GLP-1(7-36)NH2对新生大鼠胰岛祖细胞的诱导分化作用

目的:观察GLP-1(7-36)NH2对新生大鼠胰岛祖细胞的诱导分化作用.方法:从新生大鼠胰岛中分离培养胰岛祖细胞,用含20 nmol/L GLP-1(7-36)NH2的RPMI 1640完全培养基诱导分化4周(GLP-1组,n=5),以RP-MI1640完全培养基作对照(n=5).免疫细胞化学染色检测诱导分化前后细胞Nestin、PDX-1、胰岛素、生长抑素的表达;放射免疫法测定每周末培养基中胰岛素含量(胰岛素分泌量);二硫腙染色观察形成的胰岛样细胞团(ICCs),4周后计数每25 cm2中直径＞50 μm的ICCs数目.结果:诱导前胰岛祖细胞不表达PDX-1、胰岛素、生长抑素,仅表达Nestin.诱导4周后,GLP-1组PDX-1、胰岛素、生长抑素表达阳性率和ICCs计数均高于对照组(P＜0.05).GLP-1组诱导3周、4周后胰岛素分泌量高于对照组(P＜0.05).结论:GLP-1(7-36)NH2可以促进胰岛祖细胞分化成熟,形成有胰岛素分泌功能的ICCs.     

胰岛新生相关蛋白肽方案诱导人脂肪源性干细胞体外分化成为胰岛样细胞团的效果评价

目的： 探讨胰岛新生相关蛋白(INGAP)联合细胞因子诱导人脂肪源性干细胞(hASCs)分化为胰岛样细胞团的效果。方法：分离、纯化、鉴定人脂肪源性干细胞。应用胰岛新生相关蛋白肽(INGAP-pp)联合细胞因子进行四步法诱导,RT-PCR、实时定量PCR及细胞免疫荧光检测诱导后细胞胰腺发育及功能基因的表达变化,在不同浓度（5.6和25.0 mmol·L^-1）葡萄糖刺激下,检测分化细胞胰岛素及C肽分泌量。结果: 在诱导过程中,干细胞相关基因Oct3/4表达降低至原始水平的1/20,而与胰腺系分化发育相关的基因(Ck19、nestin、pdx-1及nkx2.2均显著升高。在诱导分化后期,INGAP-pp/Scramble-pp 诱导组均出现了胰岛样细胞团,INGAP-pp诱导组细胞团的直径为150～200 μm,而Scramble-pp诱导组细胞团的直径为50～100 μm,前者更接近天然胰岛直径。免疫荧光检测显示,胰岛样细胞团中存在胰岛素和C肽双阳性的细胞群,对不同浓度的葡萄糖刺激有反应,分泌量约占天然胰岛细胞的1/15～1/10。 结论：INGAP-pp诱导方案可诱导hASCs向胰腺系细胞分化,在体外形成具有胰岛素分泌功能的胰岛样细胞团。提示hASCs有望替代胚胎干细胞及骨髓来源间充质干细胞,成为细胞移植治疗糖尿病的种子细胞。     

高浓度葡萄糖对体外培养小鼠胰岛细胞NF-κB的表达及细胞凋亡的影响

目的:探讨核因子κB（NF-κB）在高浓度葡萄糖诱导胰岛细胞凋亡中的作用。方法：对分离纯化的小鼠胰腺胰岛细胞进行体外培养,按DMEM培养液里葡萄糖浓度不同,分为6组：G1组（5.6 mmol•L^-1葡萄糖）、G2组（7.8 mmol•L^-1）、G3组（11.1 mmol•L^-1）、G4组（16.7 mmol•L^-1）、 G5组(22.2 mmol•L^-1)及G6组（27.6 mmol•L^-1）。采用放射免疫法检测各组胰岛细胞胰岛素分泌水平;免疫组织化学染色法检测NF-κB活性;免疫荧光法检测细胞色素C释放和细胞核染色检测细胞凋亡。结果：当葡萄糖浓度5.6～11.1 mmol•L^-1时,随着葡萄糖浓度升高,胰岛细胞胰岛素分泌逐渐增加（P<0.05),NF-κB的活性逐渐增加（P<0.05),但此时细胞凋亡未见显著的变化（P>0.05),细胞色素C释放的组间比较差异无显著性（P>0.05)。当葡萄糖浓度≥16.7 mmol•L^-1时,与葡萄糖浓度≤11.1mmol•L^-1各组比较, NF-κB表达明显增加,细胞色素C的释放也逐渐增强（P<0.05),胰岛细胞凋亡百分率同时也呈明显增加趋势（P<0.05）。结论：高浓度葡萄糖可以诱导胰岛细胞NF-κB表达增加,细胞色素C释放增强,同时诱导胰岛细胞凋亡,提示NF-κB的激活与胰岛细胞凋亡可能存在必然的联系,抑制NF-κB活性可能对于保护胰岛细胞有重要作用。     

