培养基清除结皮对蛹虫草原基形成的影响

为探讨培养基清除结皮对蛹虫草原基的形成影响,提高食用真菌蛹虫草的培养产量和品质,在无菌条件下,用无菌刀切除长满菌丝的培养基上表面部分,在温差和光周期刺激下培养,考察菌丝扭结和子实体生长情况,并检测蛹虫草子实体虫草素、虫草酸和多糖含量。结果显示培养基清除结皮组蛹虫草子实体生长快、颜色较深、易形成孢子头,其虫草素和腺苷含量显著升高(P<0.05),但虫草多糖含量变化不显著(P>0.05)。培养基清除结皮可显著地促进蛹虫草原基的形成,提高子实体产量和品质。     

发酵虫草菌质与天然虫草主要活性成分含量比较研究

用大米作为固体发酵基质,通过蛹虫草菌种发酵后制成虫草菌质,测定菌质中腺苷、虫草素、多糖等成分含量.比较人工发酵虫草菌质与天然虫草腺苷、虫草素、多糖等主要活性成分的含量.结果表明,虫草菌质中虫草素、多糖含量分别超过天然虫草的40倍和3倍.因此.人工发酵虫草菌质可以替代天然虫草应用.     

蛹虫草菌株退化特征及鉴别方法

蛹虫草菌株在继代培养和低温长期保藏过程中极易退化导致子实体产量下降,对产业造成重大影响。本研究以正常菌株、PDA斜面长期4 ℃保藏导致退化的菌株和连续继代培养的菌株为材料,观察其子实体、菌落、菌丝形态和分生孢子数量,对菌丝细胞核、线粒体、活性氧积累和芽生孢子内脂滴进行染色观察;并对菌丝中虫草素、腺苷和麦角甾醇含量进行比较分析。结果表明PDA斜面长期4 ℃保藏和连续继代培养导致的蛹虫草菌株退化表型大多数一致,即退化菌株较正常菌株子实体产量降低、菌丝粘连打结、分生孢子数量显著降低、菌丝活性氧含量升高、细胞内线粒体数量减少、芽生孢子脂滴由弥散的小脂滴融合为大脂滴。然而,在菌落见光转色方面,长期低温保藏退化菌株基本不转色,而继代培养退化菌株转色不稳定;长期保藏退化菌株菌丝细胞核数目无明显变化,继代培养退化菌株细胞核数量明显减少;长期保藏退化菌株菌丝中虫草素、腺苷和麦角甾醇含量较正常菌株降低58%、41%和70%,继代培养退化菌株麦角甾醇含量无明显变化。因此,显微观察菌丝是否出现粘连打结及氮蓝四唑NBT检测菌丝活性氧含量,操作简单、用时较短,可用于大规模生产中蛹虫草菌株退化的检测手段;线粒体和脂滴染色也可作为退化菌株的鉴别方法;而生产中常用的通过菌落见光转色判断菌株优劣的方法需要慎重。继代培养菌株第4代开始出现明显的退化特征,因此在生产中使用的菌株最好控制在继代培养3代以内。     

高活性蛹虫草菌株CMCX33子实体最佳采收时间研究

在规模化培养条件下,根据虫草素、腺苷收率确定高活性蛹虫草菌株CMCX33最佳采收时间。从不同培养时期的蛹虫草子实体性状、产量及虫草素、腺苷含量及收率等进行比较分析。试验范围内,培养65 d的菌株CMCX33子实体呈现良好的商品性状,生物学效率最高（平均生物学效率103.0%）;培养早期（35～55 d）腺苷含量呈快速累积、虫草素含量缓慢增加趋势,培养55 d时腺苷含量达到较高水平（2.42 mg/g）,随着培养时间的增加,腺苷平均含量虽然呈小幅度下降趋势,但相对稳定,培养65 d时腺苷收率最高（平均收率0.23%）;虫草素含量呈先快速增加后减少趋势,培养70 d时虫草素含量达到峰值（平均含量4.79 mg/g）,该时期菌株CMCX33子实体的生长进入衰退期,生物学效率明显下降,虫草素总收率与培养65 d的子实体相同(虫草素平均收率0.44%)。综合考虑,高活性蛹虫草菌株CMCX33最佳采收时期为65 d。明确高活性蛹虫草菌株CMCX33最佳采收时期,为其应用研究及配套栽培技术规程的建立提供参考。     

