海莲耐盐基因AOC克隆及转录融合表达载体的构建

利用RT-PCR的方法从红树林海莲中克隆丙二烯环化氧化酶基因(AOC),并进行序列测定和BLAST程序进行同源序列分析。从RT-PCR得到的产物,其核苷酸序列与GeneBank中海莲丙二烯环化氧化酶基因AO(CBAB21610)的核苷酸序列完全相同。AOC基因通过中间载体pBS-AOC,pJIT60-AOC,最后克隆到植物表达载体pGreenII0229上,得到双35S的pGreenII0229-AOC植物表达载体。AOC基因和ipt基因通过中间载体pBS-AOC,pBS-ipt,pBS-AOC-ipt,pJIT60-AOC-ipt;最后将AOC和ipt基因以转录融合的方式克隆到植物表达载体pGreenII0229上,得到具有双35S启动子的AOC,ipt双基因转录融合的植物表达载体pGreenII0229-AOC-ipt。     

香蕉Maasr1基因RNAi植物表达载体的构建及鉴定

以香蕉Maasr1基因为目的基因,载体pBS为中间载体,pBBB、pBI121为表达载体,分别构建含有Maasr1基因的RNAi植物表达载体DBBB-S-I-A和含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBl121-S,并通过农杆菌介导的方式对构建的该RNAi载体沉默效果进行鉴定.结果表明:(1)利用中间载体pBS和植物表达载体pBBB成功构建了香蕉Maasr1基因的RNAi植物表达载体pBBB-S-I-A;(2)利用载体pBI121成功构建了1个含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBI121-S:(3)构建的RNAi载体pBBB-S-I-A可以抑制Maasr1基因的表达,具有较好的沉默效果.     

酸性蛋白酶pepB基因植物表达载体的构建及在玉米中的转化

以黑曲霉基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增了酸性蛋白酶pepB基因序列,并将其克隆到pMD18-T Vector上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析并测序.DNA序列分析表明:克隆片段长为1340bp,与已发表的pepB基因序列同源性达99.85%.将pepB基因片段插入到带有耐盐基因的表达载体pCAMBIA1301-BADH上,构建了无抗生素选择标记的重组质粒pB-pepB-35S,从而得到了植物表达载体,该载体利用耐盐基因BADH替代抗生素基因作为筛选标记.通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株,并得到了转化植株的种子.     

小麦WVp-1基因表达载体的Gateway技术构建及其遗传转化

为了利用中国特有的抗穗发芽小麦遗传资源,并深入分析Viviparous-1(Vp-1)基因在小麦穗发芽抗性中的作用,从抗穗发芽小麦品种西农979的干种子中分离了vp-1基因的同源基因,命名为wvp-1.利用Gate-way技术,以植物表达载体pLeela为基础,成功构建了舍有双35S启动子的高效表达载体,并转化拟南芥突变体abi3-4,获得了8株阳性植株.     

甘蓝型油菜种子特异性表达 fad2基因的ihpRNA载体构建

旨在通过转基因途径诱导油菜种子中fad2基因发生转录后基因沉默,本文构建了fad2基因的ihpRNA 植物表达载体。通过PCR扩增分离到甘蓝型油菜种子特异性表达的Nap in启动子序列(1147bp)以及油酸脱饱和 酶基因( fad2)的一个537bp的片段,并将它们分别克隆到pGEM - T easy载体中。利用中间载体pHurrican构建 fad2基因的反向重复框。将fad2基因片段以正向的方式连接在一个可剪切的内含子的5’末端,而以反向的方式 连接到该内含子的3’末端;然后将Nap in启动子序列连接到该反向重复框的5’端,而在其3’端接有一个nos终止 子序列;最后将fad2基因的反向重复表达框分两步克隆到植物双元载体pCAMB IA2300的pUC18多克隆位点,构建 具有种子特异性表达的fad2基因的ihpRNA表达载体pCNF IRnos。限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。     

木薯淀粉分支酶基因克隆及反义表达载体的构建

利用RT-PCR方法,用木薯块根cDNA做模板克隆获得支链淀粉合成的关键酶基因SBEII,经序列分析,同源性为98.07%;以PCAMBIA1301为基础,构建了以块根特异表达启动子Sporamin驱动的SBEII基因反义结构的植物表达载体.     

