WT1(17AA+)剪接变异体在白血病中表达

目的：探讨不同白血病细胞株及不同亚型急性白血病患者原代骨髓细胞中WT1（17AA＋）剪接变异体的表达水平。方法：建立实时定量RT—PCR方法，检测K562、SHI、Jurkat、NB4、NB4／WT1A、NB4／WT1D等白血病细胞株及79例初诊急性白血病患者原代骨髓细胞中WT1基因和WT1（17AA＋）剪接变异体表达水平，并计算WT1（17AA＋）／WT1比值。结果：白血病细胞株K562、SHI、NB4、NB4／WT1A、NB4／WT1D中WT1基因表达水平较Jurkat、U937高2～3个对数级，且K562和NB4细胞株中WT1表达以WT1（17AA＋）剪接变异体优势表达。79例急性白血病患者原代骨髓细胞中WT1总体表达水平在0．03～34．17之间，中位数为1．02，明显高于23例对照非白血病患者（P〈0．001），其WT1（17AA＋）／WT1比值在0．30～0．93之间，中位数为0．62，WT1（17AA＋）剪接变异体表达在不同亚型急性白血病之间无统计学差异（F=0．152，P=0．979）。结论：高表达WT1的白血病细胞株及白血病患者骨髓细胞中WT1基因以WT1（17AA＋）剪接变异体优势表达，且WT1（17AA＋）剪接变异体表达在不同亚型急性白血病之间无明显统计学差别。     

NB4细胞诱导分化过程中WT1、RbAp46及IGFBP-rP1基因表达水平的变化

目的:探讨WT1、RbAp46及IGFBP-rP1基因与NB4细胞诱导分化的关系。方法:利用实时定量RT-PCR方法检测NB4细胞诱导分化不同时间点WT1、RbAp46和IGFBP-rP1基因的表达水平,并用流式细胞仪检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化。结果:随着NB4细胞向粒系终末分化,WT1、IGFBP-rP1基因的表达水平迅速下降。0.5μmol/L全反式维甲酸(all transretinoic acid,ATRA)作用0、4、8、12、24与48 h后WT1N分别为1.91、1.21、0.60、0.44、0.18与0.04;IGFBP-rP1N分别为1.10、0.80、0.54、0.28、0.17与0.15。RbAp46基因的平均表达水平则下降缓慢,分别为2.65、1.86、1.40、1.27、1.48与0.49。NB4细胞处理组WT1基因的改变分别与RbAp46和IGFBP-rP1基因的变化存在相关性(r=0.829,P=0.021;r=1,P<0.001),三者均与CD11b的变化呈负相关(r=-1.0,P<0.001;r=-0.829,P=0.021与r=-1.0,P<0.001)。结论:WT1、RbAp46和IGFBP-rP1基因的高表达可能参与了阻滞NB4细胞分化的过程。     

WT1基因异构体WTA对NB4细胞基因表达谱影响的研究

目的:探讨WT1基因异构体比例的改变对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4基因表达谱的影响。方法:用电穿孔法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的重组真核表达载体及其对照质粒pCB6 转染入白血病细胞株NB4,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株NB4/WTA。运用cDNA微阵列技术检测WT1基因异构体表达比例的转变对NB4细胞基因表达谱的影响。并用RTPCR方法验证cyclinA1及CDK7基因表达的改变。结果:转染WT1基因异构体WTA后,外源基因在mRNA及蛋白水平上稳定表达,NB4细胞中共89个细胞周期相关基因、细胞凋亡相关基因、癌基因以及细胞信号和传递蛋白等基因出现2倍以上表达水平的改变。RTPCR证实与细胞周期相关的cyclinA1基因表达上调,CDK7基因表达下调。结论:WT1基因异构体WTA表达比例增加能引起NB4细胞基因表达谱的改变,这些基因的改变可能对白血病细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为产生影响。     