蛹虫草优良菌株的筛选

通过对5株蛹虫草的菌丝形态和生长速率、液体培养生物量和胞外多糖、人工栽培和子实体中活性物质虫草多糖和虫草素的对比研究,筛选出优良的蛹虫草菌株。试验结果表明：蛹虫草6号菌株的菌丝的生长速率比其他菌株快;液体培养生物量和胞外多糖含量明显高于其他菌株;人工栽培的蛹虫草子实体头部大,子囊壳丰富,颜色橘黄,出草整齐均匀,出草率高,子实体中虫草多糖和虫草素的含量均高于其他菌株,表明6号菌株具有较高的经济价值,是值得开发和推广的好品种。     

蓝光光照对蛹虫草子实体生长和主要活性成分的影响

光作为一种重要的环境因子,可影响真菌的生长发育、生理周期、形态变化及次级代谢产物的产生,对于蛹虫草而言,光照还是其子实体生长发育的必要条件。选择2株不同来源的蛹虫草菌株,研究了自然光照和蓝光光照条件下,其子实体生长、抗氧化酶活性和主要活性成分的变化。结果表明蓝光光照对于蛹虫草子实体产量没有明显的促进和抑制作用。自然光照条件下成熟子实体的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性显著高于蓝光光照,过氧化氢酶(catalase,CAT)活性没有明显差别,而过氧化物酶(peroxidase,POD)活性则表现出菌株差异。子实体主要活性成分方面,腺苷、甘露醇含量不受蓝光影响,类胡萝卜素在蓝光光照条件下含量极显著高于自然光光照,蓝光对子实体、虫草素、粗多糖含量的影响则存在菌株差异。研究为蛹虫草子实体的栽培条件优化,提高蛹虫草子实体质量提供依据。     

野生蛹虫草菌株培养特性及子实体多糖含量比较分析

蛹虫草(Cordyceps militaris)是一种药食两用真菌,为获得高产优质的菌种资源,以采集分离的5株蛹虫草野生菌株(XY002、XY008、XY011、XY029、XY032)为研究对象,通过对5株菌株的分子鉴定、交配型基因分子检测、培养特性及子实体多糖含量测定,确定5株菌株皆为蛹虫草菌株,除XY008只含有MAT1-1-1交配型基因外,其他菌株都含有两种交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1,5株菌株在菌丝生长速度、分生孢子数量、子实体形态、产量及子实体多糖含量均存在较大差异。综合培养特性及多糖含量分析的结果表明,菌株XY011子实体产量较高达29.60 g/瓶,多糖含量最高达100.79 mg/g,子实体长度最长达11.41 cm,而且子实体粗壮,发育周期短,确定为优势菌株,具有较好的开发价值。     

铬离子对蛹虫草子实体生物量及化学成分的影响

蛹虫草是一种具有多种生物功能的药用真菌,近年来在金属离子富集方面受到学者的广泛关注,但对蛹虫草富集Cr³⁺的能力及其相应的生理反应尚无文献报道。为此,本研究利用含有不同Cr³⁺浓度的燕麦培养基培养蛹虫草子实体,分别对蛹虫草子实体生物量及子实体中虫草素、腺苷、虫草酸、麦角甾醇、铬离子含量等指标进行了测定。结果表明,除麦角甾醇随着培养基中Cr³⁺浓度的增加而降低之外,其余指标均呈现先增加后降低的变化趋势。700 mg/L Cr³⁺处理时,子实体干、鲜重和铬离子含量达到最大值,分别比对照组增加36.85%、35.53%和202.12%;当Cr³⁺达1 500 mg/L时,虫草素和腺苷含量达到最大值,分别比对照组高94.61%和530.29%;虫草酸含量和多糖含量分别在1 100 mg/L和1 200 mg/L Cr³⁺处理时达到最大值,分别比对照组高123.62%和21.39%。本研究首次探讨了蛹虫草子实体富集Cr³⁺的能力以及Cr³⁺处理下的子实体生物量和部分次生代谢产物含量的变化规律,为进一步研究蛹虫草富集铬离子机制提供了理论依据,为富铬蛹虫草功能性食品的研发奠定了基础。     