成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离?培养及鉴定

目的:建立成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养及鉴定的方法.方法:V型胶原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺组织,并经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,而后加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)继续培养,7天可形成单层细胞,用0.25%胰酶-EDTA消化并传代培养.取第2代细胞利用免疫荧光染色和RT-PCR方法检测CK19、Pdx-1、Nestin、insulin及glucagon的表达.结果:经胶原酶灌注消化胰腺导管上皮,再经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,可使胰腺导管细胞得到较好的纯化.免疫荧光结果示:胰腺导管细胞CK19、Pdx-1和Nestin染色呈阳性,阳性细胞率分别为(88.6±6.2)%、(84.6±8.6)%和(79.3±10.5)%,而insulin及glucagon染色为阴性.RT-PCR结果显示该细胞表达CK19、Pdx-1和Nestin基因.结论:该方法可较好的分离出胰腺导管细胞.经鉴定该法培养所获细胞具有胰腺干细胞的特性.     

体外胰腺导管上皮细胞与胰腺腺体培养对比分析

目的:比较以胰腺导管上皮和腺细胞培养获取胰岛细胞的差别,以探寻获取胰岛细胞的可靠途径.方法:用胶原酶消化法,获取胰腺导管上皮细胞和胰岛细胞,进行体外培养,观察其细胞形态、细胞纯度和胰岛素分泌量,比较两种细胞来源获取胰岛细胞的差异性.结果:在光镜下见胰腺导管上皮细胞组(Ⅱ组)具有较强的增殖能力,能够产生胰岛样细胞团;硫腙(DTZ)染色阳性细胞团纯度记数高于腺体细胞组(Ⅰ组)(87.6%/73.7%);胰岛素分泌量明显高于后者(237.23±52.41/566.07±55.66;162.87±38.17/431.22±57.59;105.89±31.47/359.68±62.27;P<0.01),但组内则无统计学意义的差别(P>0.05),Ⅰ、Ⅱ组胰岛素分泌量随时间延长而衰减,其第4、6天分泌量分别为第2天的68%、44%和75%、63%.结论:胰腺导管上皮细胞具有较强的转分化为胰岛细胞的能力,在胰岛细胞培养取材过程中,不能忽视或丢弃,它可能是可转分化为胰岛细胞的胰腺干细胞之一.     

新生大鼠胰腺干细胞的分离和培养及初步鉴定

目的探讨分离、培养及初步鉴定新生大鼠胰腺干细胞的方法。方法取30只无特定病原体(SPF)级新生大鼠的胰腺组织,用完整胰腺胶原酶消化法分离胰岛。以低糖改良Eagel培养液为基础培养液,于不同时期分别添加血清、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、白血病抑制因子、神经干细胞原代培养的无血清培养液中的营养因子B27、神经元培养的无血清培养液中的营养因子N2等进行培养,倒置相差显微镜下观察其形态学特征及生长特性。应用免疫细胞化学法对培养不同时期的细胞进行巢蛋白(Nestin)及细胞角质蛋白19(CK-19)检测,并进行初步鉴定。结果 1新生大鼠胰腺内纤维组织少,体积小,完整胰腺胶原酶消化法简化了胰岛分离步骤,减少了污染机会,有利于进一步培养。2培养24 h可见细胞贴壁,但贴壁细胞数量较少,改用无血清培养后,贴壁细胞快速生长,10~15 d形成单层细胞汇集,细胞形态较一致。3培养所得细胞一直较多表达胰腺干细胞的标志物Nestin,随培养时间延长,表达CK-19的细胞数量逐渐增多。结论新生大鼠胰腺消化后,获得的细胞于不同时期表达胰腺干细胞的标志物Nestin、CK-19。     

成人胰腺干细胞分离、培养及鉴定

目的：从成人胰腺组织中分离并鉴定胰腺干细胞。方法：利用含bFGF的有血清培养基分离、培养出具有高度增殖能力的细胞群，采用RT－PCR技术检测其Nestin mRNA及Insulin mRNA表达情况。同时诱导定向分化，观察其分化后的状态。结果：从成人胰腺组织中分离出的条索状细胞具有高度增殖能力，其Nestin mRNA表达阳性，而胰岛素Insulin mRNA表达阴性，分化后的细胞形成胰岛细胞团样结构。结论：本研究得到的细胞具有高度增殖能力和分化成胰岛细胞的潜能，是来源于胰腺的胰腺干细胞。     