WT1基因异构体比例转变对白血病细胞株NB4增殖的影响

背景与目的:WT1基因编码一个锌指转录因子,在白血病细胞中高表达并与预后呈负相关。WT1基因mRNA通过2个可变性的剪切位点产生4种不同的拼接异构体,4种异构体在表达WT1的不同组织中各以其相对稳定的比例表达,白血病细胞中WT1不同异构体表达的意义尚不清楚。本研究拟用WT1基因异构体WTA转导急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4,以探讨WT1基因异构体对NB4细胞增殖的影响及其分子机制。方法:用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的重组真核表达载体及其对照质粒pCB6 转导NB4细胞,建立WT1基因异构体表达比例改变的细胞株并用有限稀释法进行单克隆化。采用台盼蓝拒染法、MTT比色法、甲基纤维素集落形成实验及细胞周期动力学检测,了解WT1基因异构体表达比例改变对NB4细胞生长的影响。用半定量RT-PCR检测NB4细胞中p53、p21、CyclinE、CyclinD1、CyclinA1基因表达的改变。结果:WT1基因异构体能够通过电穿孔方法成功转染NB4细胞,外源基因在NB4细胞中稳定整合及表达,并通过有限稀释法将永久表达细胞株单克隆化。用台盼蓝拒染法绘制细胞生长曲线,提示转染WT1基因异构体的细胞NB4/WTA生长明显慢于对照组NB4/CMV细胞及未转染的NB4细胞,NB4/WTA细胞生长曲线平缓,在第3天达平台期(78.7±18.0)×104/ml,对照组NB4/CMV细胞及NB4细胞在第4天出现生长平台期达(146.0±21.0)×104/ml。MTT法检测细胞增殖活性,结果显示,NB4/WTA细胞在各个时间段的抑制率均高于对照组,P<0.005。甲基纤维素集落形成试验中NB4/WTA克隆形成率明显下降,集落形成抑制率为46.9%。在As2O3(终浓度0.2μmol·L-1)作用后集落形成抑制更加明显。细胞周期动力学检测提示,NB4/WTA组S期细胞比例升高。RT-PCR检查提示,NB4/WTA细胞p21、CyclinA1基因的表达较对照组升高。结论:增加外源性WT1基因异构体WTA的表达将WT1基因异构体表达的比例由 17AA/ KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能抑制NB4细胞的增殖,使其克隆形成能力明显下降。这可能与p21、CyclinA1基因表达上调,细胞周期阻滞于S期有关。     

miRNA-146a在全反式维甲酸诱导NB4细胞分化中的变化及作用

目的:检测全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导的急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia ,APL)细胞株NB4分化前后表达发生显著变化的微小RNA(miRNA),并对其靶基因进行预测及功能研究,进而探讨miRNA在APL发生中的作用机制.方法:ATRA(1 μmol/L终浓度)处理NB4细胞,分别于4、24、72和96 h时收集细胞,用miRNA基因芯片检测细胞分化前后各时间点的表达谱差异,找出其中关键的miRNA;实时荧光定量-PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR ,RFQ-PCR)(TaqMan探针)方法验证其表达,并对其靶基因进行预测;应用RFQ-PCR及Western印迹法检测靶基因及靶蛋白的表达情况.结果:miRNAs芯片检测结果显示:表达显著上调的miRNAs有8个,显著下调的有15个;其中miRNA-146a在ATRA处理NB4细胞4、24、72和96 h后的表达量,分别是处理前的0.82、0.83、0.44和0.37倍.利用TargetScan软件对其靶基因进行预测,发现TGF-β1信号转导途径中的公共调节型Smad 4是其中一个靶基因.ATRA处理后Smad 4 mRNA的表达量上调,蛋白表达水平也呈逐渐上升趋势.结论:抑制miRNA-146a的表达有可能通过上调其靶基因Smad 4的表达,恢复TGF-β1信号转导通路,在ATRA诱导APL细胞分化中发挥重要作用.     

《肿瘤》2005年第25卷索引

B 白血病N山细胞诱导分化过程中WTI(17AA+/一)剪接变异体 表达的研究(顾伟英)(1):3 STATS诱骗寡核昔酸诱导白血病K562细胞凋亡的研究(史 梅)(3):221 急性白血病早期死亡相关因素分析(林素霞)(3):262 基因多态性与成人急性白血病易感性关系的研究(张娟)(4): 346 门冬酞胺酶诱导缓解治疗急性非淋巴细胞白血病16例(尤安磊) (4):396 急性白血病患者端粒长度、端粒酶活性、端粒酶逆转录酶及TRFI 的表达和相互关系的研究(程旭)(5):488 华蟾素诱导NB4细胞调亡及其作用机制(王焰)(6):534 异咽肿瘤三维计划系统体积定量方法对鼻咽癌放射敏感…     

急性髓细胞白血病儿童Wilms瘤基因1及其剪接异构体的表达及临床意义

目的:探讨急性髓细胞白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)患儿骨髓细胞中Wilms瘤基因1(Wilms tumor gene1,WT1)及其剪接异构体WT1(17AA+)的表达及临床意义。方法:应用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative-PCR,RFQ-PCR)检测112例次AML患儿不同阶段骨髓细胞中WT1和WT1(17AA+)mRNA的相对表达量,计算WT1(17AA+)/WT1的比值,并以同期30例非白血病患儿作为对照。结果:AML初诊组患儿的WT1和WT1(17AA+)mRNA相对表达量均明显高于非白血病对照组及缓解期患儿(P<0.05)。复发组患儿的WT1和WT1(17AA+)mRNA相对表达量与初诊组和耐药组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。缓解组患儿的WT1(17AA+)/WT1比值明显低于初诊组、复发组和耐药组(P<0.05)。3例AML患儿的动态监测结果显示,临床耐药或复发患儿的WT1和WT1(17AA+)mRNA相对表达量以及WT1(17AA+)/WT1比值均呈持续高表达,或者表现为一过性下降后的再度上升。结论:WT1及WT1(17AA+)mRNA剪接异构体可能成为判断AML预后及临床治疗疗效的指标。     