不同来源的蛹虫草子实体活性成分的比较

通过比较不同来源的蛹虫草子实体的活性成分以探讨蛹虫草品质的差异。对17个蛹虫草菌株栽培得到的子实体及16个市售样品中的多糖、核苷类成分、游离糖醇及小分子糖类的含量进行分析测定,并比较其核苷类成分HPLC指纹图谱。结果表明,因菌株不同蛹虫草子实体的活性成分具有不同程度的差异,菌株对虫草素含量的影响最大,其次是N ⁶-(2-羟乙基)腺苷,因菌株不同虫草素含量可相差14倍,N ⁶-(2-羟乙基)腺苷的含量差异可达6倍以上。市售样品中的核苷类成分分析结果也证明了在测定的几种成分中,虫草素是含量差异最大的活性成分。17个蛹虫草菌株子实体的多糖含量为1.81%-4.92%,甘露醇含量为1.44%-4.47%,海藻糖含量为3.58%-25.43%。16个市售样品的多糖含量为2.84%-5.55%,甘露醇含量为0.96%-3.93%,海藻糖含量为1.04%-19.91%。采用数据归一化法进行子实体品质综合评价研究,结果表明菌株G7a、G10a、G15a综合品质较好,多数成分含量均大于平均值,是生产高品质蛹虫草的合适菌株。     

蛹虫草饲料添加剂的研究现状及展望

蛹虫草饲料添加剂包括蛹虫草子实体、蛹虫草培养残基、蛹虫草及其培养残基提取物、蛹虫草菌固液发酵产物、 微生物发酵蛹虫草残基等产品。蛹虫草饲料添加剂含有粗蛋白、粗脂肪、氨基酸等营养成分,以及虫草素、腺苷、多糖等活性成分,在畜禽、反刍动物、水产品等动物养殖中的应用均获得较好的 效果。对蛹虫草子实体、蛹虫草培养残基、蛹虫草及其培养残基提取物、利用蛹虫草菌及培养残基制作发酵饲料等蛹虫草饲料添加剂在动物养殖中的研究应用进行了总结,对存在的问题及发展前景进行了探讨及展望。     

蛹虫草光受体研究进展

光调控真菌的生长发育和代谢产物合成,是大多数食用菌子实体分化必不可少的环境因子。蛹虫草是一种具有重要药用价值的食用真菌,光因素对蛹虫草的分生孢子数量、生长速率、子实体发育、昼夜节律以及次级代谢产物虫草素和类胡萝卜素的合成均有较大的影响。目前,基于蛹虫草全基因组的解析和遗传操作系统的建立,已鉴定出7种光受体,white collar-1（WC-1）、WC-2、Drosophila-Arabidopsis- Synechocystis-human type cryptochromes（CRY-DASH）、CRY-2、环丁烷嘧啶二聚体光裂合酶（cyclobutane pyrimidine dimer,CPD）、VIVID（VVD）和光敏色素（phytochrome,PHY）。本文较系统地总结了上述光受体的蛋白结构特征,全面阐述了光受体介导光信号调控蛹虫草菌丝生长、子实体发育及次级代谢产物合成等方面的分子机制,并对后续研究进行了展望,为深入研究蛹虫草光受体的具体功能和相关机制提供参考。     