胰岛干细胞分离及诱导分化的实验研究

目的①比较两种不同的分离方法在胰岛干细胞分离过程中的效果差异。②探讨维甲酸(Retinoic Acid)联合活化素A(Activin A)在胰岛干细胞诱导分化过程中的价值。方法随机分组比较麻醉状态下消化酶原位灌注法和离体机械消化法在胰岛干细胞分离过程中的效果差异;将分离出的胰岛干细胞进行贴壁培养,培养过程中加入维甲酸及活化素A做为实验组,取不加维甲酸﹑活化素A及加入高糖的培养液作为实验对照组,通过观察细胞生长状态及绘制细胞生长曲线来分析该处理因素对胰岛干细胞的影响,从而了解其在胰岛干细胞分离及分化过程中的价值。结果①麻醉状态下原位灌注消化法消化酶用量小,消化彻底,巢蛋白(Nestin)阳性细胞率高。②维甲酸联合活化素A明显地促进Nestin阳性细胞呈簇状生长,并形成类胰岛样细胞团;通过免疫组织化学染色鉴定发现胰岛样细胞团中心部位胰岛素抗体阳性细胞及周围区域胰高血糖素抗体阳性细胞数明显增多,通过记录类胰岛细胞团形成时间,维甲酸及活化素A组明显短于高糖组及空白组,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论胰岛干细胞分离过程中尽量减少对细胞的机械破坏,分化过程中联合应用维甲酸及活化素A明显地促进Nestin阳性细胞呈簇状生长,形成类胰岛样细胞团,为体外获得大量的胰岛细胞从而解决移植细胞来源的难题提供了可能。     

胰腺干细胞与胰岛混合培养对其转化率的影响

目的  研究胰腺干细胞与胰岛混合培养对增加胎鼠胰腺干细胞向β前体细胞转化率的作用及机制。 方法  实验分为胰腺导管干细胞单独培养组（Ⅰ组）,胰岛单独培养组（Ⅱ组）及干细胞-胰岛混合培养组（Ⅲ组）。V型胶原酶消化大鼠胰腺获得胰岛后,使用Ficoll-400梯度离心法纯化胰岛;采用胶原酶消化法获得胎鼠胰腺干细胞进行培养,通过RT-PCR及免疫组织化学染色的方法,检测细胞角蛋白-19（CK 19）、巢蛋白（Nestin）、胰高血糖素和胰岛素等干细胞相关标志物。干细胞诱导培养基中加入纯化的胰岛进行混合培养,通过观察干细胞表达胰岛素的阳性率评价其诱导转化率。结果  V型胶原酶逆行胰管灌注继而Ficoll 400梯度离心可获得生物活性良好的胰岛;所培养的干细胞表达CK-19、Nestin、胰高血糖素,诱导后部分表达胰岛素。干细胞-胰岛混合培养组及干细胞单独培养组诱导后,细胞胰岛素阳性率分别为38.2%和23.9%,差异有统计学意义(P<0.05);CK-19阳性率分别为89.3%和81.6%,其差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论  胰腺导管干细胞与胰岛混合培养可提高胰腺导管干细胞向β前体细胞的转化率,其作用与CK-19的表达密切相关。     

人胚胎胰腺源nestin阳性细胞的快速获取

目的：建立一种胰腺nestin阳性细胞的快速培养方法。方法：解剖分离12～24周龄胎儿胰腺，通过胶原酶V消化获得胰岛样细胞团(ICCs)；经原代培养及传代培养后获得nestin阳性细胞。结果：免疫荧光法观察发现，传代培养4次后即可获得单纯的nestin阳性细胞。结论：从胎儿胰腺中可快速获取单纯的nestin阳性细胞。     