全反式维甲酸诱导下NB4细胞TGF-β1信号转导途径基因表达的变化

目的:探讨全反式维甲酸(all transretinoic acid ,ATRA)诱导分化急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)过程中转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)信号转导途径基因表达的变化.方法:应用荧光实时定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)的方法检测ATRA作用于人APL细胞株NB4不同时间后TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad 2、Smad 3、Smad 4和Smad 7 mRNA表达的变化.利用共聚焦显微镜观察NB4细胞中间接免疫荧光法标记的PML RARα融合蛋白和Smad 3蛋白定位.结果:在ATRA诱导NB4细胞分化过程中, TGF β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad 2、Smad 3、Smad 4和Smad 7的表达量逐渐上升,48或72 h时表达量达到最高,然后逐渐下降,而无水乙醇对照组则无明显变化;在NB4细胞中PML-RARα融合蛋白和Smad 3蛋白有共定位现象.结论:TGF-β1信号转导途径与NB4细胞的分化密切相关,ATRA可以上调该信号转导途径中基因的表达.PML-RARα融合蛋白可以和Smad3蛋白结合.     

全反式维甲酸诱导神经母细胞瘤分化及TrkA剪接异构体表达的研究

目的:通过对NB细胞系SH-SY5Y进行体外实验,研究ATRA对NB细胞的增殖抑制与诱导分化作用,进而探讨TrkA剪接异构体在不同分化程度的SH-SY5Y细胞中的表达情况。方法:将SH-SY5Y细胞取对数生长期细胞培养分组,利用台盼蓝拒染计数活细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测TrkA三种剪接异构体的表达水平。结果:对照组活细胞数随着培养时间延长而增多,实验组中ATRA对SH-SY5Y的生长抑制作用在(0.1-10)μmol/L浓度范围内有剂量依赖关系。不同浓度的ATRA均可诱导SH-SY5Y细胞产生形态学上的变化,对照组细胞分化百分率随时间延长无明显变化,各时间段间比较,差异不显著(F=2.889,P=0.079)。TrkAⅠ/ⅡmRNA表达水平增加与ATRA浓度及作用时间呈正相关。TrkAⅢmRNA表达与ATRA浓度及作用时间呈负相关。结论:在SH-SY5Y细胞中,ATRA对细胞生长抑制作用呈明显的时间和剂量依赖关系;TrkAⅠ/Ⅱ表达与ATRA作用时间、剂量呈正相关;随着ATRA作用浓度及作用时间的增加,TrkAⅢmRNA表达降低。     

WT1基因在乳腺癌组织中表达的研究

目的探讨乳腺癌组织中WT1基因表达水平及其临床意义。方法采用实时定量RT—PCR方法,检测110例乳腺肿瘤及其邻近正常乳腺组织中的WT1基因及内参照GAPDH的表达水平,以WT1N=（WT1拷贝数／GAPDH拷贝数）×10^4计算WT1表达水平,并计算同一患者肿瘤组织与正常组织中WT1。比值,定义为T／NWT1比值,分析WT1基因表达（T／NWT1）水平与临床病理参数的关系。结果102例乳腺癌组织中WT1N明显高于其周围邻近正常乳腺组织中的表达（P〈0．01）,而8例乳腺良性肿瘤组织与其相应的正常乳腺组织中WT1N表达水平差异无统计学意义（P〉0．05）。乳腺癌组织中WT1N及其T／NWT1比值明显高于乳腺良性肿瘤组织（P〈0．01）,且T／NWT1比值与有无淋巴结转移、乳腺癌病理类型、雌激素受体（ER）状态及孕激素受体（PR）状态无相关性。WT1基因表达水平与IL-8基因表达水平具有很好的相关性（r=0．723,P〈0．01）。结论乳腺癌组织高表达WT1,乳腺癌组织中WT1表达水平可作为评价疾病进展及判断预后的指标。     

