. L重组质粒。将p CS2+prmt5. L重组质粒用EcoRⅠ酶切,T7 RNA聚合酶转录获得prmt5. L的反义探针。收集不同时期的爪蛙胚胎,固定并脱水后经原位杂交检测prmt5. L在胚胎发育中的表达情况。通过序列比对和进化树分析PRMT5在进化中的保守性。[结果]成功克隆非洲爪蛙prmt5. L基因,原位杂交检测了prmt5. L在早期胚胎中的时空表达谱。序列比对和进化树发现prmt5. L蛋白在进化中非常保守。[结论]成功构建了p CS2+prmt5. L重组质粒。prmt5. L基因在胚胎发育中呈现动态表达且prmt5. L蛋白在进化中非常保守。     

重叠延伸PCR法合成栀子两个糖基转移酶基因

[目的]糖基转移酶UGT94E5和UGT75L6催化栀子果实中西红花总苷生物合成途径的末端步骤。该研究利用重叠延伸PCR法,合成编码这两个酶的基因序列。[方法]首先将基因分段,每段两端均加上p UC57载体的多克隆位点作为接头,拼接成800 bp以下的片段,再输入到DNAWorks软件中,获得最优寡核苷酸片段组合;将合成的寡核苷酸片段混合,用作模板,进行两次PCR扩增,获得加了接头的各段序列,亚克隆到自制的p UC57 T载体上。酶切后回收插入片段,混合,用作模板,扩增全长基因,产物克隆到自制的p UC57 T载体上。[结果]成功合成了栀子Gj UGT9(编码UGT94E5)和Gj UGT1(编码UGT75L6)基因,分别长1 496 bp和1 583 bp。[结论]重叠延伸PCR法能够有效地合成栀子两个糖基转移酶基因序列,为遗传操作奠定了基础。     

幽门螺杆菌Dps蛋白的表达、纯化及活性测定

[目的]表达及纯化重组幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) Dps(DNA protection during starvation)蛋白并测定其活性。[方法]依照Dps蛋白的基因序列,设计PCR引物,并以幽门螺杆菌基因组DNA为模板扩增Dps基因。将扩增产物回收后连接到p ET15b然后转化大肠杆菌,涂布在抗性平板,37℃过夜培养,然后使用PCR和测序验证阳性菌落。使用IPTG诱导重组Dps蛋白表达,并通过Ni~(2+)亲和层析纯化。测试Dps蛋白的亚铁氧化酶活性和抗氧化功能。[结果]通过PCR获得全长为438 bp的Dps基因,成功构建重组质粒p ET15b-Dps,它能编码分子量为18. 9 k Da的重组Dps蛋白。使用IPTG诱导目的蛋白表达,然后纯化得到Dps蛋白。Dps蛋白能够快速催化亚铁离子生成铁离子。与对照BSA蛋白相比,Dps蛋白具有较强的抑制氧自由基生成的活性。[结论]构建了重组质粒p ET15b-Dps,纯化获得Dps蛋白并测定了其亚铁氧化酶活性和抗氧化活性。     

小鼠IL-39的克隆及真核表达载体的构建北大核心

[目的]构建小鼠白介素(interleukin,IL)-39单链融合基因及其真核表达载体。[方法]通过RT-PCR得到小鼠EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)及IL-23p19基因的全长编码区。通过重叠延伸PCR和编码疏水性多肽接头(linker)(Gly4Ser)3的DNA序列将小鼠EBI3全长编码区及IL-23p19成熟肽编码区连接起来,构建小鼠IL-39单链融合基因,并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5-His中,通过限制性内切酶双酶切及基因测序鉴定阳性重组载体。[结果]通过重叠延伸PCR得到1 254 bp大小的目的条带,测序分析显示,小鼠IL-39单链融合基因中EBI3、linker和IL-23p19的基因序列及连接顺序和方向均完全正确。[结论]成功构建了小鼠IL-39单链融合基因及其真核表达载体。     