胎胰蛋白促进人脂肪来源的间充质干细胞向胰岛素及C-肽阳性细胞的分化及细胞鉴定

目的：利用大鼠胚胎胰腺组织蛋白提取物诱导人脂肪来源的间充质干细胞(hASCs)向胰岛素分泌细胞分化,为临床胰岛移植寻找新的细胞来源。方法：将新生SD大鼠的胚胎胰腺匀浆后提取胎胰蛋白,重建胰腺微环境,诱导hASCs向胰腺方向分化。诱导组为胎胰蛋白培养组,对照组不添加胎胰蛋白,其余培养条件相同,诱导20 d后,荧光定量PCR技术检测2组胰腺发育相关基因的表达水平,ELISA法检测细胞悬液胰岛素水平,荧光免疫组织化学检测细胞C-肽蛋白表达。结果：在胎胰蛋白诱导过程中,hASCs重要标志基因Oct3/4及Nanog的表达持续降低,说明hASCs逐渐失去全能干细胞的特性;在诱导的第6天开始检测到PDX-1和CK-19的表达上调,诱导细胞出现了胰腺方向的分化,12 d开始检测到胰岛素的阳性表达。所获分化细胞基础相分泌胰岛素量为（287.17± 15.67） mIU•L^-1,高糖刺激下为（401.09±28.94 ）mIU•L^-1,二者比较差异有统计学意义（P<0.01）,且均明显高于对照组的（4.85±1.04） mIU•L-1 (P<0.01);免疫荧光检测,诱导组可见C肽阳性细胞,对照组未见C-肽阳性细胞。结论：模拟的微环境可诱导hASCs分化为有功能的胰岛素产生细胞,具有替代胰岛细胞治疗糖尿病的潜在可能性。     

巢蛋白在大鼠胚胎、新生及成年胰腺中的表达变化

目的：探讨巢蛋白(nestin)在胚胎后期、新生期、成年三阶段的核酸、蛋白水平表达的变化．方法：取三个发育时期的胰腺,应用RT—PCR、免疫组化的方法进行半定量、定位分析．结果：在胚胎后期、新生期、成年三阶段nestin在核酸、蛋白水平均有表达,阳性细胞主要分布在胰岛,在腺泡周围的外分泌中有少量分布．结论：随大鼠胰腺的生长发育,核酸、蛋白表达下调．胰岛内nestin阳性细胞数也呈下降趋势．     

大鼠胰腺导管上皮细胞体外诱导的研究

目的:观察大鼠胰腺导管上皮经四步法诱导分化为胰岛样细胞团后移植治疗糖尿病的效果?方法:采用Ⅴ型胶原酶胆管内灌注消化法,经Ficoll不连续密度梯度离心后分别获得导管上皮细胞和新鲜胰岛?导管上皮细胞经原代培养及传代后取2~6代细胞开始进行四步18天的诱导,分化为胰岛样细胞团,行免疫荧光鉴定?将链脲佐菌素造模成功的18只SD大鼠采用完全随机法均分成3组,空白对照组?新鲜胰岛组?胰岛样细胞团组进行左肾包膜下移植?分别给予RMPI1640?新鲜胰岛和胰岛样细胞团,移植后隔日固定时间监测血糖?结果:经免疫荧光鉴定,分离纯化的胰腺导管细胞具有干细胞特性,诱导后的胰岛样细胞团胰岛素?胰高血糖素染色均为阳性?移植后空白对照组血糖维持在高血糖范围?新鲜胰岛组移植后血糖逐步下降至正常水平,并在2周之内基本稳定在正常范围内但略有上升?胰岛样细胞团组移植后前2天血糖不降反升,之后有所下降但始终未能降至正常范围,然后又逐渐上升?结论:胰腺导管上皮细胞经该方案诱导后分化为胰岛样细胞团,使糖尿病大鼠血糖有一定程度的下降,但下降幅度及维持时间不能令人满意,可能与移植量不够及诱导的胰岛样细胞团功能不良有关?     

不同来源胰腺干细胞分化为胰岛样细胞团比较研究

目的 比较不同来源的胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞团的可行性及效率.方法 分别取孕16天胎鼠胰腺(A组,5只)、糖尿病大鼠胰腺(B组,5只)、正常大鼠胰腺(C组,5只)经体外分离纯化获得巢蛋白(nestin)阳性胰腺干细胞,免疫荧光组化法比较各组干细胞中PDX-1的表达情况;添加各种诱导分化因子,观察胰岛样细胞团出现的时间并行双硫腙染色鉴定.结果 各组均可分离纯化出Nestin阳性胰腺于细胞,免疫荧光组化显示A组PDX-1阳性的细胞数(50%)多于B组(45%)及C组(42%),经诱导分化各组胰腺干细胞均可分化成胰岛样细胞团,并经双硫腙染色鉴定证实为分化胰岛,但各组细胞团形成时间不同,以A组分化为胰岛样细胞团所需时间较短(10±3)天,而B组及C组所需时间较长,分别为15±2天及16±3天,各组分化时间存在统计学差异(P＜0.05).结论 不同来源的胰腺干细胞均可分化为胰岛样细胞团,以胎鼠胰腺干细胞定向分化为胰岛样细胞团的效率最高.     

