PcDNA3/sIL-1RⅠ重组载体体外表达产物生物学活性的检测

目的：检测构建的PcDNA3／sIL-1R Ⅰ真核表达载体在体外的表达产物是否具有生物学活性。方法：脂质体介导PcDNA3／sIL-1RⅠ体外转染CHO细胞，MTT法检测重组质粒转染的CHO细胞上清液能否阻断IL-113生物学活性。结果：重组质粒转染的CHO细胞上清液中表达的sIL-1RⅠ能阻断不同浓度IL-1B抑制A375细胞生长的作用。结论：PeDNA3／sIL-1RⅠ重组质粒在体外导人哺乳动物细胞后能够表达具有相应生物学活性的目的产物。     

靶向抑制人木糖基转移酶-I基因的shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向抑制人木糖基转移酶- Ⅰ（XT- Ⅰ）基因的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体，为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖（PG）的研究奠定基础。方法根据GenBank提供的XT- Ⅰ基因序列，设计短链寡核苷酸，化学合成后经退火形成双链DNA片段，克隆到Pgenesil- 1载体中，构建shRNA真核表达载体WJ1-WJ6，行酶切及核酸测序鉴定；将构建的XT- Ⅰ特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-M，在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，流式细胞术检测转染效率，并采用半定量RT- PCR和Western blot分别检测转染后细胞XT- Ⅰ基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJ1、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6。酶切及核酸测序鉴定证实，构建的shRNA表达载体WJ1-WJ6序列正确；转染WJ1-WJ6后ACC-M细胞均可表达绿色荧光；流式细胞术测定转染效率平均为50.26%；RT- PCR结果显示，WJ3显著抑制XT- Ⅰ mRNA的表达，抑制率为72.39%；Western blot结果显示，WJ3有效抑制XT- Ⅰ的蛋白表达，抑制率为70.18%。结论成功构建靶向抑制XT- Ⅰ的shRNA真核表达载体WJ1-WJ6，其中WJ3可高效抑制XT- Ⅰ基因mRNA及蛋白水平的表达，为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础。     

MHC-Ⅰ类链相关基因A真核表达载体的构建及稳定转染舌鳞癌细胞的实验研究

目的构建人类MHC-Ⅰ类链相关基因A（MICA）的真核表达载体,转染人舌鳞癌脑高转移Tca8113-Tb细胞,建立稳定过表达MICA基因的口腔鳞癌细胞系。方法采用PCR技术扩增pCMV-SPORT6-MICA中编码MICA基因的cDNA序列,重组至有绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1,构建最终的表达载体pEGFP-N1-MICA,脂质体法转染Tca8113-Tb细胞,G418筛选,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,有限稀释法建立稳定过表达MICA基因的Tca8113-Tb细胞系,RT-PCR、real time PCR和免疫细胞化学检测MICA在该细胞中的表达。结果通过PCR技术获取了MICA基因并成功克隆入载体,测序鉴定该序列与GenBank中的序列相同。转染的细胞可见绿色荧光蛋白表达,RT-PCR、real time PCR及免疫细胞化学检测到目的基因MICA在转染细胞中为过表达。结论pEGFP-N1-MICA真核表达载体的成功构建与稳定转染Tca8113-Tb细胞系的建立,为进一步研究该基因的功能奠定了良好的实验基础。     

人釉原蛋白真核表达载体体外表达产物生物学活性的检测

目的探讨人釉原蛋白基因重组质粒PcDNA3．1-AMG的真核细胞转染表达产物是否具有促进牙周组织再生的作用。方法脂质体介导PcDNA3．1-AMG体外转染COS1细胞．ELISA法检测转染细胞内及其培养上清液中重组釉原蛋白的表达：建立犬牙周组织缺损模型．局部使用转染表达产物冻干粉．8周后通过组织学观察牙周组织再生的情况。结果PcDNA3．1-AMG转染的COS1细胞内重组釉原蛋白浓度为（0．253±0．075）μg／ml。培养液中浓度为（0．065±0．011）μg／ml；使用转染表达产物8周后．牙周缺损区牙骨质、牙槽骨均有显著再生，并且新生牙骨质为有胶原纤维穿通的无细胞牙骨质。结论重组质粒PcDNA3．1－AMG在体外转染哺乳动物细胞后能够表达重组人釉原蛋白．并且表达产物具有促进牙周组织再生的生物学活性。     