小鼠IL-39的克隆及真核表达载体的构建

[目的]构建小鼠白介素(interleukin,IL)-39单链融合基因及其真核表达载体。[方法]通过RT-PCR得到小鼠EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)及IL-23p19基因的全长编码区。通过重叠延伸PCR和编码疏水性多肽接头(linker)(Gly4Ser)3的DNA序列将小鼠EBI3全长编码区及IL-23p19成熟肽编码区连接起来,构建小鼠IL-39单链融合基因,并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5-His中,通过限制性内切酶双酶切及基因测序鉴定阳性重组载体。[结果]通过重叠延伸PCR得到1 254 bp大小的目的条带,测序分析显示,小鼠IL-39单链融合基因中EBI3、linker和IL-23p19的基因序列及连接顺序和方向均完全正确。[结论]成功构建了小鼠IL-39单链融合基因及其真核表达载体。     

胰高血糖素样肽-1融合蛋白在原核系统中的表达

[目的]构建点突变的GLP-1Gly8,并与人血清白蛋白(HSA)结构域Ⅰ融合,延长GLP-1的半衰期。[方法]采用常规PCR扩增白蛋白结构域Ⅰ片段,利用SOE-PCR扩GLP-1Gly8基因并将两个基因拼接,得到的HSA-GLP-1Gly8融合基因经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到p ET30a表达载体,重组质粒p ET30a-HSA-GLP-1Gly8转入E.coli BL21(DE3)宿主菌中进行IPTG诱导表达。[结果]PCR扩增分别获得140 bp的GLP-1Gly8基因499 bp的HSA的片段及经融合后的HSA-GLP-1Gly8基因。表达载体p ET30a-HSA-GLP-1Gly8在E.coli BL21(DE3)宿主菌中经IPTG诱导,过表达了分子量约为22 k Da的融合蛋白。[结论]成功构建了p ET30a-HSA-GLP-1Gly8原核表达载体,融合蛋白在BL21(DE3)菌中以包涵体的形式过表达。     

HSV-tk基因逆转录病毒重组体的构建与DNA序列分析

目的　构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (HSV1 tk)基因的逆转录病毒重组载体pLXSN TK。方法设计一对寡核苷酸引物 ,用PCR方法从质粒pHSV10 6中特异扩增HSV tk基因片段 ( 1168bp) ,分别用BamHI和Eco RI酶切后 ,定向连接到质粒pLXSN中 ,转化宿主菌TG1,分别用上述内切酶 ,PCR和DNA测序鉴定重组质粒。结果　酶切鉴定所切下的片段和PCR扩增的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论　成功构建了HSV tk嵌合重组质粒pLXSN TK。     

共表达ETEC K99、GFP重组大肠杆菌的构建及表达

[目的]构建K99、GFP基因重组质粒并在大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中表达。[方法]利用PCR扩增技术扩增K99基因和GFP基因,经连接和转化将目的片段克隆到pLA载体上,利用双酶切技术及PCR技术对重组质粒进行鉴定并测序分析,利用Western Blot技术分析蛋白质表达情况。[结果]测序分析结果表明,基因具有正确的阅读框;双酶切和PCR鉴定得到498 bp和720 bp的特异性条带;荧光检测表明重组菌表达了蛋白;Western Blot结果表明重组菌表达为融合蛋白。[结论]成功构建了大肠重组菌,并表达外源融合蛋白。     

用于筛查转基因作物成分的质粒标准分子的研制

为弥补传统标准物质的缺乏,构建了一种可用于筛查转基因作物成分的质粒标准分子。首先,通过PCR扩增获得454 bp的RBCL基因、236 bp的CaMV35S启动子以及200 bp的NOS终止子目的片段,经两次重叠延伸PCR扩增将上述3个片段连接成849 bp的重组子。随后,将该重组子克隆至pMD18-T载体,经PCR扩增、测序分析后成功获得阳性重组质粒pMD-RBCL-CaMV35S-NOS。进一步的替代性研究显示,该重组质粒DNA与标准物质基因组DNA的检测分析结果一致。因此,该重组质粒标准分子可作为阳性标准物质用于转基因作物成分的初步筛查检测。     