巢蛋白和胰岛素在大鼠胰腺不同发育阶段的表达

目的：探讨巢蛋白(nestin)在胚胎后期、新生期、成年3阶段的mRNA、蛋白水平表达的变化。方法：应用RT-PCR、免疫组化的方法进行半定量、定位分析。结果：在胚胎后期、新生期、成年3阶段Nestin在mRNA、蛋白水平均有表达，Nestin阳性细胞主要分布在胰岛中．腺泡周围的外分泌组织中有少量分布。结论：Nestin随大鼠胰腺的生长发育，核酸、蛋白表达下调，胰岛内Nestin阳性细胞百分数表达也下调。     

牛磺酸对原代培养新生大鼠乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的作用

目的：探讨牛磺酸（Tau）对原代培养的新生大鼠乳鼠心肌细胞的保护作用及对心肌成纤维细胞的生长抑制作用。方法：将心肌细胞分为对照组、H₂O₂损伤模型组以及H₂O₂损伤加药物治疗组：阳性药川芎嗪（Lig）组及Tau大、中、小（80、40及20 mmol·L^-1）剂量组，预先24 h给予治疗药物后使用0.5 mmol·L^-1 H₂O₂损伤心肌细胞6 h，观察Tau对心肌细胞形态学的影响，MTT法测定反映心肌细胞存活力的A值以及测量乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的变化；将心肌成纤维细胞随机分为7组，分别给予0、10、20、40、80、160及320 mmol·L^-1 Tau，MTT法测定不同浓度Tau对心肌成纤维细胞生长的影响。结果：H₂O₂损伤心肌细胞6 h后，Tau（80、40及20 mmol·L^-1）剂量组A值分别为0.479±0.055、0.437±0.052及0.421±0.062，与H₂O₂组（0.304±0.050）比较，差异均具有显著性（P<0.001或P<0.01）；Tau（80及40 mmol·L^-1）剂量组使H₂O₂损伤的心肌细胞LDH释放减少、SOD含量增加、MDA含量降低，与H₂O₂损伤组比较差异均具有显著性（P<0.01或P<0.05）；40～320 mmol·L^-1 Tau抑制心肌成纤维细胞的生长，与空白对照组比较差异具有显著性（P<0.05，P<0.01或P<0.001）。结论：Tau可通过减轻自由基对心肌细胞的损伤，抑制心肌成纤维细胞生长，达到心脏保护作用。     

Analysis of CK-19,PDX-1,Nestin,Ngn3 in different donor islet purity in rats

Objective: To investigate if there are the CK-19, PDX-1, Nestin, Ngn3 positive cells in the donor islets of different purity in rats. Methods: Thirty male adult SD rats were randomly divided into 3 groups. Islets were isolated using digestion by ductal injection of collagenase. Group Ⅰ (n=10): Separating cell preparations were not purified, Group Ⅱ(n=10): Islet sediment was purified with 25% Ficoll400 ,Group Ⅲ (n=10): Islet sediment was purified with 25% and 11% Ficoll-400. The levels of protein of CK-19, PDX-1, Nestin and Ngn3 were detected by immunohistochemistry and the mRNA of CK-19, PDX-1, Nestin, Ngn3 was amplified by RT-PCR. Results: After two different purification methods applied, three islet preparations of different purities were obtained. The difference of islet purity was significant among various groups (P＜0.05). Compared with group Ⅱ and group Ⅲ,the protein and mRNA of CK-19, PDX-1, Nestin,Ngn3 were both higher in group Ⅰ; group Ⅲ was poorly expressed. Conclusions: The three different islet purity donor islet have different CK-19, PDX-1, Nestin, Ngn3 positive cells within them, indicating that there are some islet stem cells in the purified donor islet.     

大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察

目的:探讨大鼠脊髓背根神经节(DRG)内是否存在神经前体细胞.方法:取成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片,进行Brdu,Nestin,P75免疫荧光组织化学检测,分别取成年和胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养,观察其增殖与分化情况,并行Nestin免疫组织化学和Brdu,P75,NF,GFAP免疫荧光组织化学鉴定.结果:在成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片上均见有Brdu/Nestin和Nestin/P75免疫荧光双标细胞.细胞培养观察到取自DRG的细胞有分裂增殖,呈Nestin免疫组织化学阳性反应和Brdu,P75免疫荧光组织化学阳性反应;培养第三代细胞加入胎牛血清后出现分化,分化细胞呈NF和GFAP免疫荧光组织化学阳性反应.结论:大鼠DRG内存在有分裂增殖的神经前体细胞,这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞.