重组人血管内皮生长因子165腺病毒载体的构建与鉴定

目的 探讨构建携带人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的重组腺病毒载体,为进一步的基因转染构建组织工程骨的血管化提供实验基础.方法 采用RT-PCR扩增的方法获得人源性的hVEGF165,并克隆入穿梭质粒pAdTraek CMV.构建的质粒pAdTrack CMV-VEGF165经酶切及测序鉴定正确后,通过pAdeasy 1质粒的介导与腺病毒包装质粒pAdTrack CMV.VEGF165共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后获得携带人VEGF的重组腺病毒pAdTrack CMV.VEGF165.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,测定病毒滴度.结果 PCR鉴定证实重组腺病毒含有人VEGF,病毒滴度为0.5×10"pfu/ml.结论 成功构建的携带人VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,为基因治疗构建组织工程骨血管化的研究奠定基础.     

人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体的构建及鉴定

背景:内部核糖体进入位点序列载体能将上下游基因共同转录,故通过此载体可使连接在一起的人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2同时高表达,可为骨缺损的治疗提供新方法.目的:实验通过引入内部核糖体进入位点序列,采用基于attLXattR的λ噬茵体位点特异性重组系统的GatewayTM技术构建带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应方法扩增人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2目的基因,将两个基因亚克隆至pIRES2-EGFP载体中,构建phBMP2-IRES-hFGF2载体,通过BP反应将hBMP2-IRES-hFGF2重组到载体pDONR221中,再通过LR反应将其转移到腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST中,线性化后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒Ad-hBMP2-IRES-hFGF2.结果与结论:phBMP2-IRES-hFGF2经酶切及测序鉴定正确,带hBMP2-IRES-hFGF2的载体在293细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,病毒滴度为2.82×1010 ifu/mL,证实成功构建了带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体.     

重组人骨形态发生蛋白2腺病毒载体的构建与鉴定

背景:目前报道的重组腺病毒构建方法较复杂,构建周期长,导致重组腺病毒构建的成功率较低.GatewayTM技术是基于λ噬菌体的位点特异性高效重组系统,其构建重组病毒载体具有快捷高效的特点.目的:构建含人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体,为应用骨形态发生蛋白2基因治疗的研究奠定基础.设计、时间及地点:单一样本规察,实验于2008-02/06在深圳市第二人民医院中心实验室完成.材料:pOTB7-BMP-2质粒、HEK293为ATTC产品;BLOCK-iTTMAdenovirus Expression System为Invitrogen产品;大肠杆菌DH5 α为Biontex产品.方法:用聚合酶链反应方法扩增骨形态发生蛋白2目的基因,并插入载体pMD19-T Simple Vector中进行测序分析.将骨形态发生蛋白2基因亚克降到穿梭载体pEC3.1(+)中,构建pEC3.1-BMP-2穿梭质粒,再将其中的表达盒通过重组克隆到pAd/BLOCK-iTTM-DEST腺病毒载体中,线性化后转293细胞进行包装获得重组腺病毒rAd-BMP2.主要观察指标:①目的基因骨形态发生蛋白2的聚合酶链反应扩增.②重组质粒TS-BMP2的构建.⑨重组pEC3.1-BMP2的构建.④重组pAd-BMP2的构建.⑤重组腺病毒的制备与鉴定.结果:正确扩增长约1.2 kb的骨形态发生蛋白2 cDNA,并成功地构建其腺病毒载体,经线性化的pAd-BMP2 DNA转染HEK293细胞,包装、扩增后得到入骨形态发生蛋白2重组腺病毒(rAd-BMP2),其滴度约为1×1010PFU/mL,该滴度可满足进一步的骨形态发生蛋白2成骨作用的研究.结论:成功地构建重组人骨形态发生蛋白2腺病毒载体.     