优良性状蚕蛹虫草的筛选及高产虫草素液态发酵条件优化

蛹虫草是重要的食药用真菌,虫草素为其主要活性成分,在抗肿瘤、抗菌、降血糖等方面具有较为突出的功效。蛹虫草菌株间的形态及环境条件差异,对菌株次级代谢产物虫草素产生影响显著。本研究对不同来源的6株蛹虫草菌株（YCC-B、YCC-C、YCC-H、YCC-W、YCC-Y、CGMCC 3.4655）,从蚕蛹体培养子实体性状,液体发酵条件（培养天数、培养方式、外源金属离子等）和传代稳定性等方面筛选优良性状菌株,提高其发酵合成虫草素的能力及稳定性。结果表明,蛹虫草菌株YCC-W在蚕蛹子实体出草及菌体液体发酵产虫草素上综合表现优良,传代稳定;液体发酵培养基中添加外源金属离子Mn²⁺作为酶的辅基,可以促进虫草素合成;采用振荡-静置相结合的混合发酵培养方式,可以避免单纯振荡培养溶氧量大、菌丝体生长旺盛,而虫草素产生不佳的问题。先振荡培养3d后静置培养至25d时,菌株YCC-W合成虫草素含量最高,可达(874.13±24.25)μg/mL,且稳定性良好。为进一步开发菌种及扩大规模生产提供参考。     

蛹虫草原基分化的差异蛋白质组学研究

蛹虫草子实体形成及发育的蛋白分子机制尚不清楚,本研究引入SWATH非标记定量蛋白质组学技术,对蛹虫草Cordyceps militaris 905菌株的菌丝体（mycelium,My）、原基（primordium,Po）、生长期子实体（developmental fruiting body,DF）和成熟期子实体（mature fruiting body,MF）进行了比较蛋白质组学分析。经搜库比对,从蛹虫草的My、Po、DF和MF中依次鉴定蛋白1 136个、1 090个、1 018个和997个（global FDR 1%）,经维恩分析后获得C. militaris 905蛹虫草表达蛋白1 578个。在此基础上,SWATH非标记技术定量蛋白1 109个。本研究获得了蛹虫草Po期与My期、DF期与Po期、MF期与DF期的差异表达蛋白,依次为115个、352个和104个,并对菌丝体分化形成原基的差异表达蛋白进行了重点解析。GO注释结果表明,Po期与My期差异表达蛋白以有机含氮类化合物代谢为主,其中AMP（活性成分虫草素合成的中间产物）从头生物合成途径富集最为显著。约1/5的差异表达蛋白参与氧化还原反应,还原酶活性的蛋白在原基中几乎都上调表达,而氧化功能的蛋白受到抑制,表明蛹虫草原基分化可能受到氧化应激的诱导。蛋白互作网络分析结果进一步表明,氧化还原反应与核苷类物质代谢相关联,可能通过影响AMP从头生物合成途径来调控虫草素的生物合成。对蛹虫草子实体系统的蛋白质组学研究和解析有利于揭示子实体形成的蛋白分子机制,为蛹虫草的基础和栽培研究提供了理论支撑。     

培养基和栽培方式对蛹虫草子实体活性成分的影响

采用麦粒（W）、麦粒加蚕蛹粉（WW）、大米（R）、大米加蚕蛹粉（RW）的配料栽培方式,以及蚕蛹（CY）活体接种栽培方式培养蛹虫草子实体,比较蛹虫草子实体中多糖及核苷、游离糖醇和小分子糖类含量。结果表明：培养基和栽培方式影响蛹虫草多糖含量及其单糖组成和分子量分布,多糖含量最高的为蚕蛹活体接种培养的处理（CY）,多糖含量为6.19%,其他处理的多糖含量仅为CY的44.4%-62.8%;蚕蛹（CY）上培养的蛹虫草子实体中核苷类成分含量最高,在麦粒上培养获得的子实体中核苷含量显著高于在大米上的处理,并且麦粒添加蚕蛹粉后培养的子实体中尿苷、鸟苷、N⁶-(2-羟乙基)腺苷含量显著上升,大米添加蚕蛹粉后培养的子实体中尿苷、虫草素、N⁶-(2-羟乙基)腺苷含量显著上升;配料栽培的4个处理,其子实体中海藻糖含量为20.07%-23.40%,蚕蛹活体接种的处理（CY）海藻糖含量显著降低,为8.41%;添加蚕蛹粉后子实体中甘露醇含量显著降低。对各成分含量的数据进行归一化处理后进行蛹虫草品质的综合评价,在蚕蛹上培养的蛹虫草综合评分最高,麦粒为主要培养基培养的蛹虫草品质好于大米为主要培养基的,且添加蚕蛹粉的处理优于未添加的处理。     