共表达ETEC K99、GFP重组大肠杆菌的构建及表达北大核心

[目的]构建K99、GFP基因重组质粒并在大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中表达。[方法]利用PCR扩增技术扩增K99基因和GFP基因,经连接和转化将目的片段克隆到pLA载体上,利用双酶切技术及PCR技术对重组质粒进行鉴定并测序分析,利用Western Blot技术分析蛋白质表达情况。[结果]测序分析结果表明,基因具有正确的阅读框;双酶切和PCR鉴定得到498 bp和720 bp的特异性条带;荧光检测表明重组菌表达了蛋白;Western Blot结果表明重组菌表达为融合蛋白。[结论]成功构建了大肠重组菌,并表达外源融合蛋白。     

铁蛋白重链亚铁氧化酶活性突变体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)亚铁氧化酶活性突变基因的真核表达载体。[方法]针对小鼠FTH基因的亚铁氧化酶活性关键位点(K86、E62和H65),设计并合成6条PCR引物。利用重叠延伸PCR技术,获得小鼠FTH基因的突变体m FTH(K86Q、E62K和H65G),简写为m FTH(3M)。然后将m FTH(3M)插入到实验室已有的C端带Flag标签的真核表达载体pc DNA3中,插入位置为多克隆位点区域中限制性内切酶Bam HⅠ和HindⅢ之间,从而得到亚铁氧化酶活性缺失的FTH真核表达载体pc DNA3-m FTH(3M)-Flag。重组质粒经酶切和测序鉴定正确后,用脂质体lipofectamineTM2000将其转染到RAW264.7细胞中,检测细胞中带有Flag标签的m FTH(3M)蛋白的表达。[结果]重组质粒酶切得到预期片段,测序显示所构建的m FTH(3M)真核表达载体序列正确,细胞内检测到带Flag标签的m FTH(3M)蛋白信号的强烈表达。[结论]实验成功构建了小鼠FTH亚铁氧化酶活性位点基因突变的真核表达载体pc DNA3-m FTH(3M)-Flag。     

人Tudor-SN基因启动子荧光素酶报告基因表达质粒的构建及活性检测

目的 将人类Tudor-SN基因的启动子序列片段定向连入pGL3-Basic质粒载体,并进行鉴定和启动子活性检测.方法 以HeLa细胞全基因组DNA为模板,PCR法扩增出目的基因,利用XhoⅠ和HindⅢ双酶切法将目的片段连接到pGL3-Basic载体上.再将构建成功的pGL3-Basic-Tudor-SN-promoter重组质粒和内参质粒β-gal瞬时共转染入宫颈癌HeLa细胞,培养48 h后检测萤火虫荧光素酶活性.结果 双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,转染重组质粒后可检测到萤火虫荧光素酶活性.结论 成功构建了人类Tudor-SN基因启动子重组质粒,为Tudor-SN蛋白基因调控机制的研究奠定基础.     

小鼠白细胞介素4基因的化学合成、克隆与表达

利用381A型DNA合成仪,分29个寡聚核苷酸片段化学合成了小鼠IL-4全基因,共442bp。以pUC12质粒作为载体,将所有合成片段分前后两组进行磷酸化、退火、连接和克隆,经过菌落原位杂交、酶切鉴定和质粒DNA序列分析,分别得到了含有小鼠IL-4前后两半基因片段的两种重组质粒,回收前半基因片段,插入到含有后半基因重组质粒的EcoRI和PstI酶切位点之间,成功地得到了含有小鼠IL-4全基因的重组质粒pFR101。将全合成基因插入到质粒pSM53中,得表达质粒pFR105,转化大肠杆菌TAP106,根据IL-4对CTLL细胞的作用,肯定了TAP106(pFR105)细菌中有小鼠IL-4活性蛋白的表达。     

SUSD2基因真核表达载体构建及其在H322细胞中表达

[目的]构建SUSD2基因真核表达载体,并观察其在真核细胞H322细胞中的表达。[方法]从H322细胞中提取总RNA并逆转录为c DNA,采用PCR技术扩增出含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的人SUSD2基因片段,以质粒pc DNA3.1为表达载体,构建重组质粒pc DNA3.1-SUSD2。采用PCR、双酶切鉴定以及测序验证c DNA片段大小和序列正确。将重组载体pc DNA3.1-SUSD2转染H322细胞,Western Blot法检测SUSD2蛋白的表达。[结果]PCR、双酶切鉴定以及测序结果显示pc DNA3.1-SUSD2包含大小、序列正确的SUSD2片段;Western Blot结果显示SUSD2蛋白在转染pc DNA3.1-SUSD2的H322细胞中表达高于转染pc DNA3.1的H322细胞。[结论]成功获得SUSD2基因全长序列,并成功构建SUSD2基因真核表达载体,有效地在非小细胞肺癌细胞株H322中表达,为进一步研究该基因功能及机制奠定了基础。     