新型骨形态发生蛋白2反转录病毒载体的构建及活性检测

背景:骨形态发生蛋白是一种具有潜在活性的蛋白质,当骨组织损伤时其迅速增加并活性的增强,与载体复合能修复动物骨缺损,但将其用做基因治疗的研究未见报道.目的:构建表达重组人骨形态发生蛋白2基因的重组反转录病毒载体,探讨其在成骨细胞中的生物学作用.方法:根据Genbank中人骨形态发生蛋白2基因序列设计并合成骨形态发生蛋白2特异性引物,高保真PCR扩增骨形态发生蛋白2基因,同源重组法将骨形态发生蛋白2 PCR片段连接与克隆载体pDNR-CMV,构成pDNR-CMV-BMP2,经酶切、PCR和测序鉴定后,将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和反转录病毒空质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组,构成反转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2,转染入包装细胞PT67进行病毒包装,并用NIH3T3细胞进行病毒滴度测定;将反转录病毒感染人成骨细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长变化,转染48 h后Western blotting检测骨形态发生蛋白2蛋白表达.结果与结论:pDNR-CMV-BMP2质粒Sall和EcoRI双酶切、PCR及测序结果均正确,重组质粒pLP-LNCX-BMP2经氯霉素及蔗糖筛选得到的阳性克隆骨形态发生蛋白2 PCR结果阳性,酶切产物与预期相一致;病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后,G418筛选可得到稳定细胞克隆,其上清液中病毒滴度可达到5×10~8pfu;四甲基偶氮唑盐检测中反转录病毒组与正常对照组相比,72 h细胞抑制率无明显差别(P＞0.05),转染48 h后Western blotting可见骨形态发生蛋白2蛋白高表达.结果说明,实验成功克隆了骨形态发生蛋白2基因并构建其反转录病毒表达载体.     

含人Apelin-R重组腺病毒载体pDC316-apelinR-EGFP的构建

目的 构建含有人Apelin受体(Apelin-R)基因的pDC316-apelinR-EGFP腺病毒穿梭载体,为糖尿病相关基因Apelin的体内研究提供新方法.方法 PCR方法分别扩增Apelin-R基因,测序正确后与载体pDC316-EGFP连接,构建重组腺病毒载体pDC316-apelinR-EGFP;脂质体法与腺病毒骨架载体共转染HEK293细胞进行重组腺病毒包装,稀释法测定腺病毒滴度.RT-PCR和Western blot方法检测Apelin-R的表达.结果 限制性核酸内切酶鉴定及测序结果均证明Apelin-R基因成功扩增并克隆到重组腺病毒载体pDC316-apelinR-EGFP.在HEK293中成功包装出含Apelin-R的腺病毒Ad-apelinR-EGFP,病毒滴度为3.1×109 TCID50/ml,感染Ad-apelinR-EGFP的HEK293E细胞中可检测到Apelin-R的mRNA和蛋白表达.结论 成功构建了真核表达载体pDC316-apelinR-EGFP,得到了表达绿色荧光蛋白的Apelin-R腺病毒,该病毒有望用于糖尿病的体内研究实验.     

人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的构建及鉴定

目的:采用多聚酶链反应及酶切鉴定,拟构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体,以便利用局部基因治疗方法进一步在体内获得重组人骨形态发生蛋白7。方法:实验于2004-05/2005-10在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所完成。含人骨形态发生蛋白7基因全长cDNA质粒pUC118.BMP-7由第一作者构建并保存。将人骨形态发生蛋白7基因克隆至pcDNA3.1/CT-GFP质粒中,酶切回收的BMP-7/GFP基因片段,克隆入pAxCAwt腺病毒载体后,共转染大肠杆菌LE393,获得腺病毒重组质粒,大量扩增后转入293细胞包装,获得重组腺病毒。用病毒上清液感染293细胞及Hela细胞,293细胞受病毒感染而Hela细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判定为重组腺病毒株。结果:①骨形态发生蛋白7基因的获得:KpnI及XbaI双酶切、琼脂凝胶电泳检测可见2条带,略小于500bp的条带是长度为430bp的骨形态发生蛋白7基因,略大于2500bp的条带是长度约为2600bp的pUC118。②重组质粒pcDNA3.1BMP-7/GFP的构建:所挑选的5个转化子均可见略大于1000bp的条带,全部为阳性克隆。③重组粘粒pAxCAwT.BMP-7.GFP的构建:所挑选的5个转化子中2个可见大于1000bp的条带,为正向插入的阳性克隆。结论:多聚酶链反应及酶切鉴定证明骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的成功构建,并包装出重组腺病毒,为骨损伤疾病进行原位组织工程修复奠定基础。     