HrpZpsta基因植物表达载体的构建及其在大豆中的转化

利用PCR技术扩增含有hrpZpsta基因的克隆载体pMD18-T-hrpZpsta,以植物表达载体pBI121为基础,将PCR产物插入到此植物表达载体中.利用农杆菌介导的大豆子叶节转化法将构建好的表达载体导入大豆品种吉农28中,选用筛选条件为100mg·L-1的卡那霉素选择培养基培养,对获得的转基因植株进行PCR检测...     

亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建

本试验以亚麻(Linum usitatissimum L.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA.用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒.用限制性内切酶EcoR I酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒.用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121栽体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD.     

Mineirao柱花草MSRA基因的克隆及其植物表达载体的构建

根据抗病柱花草中的1个AFLP特异片段SG2950-1设计引物,利用RACE技术从Mineirao柱花草中克隆到一个MSRA基因:经测序比对,该序列与细胞色素氧化酶系基因有较高的相似性.构建了植物表达载体,通过冻融法将该载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404,为进行该基因的功能分析奠定了基础.     

甘薯IbNPR1基因表达载体的构建及转化烟草

为了研究甘薯NPR1基因在转基因植物广谱抗病中的应用,利用前期克隆的甘薯NPRI基因,以pCAMBIA1300质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动IbNPR1基因的植物表达载体pCAMBIAl300+IbNPRl;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行了遗传转化.经PCR检测,IbNPR1基因已整合到烟草基因组中.     

Rapid Generation of Selectable Marker-Free Transgenic Rice with Three Target Genes by Co-Transformation and Anther Culture

The ‘double T-DNA’ binary vector p13HSR which harbored two independent T-DNAs, containing hygromycin phosphotransferase gene (hpt) in one T-DNA region and three target genes (hLF, SB401, RZ10) in another T-DNA region, was used to generate selectable marker-free transgenic rice by Agrobacterium-mediated transformation. The regenerated plants with both the three target genes and the selectable marker gene hpt were selected for anther culture. RT-PCR analysis indicated that target genes were inserted in rice genomic DNA and successfully transcribed. It took only one year to obtain double haploid selectable marker-free transgenic plants containing the three target genes with co-transformation followed by anther culture technique, and the efficiency was 12.2%. It was also noted that one or two target genes derived from the binary vector were lost in some transgenic rice plants.     

利用共转化和花药培养技术快速获得无选择标记的三价转基因水稻

采用农杆菌介导的水稻转化体系,将包含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的双T DNA表达载体p13HSR转化水稻。筛选潮霉素磷酸转移酶基因和目的基因都是阳性的转基因植株,按单株进行花药培养,快速得到无选择标记而目的基因阳性的转基因纯合植株,得率为987％。RT PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录。同时观测到三价表达载体在转化过程中部分目的基因丢失。     

利用农杆菌介导法将BrCS基因导入大豆的研究

以大豆子叶节作为外植体,通过农杆菌介导法将含有BrCS基因的pCAMBIA3300的双子叶植物表达载体,导入到大豆品种黑农59和黑农53中,并对黑农59遗传转化的影响因素进行了优化,最终获得了抗性植株.经PCR检测和PCR-Southern杂交分析,初步证明了目的基因已整合到大豆的基因组中.     

大豆PAL2-3基因的克隆及转化研究

大豆异黄酮是苯丙氨酸代谢途径中合成的一类次级代谢产物,在苯丙氨酸代谢途径中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是关键酶和限速酶。本课题组前期研究发现PAL基因的相对表达量与大豆异黄酮含量具有明显的协同增减趋势,并且在PAL基因家族成员时空表达模式分析中发现,PAL2-3(XM_003542493)是PAL基因家族中相对表达量较高的主要表达成员之一。本试验首先通过克隆大豆中PAL2-3基因;然后构建pCAMBIA3301-GmPAL2-3植物过表达载体,将构建好的pCAMBIA3301-GmPAL2-3表达载体重组质粒转化到根癌农杆菌EHA105中;采用农杆菌介导的大豆子叶节转化体系获得转化植株,并对T1代转化植株进行PPT检测,外源标记基因Bar检测以及荧光定量PCR检测,对转基因阳性植株进行大豆籽粒异黄酮含量的测定。结果表明T_1代转基因植株中PAL2-3基因的表达量是对照的5.11~11.24倍,总异黄酮含量最高的(2 587.63μg·g~(-1))是对照(1 616.90μg·g~(-1))的1.6倍。因此在大豆中过量表达PAL2-3基因可以提高大豆籽粒中异黄酮含量。     