用重叠PCR合成植物甜蛋白brazzein基因

目的:为在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中进行表达,采用重叠PCR合成了植物甜蛋白brazzein基因。方法:根据非洲热带植物Pentadiplandra brazzeana产生的天然甜蛋白brazzein的氨基酸序列及泡盛曲霉糖化酶基因glaA的密码子偏爱性,设计并化学合成了2对3’-端互补的寡聚核苷酸,通过PCR延伸获得2条末端有部分重叠的双链核苷酸片段,再通过重叠PCR扩增,合成了用于泡盛曲霉表达的植物甜蛋白brazzein基因。结果:将brazzein基因克隆到pMD18-T载体,随机挑取6个重组质粒测序,结果1个重组质粒有连续4个碱基缺失,3个重组质粒各有1个碱基缺失,2个重组质粒携带的brazzein基因核苷酸序列完全正确。结论:合成的brazzein基因大小162 bp,编码54个氨基酸,推断的氨基酸序列与Pentadiplandra brazzeana产生的天然brazzein完全一致,表明植物甜蛋白brazzein基因成功合成。     

瞬时外向钾通道Kv4.3真核表达载体的构建

[目的]构建Kv4.3真核表达载体,观察其在真核细胞中表达情况。[方法]提取小鼠前额叶皮质RNA,通过RT-PCR和常规PCR技术扩增获得Kv4.3目的基因,利用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性内切酶和T4 DNA连接酶将其克隆在pcDNA3.1载体中,并将构建好的重组质粒转染至HEK293细胞中,免疫印迹方法检测Kv4.3蛋白表达。[结果]成功扩增了Kv4.3基因(2 000 bp处有明显条带),先后经酶切和酶连后的重组体转化培养,提取质粒,再通过双酶切观察到2 000 bp处有Kv4.3目的条带和5 400 bp处有pcDNA3.1载体条带。将此重组质粒送去测序,结果显示基因测序结果与GenBank中Kv4.3序列一致。免疫印迹结果发现在HEK293细胞中,转染的重组质粒能够表达Kv4.3蛋白。[结论]成功构建了Kv4.3真核表达载体,其在HEK293细胞中可以稳定表达。     

类泛素蛋白FAT10对人肾上皮细胞α-烯醇酶共价修饰的初步研究

目的:构建带Flag标签的α-烯醇酶(ENO1)基因以及带Myc标签的人白细胞抗原F相关转录物10(FAT10)基因的真核表达质粒载体,鉴定ENO1和FAT10在人肾上皮细胞株HEK293中的表达,检测类泛素蛋白FAT10是否共价修饰ENO1。方法:以人宫颈癌细胞系He La的c DNA为模板进行PCR,得到eno1目的片段,与分别经EcoRⅤ和SalⅠ酶切的pFlag-CMV载体连接得到重组质粒pFlag-CMV-eno1并进行鉴定测序;以人脑组织c DNA文库为模板进行PCR,得到fat10目的片段,与分别经Eco RⅠ和XhoⅠ酶切的p CMV-Myc载体连接得到重组质粒p CMV-Myc-fat10并进行鉴定并测序。将重组质粒用脂质体法转染HEK293细胞,用Western印迹检测ENO1和FAT10蛋白的表达。将重组质粒共转染HEK293细胞,用免疫共沉淀检测FAT10对ENO1的修饰情况。结果:重组克隆载体内的eno1和fat10序列与Gen Bank报告的序列完全一致;转染HEK293细胞后,ENO1和FAT10蛋白过表达;FAT10能够共价修饰ENO1。结论:类泛素蛋白FAT10共价修饰ENO1,为肿瘤的发生、发展及迁移的研究提供了新的研究思路。