人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的构建及鉴定

目的：采用多聚酶链反应及酶切鉴定，拟构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体，以便利用局部基因治疗方法进一步在体内获得重组人骨形态发生蛋白7。 方法：实验于2004-05／2005-10在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所完成。含人骨形态发生蛋白7基因全长cDNA质粒pUC118．BMP-7由第一作者构建并保存。将人骨形态发生蛋白7基因克隆至pcDNA3．1／CT-GFP质粒中。酶切回收的BMP-7／GFP基因片段，克隆人pAxCAwt腺病毒载体后，共转染大肠杆菌LE393，获得腺病毒重组质粒，大量扩增后转入293细胞包装，获得重组腺病毒。用病毒上清液感染293细胞及Hela细胞，293细胞受病毒感染而Hela细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判定为重组腺病毒株。 结果：①骨形态发生蛋白7基因的获得：KpnI及XbaI双酶切、琼脂凝胶电泳检测可见2条带，略小于500bp的条带是长度为430bp的骨形态发生蛋白7基因，略大于2500bp的条带是长度约为2600bp的pUC118。②重组质粒pcDNA3．1BMP-7／GFP的构建：所挑选的5个转化子均可见略大于1000bp的条带，全部为阳性克隆。③重组粘粒pAxCAwT．BMP-7．GFP的构建：所挑选的5个转化子中2个可见大于1000bp的条带，为正向插入的阳性克隆。 结论：多聚酶链反应及酶切鉴定证明骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的成功构建，并包装出重组腺病毒，为骨损伤疾病进行原位组织工程修复奠定基础。     

重组腺病毒载体Ad5-hTRX-EGFP的构建及其表达

本研究旨在构建并制备人硫氧还蛋白(hTRX)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因腺病毒载体Ad-hTRX-EGFP,感染HEK293细胞,为基因治疗提供实验基础。设计含有NotⅠ和EcoRⅤ酶切位点的引物,PCR扩增hTRX,将扩增产物连接到带有EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP,利用Lipofectamine2000脂质体的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHG lox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-hTRX-EGFP,并在其中包装扩增病毒,用氯化铯高速梯度离心、纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用流式细胞仪测定感染HEK293细胞的效率,Western blot方法验证细胞表达hTRX蛋白。结果显示,重组腺病毒质粒经PCR和NotⅠ、EcoRⅤ酶切鉴定,证实含有hTRX基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5.558×1010pfu/ml。病毒成功感染HEK293细胞,MOI=100时,感染效率达92.25%。经Western blot方法验证表明,感染后的HEK293细胞高表达hTRX蛋白。结论:应用细胞内同源重组方法成功构建了含hTRX基因的重组腺病毒载体,制备获得高滴度的病毒,能高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白,为后续研究奠定了基础。     

人源性Notch-1胞内段腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建携带人Notch-1胞内区基因的腺病毒栽体(Ad-GFP-NICD),观察其在真核细胞中的表达.方法:通过PCR从pIRES2-EGFP-NICD质粒中扩增目的片段Notch-1胞内区,定向克隆至穿梭质粒栽体pShuttle-CMV-EGFP中,经酶切及测序鉴定后,将Notch-1胞内区定向克隆至重组腺病毒骨架载体pAdxsi,构建携带人Notch-1胞内区基因表达盒及绿色荧光蛋白的重组腺病毒栽体(pAdxsi-GFP-NICD).酶切鉴定正确后,转染人胚肾细胞系293细胞,进行重组腺病毒的包装,生产及纯化,半数组织感染量法测定病毒滴度.用重组腺病毒转染人脐静脉内皮细胞,荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白的表达,并通过PCR扩增观察细胞Notch-1胞内区的表达.结果:成功构建了携带人Notch-1胞内区的重组腺病毒,纯化后病毒滴度达1.6×1010 pfu/mL.腺病毒载体转染人脐静脉内皮细胞后24 h在荧光显微镜下即可观察到绿色荧光蛋白,48 h更为强烈,PCR扩增证实细胞表达Notch-1胞内区.结论:成功构建了携带Notch-1胞内区的重组腺病毒载体,为进一步研究Notch信号通路促进动脉形成的机制研究奠定了实验基础.     

