猪囊尾蚴总RNA的提取与mRNA的分离

目的为比较对猪囊尾蚴总RNA提取与mRNA分离方法的优点。方法采用Promega公司的SV总RNA分离体系、RNAgents总RNA分离体系和hioDev—Tech的TRIZOL LS试剂,对猪囊尾蚴总RNA进行了提取;用Promega的PolyA Ttract mRNA分离体系和Amersharn的Quickprep微量mRNA纯化试剂盒对mRNA进行分离。结果表明经改良的TRIZOLLS试剂,提取猪囊尾蚴RNA效果好,而PolyA Ttract mRNA分离体系分离的mRNA含量高,纯度好。结论所分离的mRNA适合于构建cDNA表达文库。     

猪精子RNA提取及cDNA质量检测

为了有效分离猪精子RNA,试验通过精子上游法获得纯净精子样本,采用改良TRIzol法提取精子总RNA,经核酸测定仪及琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和质量,RT-PCR检测相应体细胞标记基因E-Cadherin、CD4和c-kit。结果表明:研究建立的精子RNA提取法可获得高质量的RNA,浓度约为203 ng/μL,OD260/280值为1.99,并且无其他体细胞标记基因扩增产物,可用于猪精子mRNA的研究。     

猪不同颜色皮肤组织中MLANA mRNA的表达分析

为了解MLANA mRNA在猪黑、白色皮肤中的表达差异，提取剑白香猪黑、白色皮肤组织的RNA,分别逆转录合成MLANA cDNA,以RPS18基因作为内参，采用实时荧光定量PCR检测MLANA mRNA在皮肤组织中的相对表达量。结果：MLANA mRNA在黑色皮肤中的表达量比白色皮肤高，差异极显著(P<0.01),推测MLANA基因与猪黑色皮肤的形成有关。     

关岭牛PPAP2B基因mRNA在不同组织中的表达分析

为了研究关岭牛PPAP2B基因mRNA在不同组织中的表达水平及相关功能,试验以关岭牛为实验动物,分别提取心脏、肝脏、小肠、脂肪、大腿肌、背最长肌组织的总RNA,以不同组织的总RNA为模板,逆转录合成cDNA,以GAPDH基因作为内参,应用实时荧光定量PCR技术检测PPAP2B基因mRNA在不同组织中的相对表达量。结果:关岭牛PPAP2B基因mRNA在脂肪中表达量最高,在其他组织中表达量很少甚至几乎不表达。结论:PPAP2B基因可能在牛的脂肪沉积过程中发挥作用。     

不同分化时期牛脂肪细胞抵抗素mRNA丰度变化

选取犊牛大网膜脂肪组织,进行牛前脂肪细胞的单层贴壁培养,在细胞接种4、6、8、10、12、14、16d分别提取细胞总RNA,进行RT-PCR反应,以β-actin为定量内参照,对抵抗素mRNA的丰度进行定量分析,观察在犊牛前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中抵抗素mRNA的表达规律。结果表明：在犊牛前脂肪细胞分化4～12d,抵抗素mRNA丰度逐渐降低,而分化成熟后14～16d有所回升。     

猪精子RNA提取的初步研究

实验采用Trizol一次法或试剂盒提取猪精子的总RNA,然后通过RT-PCR扩增的方法,检测精子和睾丸组织中鱼精蛋白(PRM-1)的mRNA;使用不同数量的精子,检测在本实验条件下能扩增出PRM-1带所需要的最小精子数量;通过OD260/280的测算,判断不同提取方法所得RNA的纯度;通过琼脂糖电泳得到精子RNA与睾丸、卵巢组织RNA的电泳图。实验结果表明:在使用RNA沉淀剂时,1.51×107精子可检测到PRM-1的mRNA,不使用沉淀剂则需要3.02×107精子才检测到;使用Trizol一次法提取的精子总RNA纯度较常规Mini试剂盒(W6221)高;本实验首次得到猪精子总RNA的普通琼脂糖凝胶电泳图。初步研究的结果表明,Trizol一次法可用来提取精子总RNA供进一步研究;猪精子RNA的28S和18S片段与睾丸、卵巢组织无明显差异。     

微量提取培养细胞总RNA的研究

从20世纪90年代开始,人类对基因组的研究进入到功能基因组时代,对RNA,特别是mRNA的研究已越来越受到人们的重视,因此RNA的提取技术也得到了极大的提高。本研究在对Chomlzynski介绍的异硫氰酸胍—酚—氯仿一步法进行改良的基础上,对比分析了3种微量提取培养细胞总RNA的方法,经琼脂糖凝胶电泳技术检验,发现利用水饱和酚分级法、RNA酶抑制剂—酚法提取RNA的效果较好,所得RNA适用于各种研究。     

微量元素铜对软骨细胞胰岛素样生长因子mRNA基因表达的影响

分离培养仔猪关节软骨细胞，从中提取总RNA，采用RT-PCR法扩增出关节软骨细胞中胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF—Ⅰ)的cDNA，与pMD18-T载体相连，转化JM109大肠埃希氏菌，提取质粒，经鉴定，所扩增的片段为目的片段。在此基础上培养仔猪关节软骨细胞，并在培养液中添加不同水平的铜，分别在第0、12、24、48h收集软骨细胞，提取总RNA，采用RT—PCR法扩增出IGF—Ⅰ的cDNA，以β-actin为内参，用凝胶分析系统对扩增出的cDNA进行扫描分析，计算IGF—Ⅰ mRNA基因表达的相对水平。结果，在细胞培养液中添加不同水平的铜能促进软骨细胞中IGF—Ⅰ mRNA基因表达，其中以铜浓度31．2μmol／L的效果最好。表明铜对软骨细胞的增殖作用是通过促进IGF—Ⅰ mRNA的表达来实现的。     

铜对仔猪关节软骨细胞TGF-βmRNA基因表达的影响

分离、培养仔猪关节软骨细胞，从中提取总RNA，用RT-PCR法扩增出TGF-β的cDNA，与pMD18-T载体相连，转化JM109大肠杆菌，提取质粒，鉴定所扩增片断为目的片断后，培养仔猪关节软骨细胞，并在培养液中添加不同水平的铜，分别在0、12、24、48h培养结束时，收集细胞，提取细胞总RNA。采用RT-PCR法扩增出TGF-β的cDNA，以β-actin为内参，用凝胶分析系统对扩增出的cDNA进行扫描分析，以TGF-β的cDNA的光密度值与β-actin的cDNA的光密度值之比作为TGF-β mRNA基因表达的相对水平。结果表明，细胞培养液中添加不同水平的铜能促进软骨细胞中TGF-β mRNA基因表达，其中以31．2μmol／L效果最佳。     

吉氏巴贝斯虫mRNA的磁性分离及cDNA合成

从感染吉氏巴贝斯虫的摘脾犬的红细胞内提纯虫体,用异硫氰酸胍法提取虫体总RNA,再以Poly(A)~ mRNA磁性分离系统提取mRNA.最后以NotⅠPrimer-Adaptor为引物反转录出cDNA片段.琼脂糖凝胶电泳显示,所合成的cDNA分子量范围由100到6500bP,且绝大部分大于500bP.