靶向抑制人木糖基转移酶-Ⅰ基因的shRNA真核表达载体的构建

目的 构建靶向抑制人木糖基转移酶-Ⅰ(XT-Ⅰ)基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖(PG)的研究奠定基础.方法 根据GenBank提供的XT-Ⅰ基因序列,设计短链寡核苷酸,化学合成后经退火形成双链DNA片段,克隆到Pgenesil-1载体中,构建shRNA真核表达载体WJ1-WJ6,行酶切及核酸测序鉴定;将构建的XT-Ⅰ特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-M,在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞术检测转染效率,并采用半定量RT-PCR和Western blot分别检测转染后细胞XT-Ⅰ基因mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJ1、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6.酶切及核酸测序鉴定证实,构建的shRNA表达载体WJ1-WJ6序列正确;转染WJ1-WJ6后ACC-M细胞均可表达绿色荧光;流式细胞术测定转染效率平均为50.26%;RT-PCR结果显示,wJ3显著抑制XT-Ⅰ mRNA的表达,抑制率为72.39%;Western blot结果显示,WJ3有效抑制XT-Ⅰ的蛋白表达,抑制率为70.18%.结论 成功构建靶向抑制XT-Ⅰ的shRNA真核表达载体WJ1-WJ6,其中WJ3可高效抑制XT-Ⅰ基因mRNA及蛋白水平的表达,为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础.     

上皮膜蛋白1真核表达载体的构建及其对人舌鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的影响

目的 构建上皮膜蛋白1（EMP1）基因真核表达载体pEGFP-N1-EMP1,探讨EMP1基因对人舌鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的影响。方法 采用逆转录聚合酶链式反应（PCR）扩增EMP1基因,双酶切法连接至真核表达载体pEGFP-N1双酶切产物大片段,构建pEGFP-N1-EMP1重组质粒。经测序鉴定后,通过脂质体介导法将pEGFP-N1-EMP1重组质粒和pEGFP-N1空载体转染至人舌鳞状细胞癌Tb3.1细胞,荧光显微镜下观察转染后绿色荧光蛋白的表达情况,实时荧光定量PCR法检测转染后24、48、72 h的EMP1过表达水平。利用Transwell迁移及侵袭实验分析EMP1过表达对Tb3.1细胞迁移及侵袭能力的影响。结果 成功克隆EMP1全长基因,经测序分析证实将EMP1基因准确插入真核表达载体pEGFP-N1,转染后细胞可见绿色荧光表达。实时荧光定量PCR结果显示,pEGFP-N1-EMP1重组质粒转染24 h组,Tb3.1细胞中EMP1表达量显著高于pEGFP-N1空载体组、野生型细胞组以及重组质粒转染48 h和72 h组。Transwell迁移及侵袭实验结果显示,EMP1过表达抑制了Tb3.1细胞的迁移和侵袭能力。结论 成功构建了EMP1真核表达载体,并在体外证实了EMP1过表达可抑制舌鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭能力,为进一步研究EMP1基因在口腔鳞状细胞癌转移中的作用及其分子机制奠定了基础。     