三元复合因子Net嵌合型重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆人三元复合因子Net全长基因,构建其重组腺病毒载体。方法 :抽提正常人胰腺组织中总RNA,经RT-PCR扩增出全长Net基因,利用同源重组的方法将腺病毒骨架质粒pBHG35和穿梭质粒pDC316-Net共转染293细胞,获得腺病毒重组质粒Ad5/F35-Net,在293细胞中包装和扩增后,获得高滴度的腺病毒重组质粒Ad5/F35-Net。采用PCR和蛋白印迹法检测Net基因的表达。结果 :用RT-PCR方法 ,从人胰腺癌组织中扩增出1224 bp的cDNA片段,经测序证实为人Net基因。最终构建及包装出高滴度的重组腺病毒载体Ad5/F35-Net。结论:成功克隆了人Net全长基因,并构建其重组腺病毒表达载体,为进一步研究人Net基因在相关肿瘤疾病中的生物学作用奠定了基础。     

构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体

背景：腺病毒的表达时间有限,会限制目的基因的表达时间和表达量,不利于实验的持续进行,故文章选择慢病毒作为载体,与目的基因大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因片段进行基因重组。 目的：探讨构建含有大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体的方法。 方法：根据GenBank中大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体序列（NM 145681.1）,设计出该基因的特异性引物Trail-AgeⅠ-F和Trail-AgeⅠ-R,用PCR法从大鼠cDNA文库中扩增出目的基因,AgeⅠ酶切将该基因克隆入真核表达载体GV218中,产生目的重组质粒,用脂质体 Lipofeetamine 2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体,3个质粒共同转染293T细胞,产生含有表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的慢病毒颗粒,收集病毒进行滴度鉴定,收集细胞提取蛋白进行基因表达情况的检测。 结果与结论：筛选出的克隆阳性菌测序获得肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因,全长861 bp,与GenBank中发表的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体核苷酸序列完全一致。包装后的病毒LV-mTrail在转染2 d后收集病毒液,经PCR和Western blot方法鉴定,从基因和蛋白的层面均证实携带有目的基因肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因。孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2×109 TU/mL。提示大肠杆菌同源重组法能有效和方便地构建出含有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒载体。     

趋化因子受体4基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：目前研究发现,基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4轴具有介导骨髓间充质干细胞定向迁移的作用。目的：构建小鼠趋化因子受体4基因重组腺病毒载体。方法：从C57BL/6小鼠中提取总RNA,以RT-PCR方法获得小鼠趋化因子受体4基因全长1080bp的完整编码序列,通过穿梭质粒pAdTrack-CMV,将目的片段克隆入AdEasy-1腺病毒DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转染293细胞,经包装扩增后,获得重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4,并感染293细胞,PCR鉴定、Western blot检测蛋白表达。结果与结论：含趋化因子受体4基因的重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4构建成功,经PCR鉴定鉴定重组病毒中含有趋化因子受体4cDNA全长,经序列测定表明趋化因子受体4cDNA序列正确无丢失和错配现象,病毒滴度高,Western blot检测感染后293细胞趋化因子受体4的蛋白表达较未感染293细胞明显增加。     

人端粒酶催化亚基反义RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

背景：人端粒酶催化亚基与c-myc在喉鳞状细胞癌中有密切的相关性。目的：构建含有c-myc启动子的人端粒酶催化亚基的重组腺病毒载体,观察人端粒酶催化亚基在细胞中表达后对细胞增长的影响。方法：按照人工合成中反向转录的方法设计基因合成引物,用复式PCR获得目的片段ashTERT（322bp）。将片段ashTERT克隆到pUC57（2.7kb）克隆载体,然后热激转化到E.coli感受态细胞中,菌检、PCR、鉴定阳性克隆后,菌液放大培养,提取质粒pUC57-ashTERT,然后对质粒进行测序。将目的基因片段亚克隆到穿梭载体pshuttle-CMVneo上,然后构建重组腺病毒质粒pAd-ashTERT。转入293细胞中进行病毒包装、鉴定和滴度测定。结果与结论：提取质粒pUC57-ashTERT,测序符合序列要求。质粒pUC57-ashTERT转入293细胞后,成功构建了有较强感染能力的含人端粒酶催化亚基基因的重组腺病毒载体。     

重组转化生长因子β1腺相关病毒感染骨髓基质干细胞的活性

背景：目前常用基因载体具有一定缺陷性,无法直接在体内应用。应用腺相关病毒作为转化生长因子β1载体促进软骨修复的研究报道较少。目的：构建重组转化生长因子β1腺相关病毒,测定病毒滴度,并测定重组病毒对骨髓基质干细胞的感染活性。方法：PCR方法扩增转化生长因子β1基因,构建重组骨架质粒pAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白,与包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞包装重组腺相关病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白。应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度并鉴定。并感染体外培养的兔骨髓基质干细胞,检测重组病毒感染骨髓基质干细胞的效率及活性。结果与结论：转化生长因子β1扩增产物测序结果正确,重组骨架质粒pAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白双酶切后可见位于1.3Kb附近转化生长因子β1条带。收获病毒滴度5.2×1011v.g/mL。鉴定重组病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白包装成功。重组病毒感染骨髓基质干细胞后可于荧光显微镜下观测到绿色荧光蛋白的表达,感染效率达42%。结果证实,成功构建重组腺相关病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白,能够高效感染兔骨髓基质干细胞。     