互补交配型配对诱导蛹虫草有性子实体形成

前期我们获得了优良性状蛹虫草Cordyceps militaris野生菌株W141436,其子实体虫草素含量高达3.72 mg/kg干重,子实体多糖高达6.7 g/100 g干重,但在大规模应用中发现它发生退化。针对蛹虫草人工栽培退化问题,我们提出蛹虫草子实体形成是有性生殖过程,其两种交配型发生交配是蛹虫草子实体形成的必要条件。本文基于交配型基因分子标记研究了优良性状蛹虫草野生菌株W141436的退化机制。具体地,采用单孢子分离的方法对蛹虫草野生分离株W141436的子囊孢子进行分离,得到了72个单孢菌株。进一步采用PCR方法对单孢菌株及亲本菌株进行了交配型基因类型鉴定。在72个单孢菌株中,28株为Mat1-1类型交配基因型,31株为Mat1-2类型交配基因型,13株含有与亲本相同的交配型基因。根据鉴定结果,对2株Mat1-1型(SP28、SP33)和2株Mat1-2型(SP15、SP32)菌株进行了栽培实验。结果表明,形成子实体的栽培用亲本菌株同时含有Mat1-1和Mat1-2两种交配类型基因,即只有含不同交配型基因的菌株具有发育为子实体的能力,而含同种交配型基因的菌株则不能发育为子实体。本研究为防止蛹虫草在大规模种植中退化提供了理论依据。     

我国东北及山东部分地区野生蛹虫草资源采集及观察

蛹虫草是一种重要的食药用真菌,其子座可规模化栽培。然而,栽培中菌种极易退化,成为限制其发展的重要因素,野生种质资源为蛹虫草栽培生产菌株的重要来源。本研究对东北和山东部分地区蛹虫草资源进行了持续调查,对其生态分布和宏观、微观形态等进行了系统研究。从5个地点共采集野生蛹虫草标本414份,寄主绝大多数为鳞翅目昆虫的蛹,少数为鳞翅目昆虫的幼虫和茧。野生蛹虫草子座单生或2-25根,长1-17 cm,棒状、扁平状或不规则畸形,扁平状子座常具纵沟,部分可分支;子座可从寄主头、胸和腹部各部位长出,其中以头部为主。子座地上部分长1-6 cm,颜色呈深橙黄色。可育部位长0.5-4 cm,宽1.2-6 mm,大多数与不育柄部分界明显;地下部分0.5-11 cm,其长度与腐殖质厚度相关。首次明确观察到蛹虫草菌索,菌索连接蛹体和子座,或单从子座、蛹体上长出,但不是所有野生蛹虫草都有菌索。蛹虫草菌索与子座内部的疏丝组织菌丝形态各异,菌索菌丝中间膨大。人工栽培与野外采集的子座宏观形态差异明显,但子囊和子囊孢子形态无明显差异。通过野外采集和调研,获得了大量的野生蛹虫草种质资源,为解决蛹虫草种业问题奠定基础。     

从天然蛹虫草不同部位分离菌株特性比较

以采集自泰山地区的6株野生蛹虫草为研究对象,分别通过菌核、子座组织分离和子囊孢子分离法共获得18个菌株,经ITS鉴定均为蛹虫草菌株后,进一步对18个菌株进行了菌丝生长速度、菌落形态、出草试验、主要活性物质（虫草素、腺苷、虫草多糖、β-类胡萝卜素、叶黄素）和交配型的测定分析。结果表明：在菌丝长势、出草产量和整齐度方面,从子囊孢子分离得到的菌株普遍优于组织分离菌株;而在活性物质含量方面,从子囊孢子和子座分离得到的菌株普遍优于菌核分离菌株。通过交配型测定发现,从菌核、子座和子囊孢子分离得到的18个菌株均不存在交配型缺失现象。