Cyclin D1反义寡核苷酸对Tca8113/CDDP细胞基因转录表达的影响

目的：构建细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的反义寡核苷酸真核表达载体,并检测其转染Tca8113／CDDP细胞系后的表达情况。方法：以Tca8113／CDDP细胞总RNA为模板,应用RT-PCR法扩增cyclinD1全长．通过克隆至pUCm-T载体中,测序完全正确;经IPrG诱导,可正确表达蛋白。上下游分别利用HindIII和EcoRI的酶切位点插入真核表达载体pcDNA3．1,测序鉴定;并构建表达cyclin D1反义寡核苷酸的2个重组载体,通过Lipofectamine将其导入Tca8113／CDDP细胞系中,G418筛选获得阳性稳定表达细胞系：通过RT-PCR、免疫组化检测cyclin D1基因转录和蛋白表达。结果：成功构建pcDNA3．1-cyclin D1真核表达载体,分别命名为pcDNA3．1空载体（Co）、cyclin D1 mRNA 5’端为靶区的反义载体(C5’)、cyclin D1 mRNA 3’端为靶区的反义载体(C3’)、cyclinD1正义载体(CDl)。3’端反义寡核苷酸转染细胞后,cyclin D1 mRNA表达水平降低58．8％,mRNA5’端反义寡核苷酸组无明显抑制。免疫组化结果显示,转导正义寡核苷酸组cyclin D1阳性表达为最高,转导mRNA3’端、mRNA5’端反义寡核苷酸组为弱阳性表达。结论：cyclin D1 mRNA3’端反义寡核苷酸能明显抑制cyclin D1在Tca8113／CDDP中的表达,为进一步研究逆转Tca8113／CDDP耐药性提供了实验工具。     

重组质粒PcDNA3.1/sTNFRⅠ在小鼠体内表达的初步研究

目的：检测构建的PcDNA3．1／sTNFR Ⅰ真核表达载体在小鼠体内能否有效表达目的产物，为探索利用该载体基因治疗TNFα介导的炎性疾病奠定一定的实验基础。方法：将PcDNA3．1／sTNFRⅠ载体直接注入小鼠胫前肌，ELISA法检测肌肉匀浆中的sTNFRⅠ表达。结果：在注射后7d与10d，PcDNA3．1／sTNFRⅠ注射组小鼠肌肉匀浆中sTNFRⅠ表达的量均显著高于PcDNA3．1注射组（P〈0．01），注射后第10天sTNFRⅠ表达量高于第7天sTNFRⅠ表达量（P〈0．01）。结论：采用直接注射法将PcDNA3．1／sTNFRⅠ载体转移入肌肉内可以使目的基因得到一定的表达。     

脂质体介导TIMP-2转染人成釉细胞瘤细胞的时效性分析

用阳性脂质体LipofectamineTM2000 将不同浓度(1、 2、 3 μg)的TIPM-2真核表达载体pcDNA3.1(+)/GFP-TIMP-2转染至人AM 细胞,倒置相差荧光显微镜观察转染情况,流式细胞仪测定转染效率.转染24 h后细胞生长良好,72 h后细胞体积增大,细胞排列变疏松,部分细胞出现核溶解.1 μg组的转染率与2、 3 μg组的转染率在各个时段都有明显的差别,差异有显著性.3 μg组的转染效率最高,72 h达到53.9%,但3 μg组与2 μg组的转染率差异无显著性.TIMP-2可成功转染至体外培养人成釉细胞瘤细胞, 2 μg为最优的转染浓度.     

纤维粘连蛋白片段真核表达载体pcDNA3．1（＋）-EDA的构建

目的构建纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）基因的EDA外显子的真核表达载体，以研究EDA对涎腺腺样囊性癌（slivary adenoid cystic carcinoma，SACC）生物学行为的影响。方法以RT-PCR技术从口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma）细胞株KB中扩增出外显子EDA，克隆人pcDNA3．1（＋）真核表达载体，用PCR和限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定真核表达载体pcDNA3．1（＋）-EDA。结果PCR、酶切、DNA测序鉴定证明成功构建了pcDNA3．1（＋）-EDA真核表达载体，DNA测序显示重组质粒含有与EDA片段基因序列完全相等的基因。结论成功构建了纤维粘连蛋白（fibronectin，Fn）基因的EDA外显子的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-EDA。     

Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 inhibits ameloblastoma growth in a new mouse xenograft disease model