大豆Gy1基因种子特异性表达载体的构建及在玉米中的转化

实验构建了2个大豆贮藏蛋白Gy1基因种子特异性表达载体,并将其分别转入玉米愈伤组织中。载体1以潮霉素为筛选标记,将Gy1基因片段插入到含有种子特异启动子的植物表达载体pCAMBIA1301-7αP上,得到种子特异性表达载体pCAMBIA1301-7αP-Gy1;载体2以BADH为筛选标记,将Gy1基因插入到带有耐盐基因BADH的植物表达载体pCAMBIA1301-BADH上,得到安全性无抗生素选择标记的种子特异性表达载体pCAMBI-A1301-sbeⅡb-Gy1。通过农杆菌介导法将其分别导入玉米自交系H99的愈伤组织中,共获得132株再生植株;经过PCR检测,初步证明获得了34株转基因阳性植株。     

大豆E3连接酶基因GmPLR-2 的克隆及抗旱功能鉴定

PEG模拟干旱胁迫条件下E3连接酶GmPLR-2 基因在大豆根茎叶中呈上调表达，推测其可能参与大豆抗 旱调节。本研究克隆GmPLR-2 基因，构建植物过表达载体pCAMBIA3301-GmPLR-2、RNA干扰表达载体pCAM⁃ BIA3301-GmPLR-2-RNAi并转化到吉农38中，对T2转基因植株进行分子检测，连续7 d不浇水后测定转基因叶片 中相关生理生化指标。结果表明：共获得T2过表达阳性植株12株，RNA干扰阳性植株11株。干旱胁迫7 d后过表 达植株中相对含水率、POD活性、SOD活性、Pro含量均高于未转化植株，而RNA干扰植株中则低于未转化植株；另 一方面过表达植株中相对电导率、MDA含量均低于未转化植株而RNA干扰植株中含量则高于未转化植株，且差异 极显著，说明GmPLR-2 基因的表达与大豆中相关抗旱指标的变化有关。     

转基因技术在大豆育种中的应用

获得转基因植株是植物基因工程的基础,但是由于转化效率较低,在转基因的过程中通常需要一个有效筛选细胞和组织的手段,于是选择标记基因被广泛应用.然而,选择标记基因的使用,存在生物安全性和环境安全性隐患.因此,建立一个安全高效稳定的大豆转化体系,是改善大豆产量、品质、抗逆能力,培育新型大豆品种的保障.该文综述了新型标记基因在...     

应用Cre/loxP系统在转化细胞水平上高效删除转基因水稻的标记基因

 研究了Cre/loxP系统在转化细胞水平上删除转基因水稻中抗性标记基因的可行性和效率。采用农杆菌介导法将Cre/loxP标记基因剪切系统载体pNCG导入水稻细胞,用G418筛选法获得水稻抗性愈伤组织后,在组织培养不同阶段的培养基中添加25 μmol/L雌激素进行Cre基因的诱导表达和标记基因的剪切,PCR检测T0植株中标记基因nptⅡ、重组酶基因Cre和目标基因gusA的整合情况。将扩增结果为gusA（+）/nptⅡ（-）/Cre（-）的转基因植株统计为标记基因剪切成功的植株。结果表明,在抗性愈伤组织培养的预分化前、预分化和分化阶段添加雌激素诱导表达重组酶Cre均能成功切除标记基因序列,标记基因剪切成功率为6.82%~46.43%。在预分化前采用液体培养基添加雌激素诱导处理愈伤组织3 d,T0植株中标记基因的剪切效率高达173.33%,主要原因是雌激素处理提高了愈伤组织绿苗分化率。直接在分化培养基中添加雌激素诱导处理,T0植株中标记基因剪切成功率达46.43%,剪切效率（144.44%）也较高。表明雌激素诱导的Cre/loxP系统能在水稻抗性愈伤组织水平上实现对标记基因序列高效快速删除。     

酸性蛋白酶pepB基因植物表达载体的构建及在玉米中的转化

以黑曲霉基因组DNA为模板, 利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增了酸性蛋白酶pepB基因序列,并将其克隆到pMD18-T Vector上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析并测序。DNA序列分析表明：克隆片段长为1 340 bp,与已发表的pepB基因序列同源性达99.85%。将pepB基因片段插入到带有耐盐基因的表达载体pCAMBIA1301-BADH上,构建了无抗生素选择标记的重组质粒pB-pepB-35S,从而得到了植物表达载体,该载体利用耐盐基因BADH替代抗生素基因作为筛选标记。通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株,并得到了转化植株的种子。