大鼠组织激肽释放酶8重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建大鼠组织激肽释放酶8（KLK8）的腺病毒表达载体,为进一步研究KLK8对心肌细胞的作用提供实验基础。方法采用AdEasy系统构建携带外源性KLK8编码基因的重组腺病毒载体pAd-KLK8,转染AD-293细胞包装产生重组腺病毒Ad-KLK8,TCID50法对收获病毒进行滴度鉴定,RT-PCR及Western-blot方法检测目的基因在Hela细胞的表达。结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实KLK8基因正确插入腺病毒表达载体,并在AD-293细胞中包装出重组腺病毒;收获病毒的滴度为3.16×1012 IU/mL。结论成功构建pAd-KLK8重组腺病毒表达载体,且重组腺病毒在Hela细胞能有效表达。     

骨髓间充质干细胞中突变型人低氧诱导因子1α真核表达载体的表达

背景：转基因小鼠体内实验证实,重组的低氧诱导因子1α可以促进皮肤形态功能正常的血管新生。目的：构建能够在常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和绿色荧光蛋白报告分子的新型腺病毒真核表达载体,并转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,检测该基因在细胞中的表达情况。方法：利用Lipofectamine2000介导将构建成功的重组腺病毒真核表达载体pAd-HIF1αmu-IRES-hrGFP-1转染HEK293A细胞,包装病毒,以最佳感染指数=50将重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞,并设3个对照组,即阳性对照组：转染Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP-1;阴性对照组：转染Ad-CMV-IRES-hrGFP-1组;空白组：未转染病毒。结果与结论：①腺病毒载体成功转染HEK293A细胞,包装成功,细胞内有大量绿色荧光表达。②转染突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体的细胞在常氧条件下蛋白表达量明显高于转其他3组,3个对照组间差异无显著性意义（P〉0.05）。提示突变型腺病毒真核表达载体Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-1在HEK293A内成功包装;突变后低氧诱导因子1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达。     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达

背景：研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。目的：应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。方法：构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和（或）外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21d后行矿化（钙）结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。结果与结论：①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。     

YWHAZ重组腺病毒及逆转录病毒的制备

目的制备YWHAZ重组腺病毒及逆转录病毒,在293T细胞中验证基因表达情况。方法将YWHAZ基因分别克隆至腺病毒穿梭质粒pacAd5CMV-IRES-GFP及逆转录病毒质粒pLXSN-IRES-GFP,并用酶切鉴定、PCR及测序验证后分别转染至HEK 293T及Ampho293细胞,构建重组腺病毒及逆转录病毒。重组病毒分别感染293T细胞,观察荧光验证病毒侵染效果,RT-PCR检测YWHAZ基因表达情况。结果 PCR、酶切鉴定及测序分析,重组腺病毒及逆转录病毒构建正确,感染293T细胞后可使其高效过表达YWHAZ mRNA。结论成功构建了YWHAZ基因重组腺病毒载体及逆转录病毒载体,为体内外进一步研究YWHAZ基因及其相关信号通路在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

介导人α-反义寡核苷酸慢病毒载体的构建

目的构建介导人α-反义寡核苷酸的慢病毒载体,为α-反义寡核苷酸对β-地中海贫血基因治疗的体内试验提供稳定的转染细胞载体。方法根据人α-反义寡核苷酸序列设计siRNA、合成DNA片段,通过双限制性内切酶消化和连接的方法构建pGCSIL-vshRNA-GFP载体质粒,接着该质粒转化感受态的大肠杆菌E.coliDH5α,通过PCR及基因测序鉴定阳性克隆,再经Lipofectamine 2000将pGCSIL-vshRNA-GFP,pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒系统共转染293 T细胞包装病毒,通过绿色荧光蛋白的表达测定收集的病毒滴度。结果重组质粒的外源基因PCR鉴定正确,基因测序结果与所需要的α-反义寡核苷酸序列完全一致,浓缩后病毒滴度为5×109TU/ml。结论成功构建介导人α-反义寡核苷酸的慢病毒载体。