J Oral Pathol Med (2010) 39 : 94–102
Background:  Ameloblastomas are odontogenic neoplasms characterized by local invasiveness. This study was conducted to develop a new animal model of ameloblastoma and to address the role of tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in the growth and invasiveness of ameloblastomas.
Method:  Donated fresh human ameloblastoma tissue was finely minced, screened, and subcutaneously implanted in three locations on each of 10 BALB/c-nu/nu nude mice. Newly established tumors on each mouse were injected with: (i) transfection reagent; (ii) liposome and transfection reagent; or (iii) liposome, transfection reagent, and the expression plasmid pcDNA3.1(+)/green fluorescent protein (GFP)-TIMP-2. Tumors were monitored for 5 weeks and excised for histopathology, RNA, and protein analyses.
Results:  The ameloblastoma xenografts were established with high frequency and contained a variety of typical features, validating this new model system. Xenografts injected with the TIMP-2 expression plasmid showed reduced growth, increased TIMP-2 mRNA and protein, and decreased MMP-2 protein compared with the control groups.
Conclusions:  We successfully established a new experimental model of ameloblastoma consisting of subcutaneous human xenografts in nude mice. In addition, we demonstrated the successful introduction of the TIMP-2 gene in tumor xenograft cells in vivo , resulting in xenograft growth inhibition. This growth inhibition may have resulted from TIMP-2 overexpression specifically inhibiting MMP-2 protein expression and activity.     

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因真核表达载体的构建和体外表达

目的：构建牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因的真核表达载体，并检测其在体外真核细胞中的表达情况。方法：利用基因重组技术构建牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因重组质粒pcDNA3.1( )-KGPcd，然后通过脂质体将pcDNA3.1( )-KGPcd瞬时转染COS7细胞，以RT-PcR和间接免疫荧光法检测重组质粒的转录水平和蛋白表达情况。结果：成功构建了牙龈蛋白酶K真核表达载体；转染的COS7细胞中可检测到目的蛋白的转录和表达。结论：成功构建了pcDNA3.1( )－KGPcd真核表达载体并在哺乳动物细胞中能够正确转录和表达，为下一步作为基因疫苗免疫动物提供了依据。     

人lrg真核表达载体的构建和初步分析

目的：在真核细胞中表达人lrg基因。方法：构建野生型人lrg的真核表达载体，体外转染肝癌细胞系HepG2，并进行稳定筛选。用Western Blot、SABC-FITC进行人lrg基因表达的鉴定。结果：成功构建了人lrg的真核表达载体pcDNA3．1( )／hlrg，Western Blot和SABC-FITC等实验表明该基因在HepG2中进行了表达。结论：在HepG2中稳定表达了pcDNA3．1( )／hlrg，为深入探讨人lrg基因的功能奠定了基础。     

促凋亡分子Bad真核表达载体构建及其在人基底细胞癌细胞中的表达

目的:克隆Bcl-2相关促凋亡基因Bad的全长编码序列,构建Bad基因的真核表达载体并在人基底细胞癌细胞系(A431)中表达,为研究该基因在人基底细胞癌治疗中的作用奠定基础。方法:根据已发表的Bad基因的核苷酸序列设计并合成引物,用Hela细胞抽提的RNA进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用XhoI和EcoRI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.1-myc-Bad并对其DNA测定序列。用脂质体法将pcDNA3.1-myc-Bad导入人基底细胞癌细胞系A431中,G418选择培养,Western blot及SABC-FITC分析鉴定其表达。瞬时转染A431细胞,通过细胞计数和集落形成实验观察其对A431细胞生长的影响。结果:RT-PCR扩增出长500bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.1-myc后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致。pcDNA3.1-myc-Bad在A431细胞中有表达并可影响细胞生长,与对照组有明显差异。结论:成功克隆了Bad的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc-Bad,并在瞬时转染肿瘤细胞后观察到细胞生长受抑制。     

稳定过表达成纤维细胞激活蛋白的口腔鳞状细胞癌细胞株的构建

目的 构建人成纤维细胞激活蛋白（FAP）过表达慢病毒载体,转染口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞株SCC9,构建稳定过表达FAP的OSCC细胞株。方法 采用聚合酶链反应（PCR）技术获得FAP片段,利用基因重组技术构建过表达FAP的慢病毒载体,包埋病毒并收集上清液感染SCC9细胞株,通过流式细胞荧光分选技术（FACS）进行筛选,获得稳定过表达FAP的SCC9细胞株。结果 对阳性克隆进行酶切鉴定和基因测序证明FAP的慢病毒载体构建成功,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果证明成功构建稳定过表达FAP的SCC9细胞株。结论 本研究有助于获得纯化FAP蛋白,为进一步研究FAP在OSCC发生发展过程中的机制奠定基础。     

金属蛋白酶解离素28对人牙乳头细胞生物学特性的影响

目的:探讨金属蛋白酶解离素28(ADAM28)基因对人牙乳头细胞(HDPC)增殖、分化、凋亡的影响,并分析其可能的作用机制.方法:应用细胞培养、基因转染、MTT、流式细胞术(FCM)和酶动力学等方法,探讨ADAM28基因对HDPC生物学特性的影响,采用SPSS12.0软件包中的SNK检验进行统计学分析.结果:成功转染ADAM28真核质粒,真核质粒转染组HDPC的增殖活性、增殖指数、碱性磷酸酶(ALP)分泌活性显著高于空载体组、未转染组,而凋亡细胞百分比显著低于两对照组,P<0.01.结论:ADAM28可显著促进HDPC的增殖和ALP的分泌,显著抑制HDPC的凋亡.     

人釉原蛋白基因转染牙周膜细胞的实验研究

目的:构建含有人釉原蛋白(human amelogenin,hAm)基因的慢病毒载体质粒,用重组慢病毒感染人牙周膜细胞(Human periodontal ligament cells,hPDLCs),初步探讨釉原蛋白基因修饰种子细胞用于牙周组织工程修复的可行性.方法:采用RT-PCR方法获取hAm编码基因,构建慢病毒载体质粒FUAmW,重组质粒经双酶切及测序鉴定.聚乙烯亚胺(polytheylenimine,PEI)法三质粒共转染293T细胞,获取重组慢病毒FUAmW FUGW,感染hPDLCs,应用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluoreseene protein,GFP)表达,流式细胞仪flow cvtometer,FCM)检测慢病毒载体转染效率.通过RT-PCR检测hPDLC中hAm基因的表达.结果:测序证实,RT-PCR产物序列与Genebank公布的Am编码序列一致,双酶切证实目的片段插入重组质粒.293T细胞及hPDLCs感染72h后.荧光显微镜下可见绿色荧光.FCM测得GFP感染2种细胞的阳性率分别为69.46%和33.99%.RT-PCR证实重组慢病毒FUAmW感染的细胞能表达hAm基因.结论:成功构建含有人釉原蛋白基因的慢病毒载体质粒,经293T细胞包装.得到重组慢病毒可感染牙周膜细胞.     

p27kip1基因转染及其对人舌癌细胞增殖的影响

目的:探讨人p27kip1基因对人舌鳞状细胞癌细胞增殖的影响。方法:从正常组织中克隆人p27kip1基因连接至pcDNA3真核表达载体上,应用脂质体将重组质粒转染舌癌Tca8113细胞,观察外源目的基因在靶细胞中的整合及表达、细胞的生长情况及细胞周期的变化。结果:成功克隆p27kip1cDNA并构建真核表达载体,将其导入Tca8113细胞中,经G418筛选得到稳定表达p27kip1基因的细胞株,其细胞的生长受到抑制,增殖下降。G0/G1期细胞百分数由34.973%增至66.064%,细胞出现了凋亡。结论:克隆并在体外转染Tca8113细胞获得了p27kip1的高表达,抑制舌癌细胞由G1期向S期过渡从而抑制了细胞增殖。