全反式维甲酸与亚砷酸联合柔红霉素对NB4细胞CD11b表达的影响

 目的　观察全反式维甲酸（ATRA）与亚砷酸（ATO）单独以及二药联合柔红霉素（DNR）诱导分化治疗过程中对NB4细胞CD11b表达的影响,及其对高白细胞血症、急性早幼粒细胞白血病（APL）分化综合征的作用。方法　采用荧光素标记的CD11b单克隆抗体,流式细胞术动态检测各组药物作用于NB4细胞24、48、72、168 h后细胞CD11b的表达状况。结果　1 μmol／L ATRA作用于NB4细胞后,CD11b表达随作用时间的延长逐渐增加,呈时间依赖性。24、48、72、168 h CD11b表达分别为（33.34±3.15）%、（55.59±5.13）%、（86.08±5.12）%、（90.69±2.69）%,在同一时间点均高于空白对照组（P＜0.01）。1 μmol／L ATO作用于NB4细胞后,随时间延长CD11b表达亦逐渐增加,但各时间点之间CD11b表达差异无统计学意义;在同一时间点CD11b表达低于ATRA组（P＜0.01）,但与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。1 μmol／L ATRA+1 μmol／L ATO作用于NB4细胞后,24、48 h CD11b表达分别为（16.92±1.05）%、（17.01±0.22）%,与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）,72、168 h CD11b表达高于空白对照组（P＜0.05）,分别为（18.81±1.40）%、（25.61±4.54）%;但在同一时间点CD11b表达均低于ATRA组（P＜0.01）。1 μmol／L ATRA+1 μmol／L ATO+1 μmol／L DNR作用于NB4细胞后,在同一时间点CD11b表达低于ATRA组（P＜0.01）;与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论　ATRA联合ATO或加用DNR诱导治疗APL,可能由于避免了APL细胞诱导分化过程中CD11b表达的增高,从而在一定程度上减少了高白细胞血症、APL分化综合征的发生。     

All-trans retinoic acid induces different immunophenotypic changes on human HL60 and NB4 myeloid leukaemias

All-trans retinoic acid (ATRA) is used to treat patients with acute promyelocytic leukaemia (APL), inducing APL cells to differentiate into abnormal neutrophils. To investigate the possible relationship between the chromosome translocation t(15;17) found in APL and ATRA treatment, the human myeloid leukaemia cell lines HL60 and NB4, that are PML-RARalpha negative and positive, respectively, were treated with ATRA and immunophenotyped using a CD antibody microarray. For HL60 cells, ATRA induced major increases in descending order of CD38, CD11b, CD45RO, CD11c, CD54 and CD36 with repression of CD117 and CD44. For NB4 cells, ATRA induced major increases in descending order of CD11c, CD54, CD11a, CD11b, CD53, CD65, CD138, CD66c and T-cell receptor alpha/beta (TCRalpha/beta), with repression of CD38 and CD9. The induction of a number of these CD antigens is consistent with the known differentiation of these leukaemias to abnormal neutrophils. Approximately half of the antigens up-regulated by ATRA on NB4 cells were adhesion molecules, including CD11a, CD11b, CD11c, CD54, CD66c and CD138, consistent with the increased adhesiveness of leukaemia cells observed for APL patients treated with ATRA. On HL60 cells, ATRA induced expression of CD38, CD43 and CD45RO and repressed CD117, while the converse was true on NB4 cells that contain chimeric PML-RARalpha. For NB4 cells, ATRA induced some remarkable increases in CD antigens not seen for HL60: CD14 (16.6-fold), CD32 (27.8), CD53 (20.5), CD65 (139), CD66c (79.7), CD126 (15.1), and CD138 (57.6). The expression of these antigens may be regulated by PML-RARalpha in the presence of ATRA. Such CD antigens could be targets for synergistic treatment of APL with therapeutic antibodies following ATRA treatment.     

辛伐他汀对NB4细胞分化与凋亡的影响

 目的　探讨磁性纳米Fe3O4颗粒（Fe3O4-MNP）联合多柔比星（ADM）对Raji细胞的影响。方法　采用MTT法检测细胞的增殖,锥虫蓝染色计数细胞的活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测p53和NF-κB的表达水平。结果　ADM及Fe3O4-MNP-ADM对Raji细胞的生长抑制率与药物浓度、作用时间呈正相关（r＝0.412,P＝0.027;r＝0.523,P＝0.014）;12、24、48 h细胞凋亡率二者分别为8.76 % 比 14.85 %、35.08 %比 44.50 %、44 %比69.4 %,差异有统计学意义（P＝0.012、0.041、0.024）;Western blot检测示ADM组与Fe3O4-MNP-ADM组NF-κB蛋白的灰度条带与内参比较分别为4.22±0.32、3.31±0.28,p53蛋白的条带灰度值分别为1.042±0.114、1.270±0.091,差异具有统计学意义（t＝-54.416,P＝0.035;t＝33.963,P＝0.047）。结论　Fe3O4-MNP联合ADM能够有效抑制Raji细胞增殖并诱导其凋亡,作用机制可能与增强p53蛋白活化、抑制NF -κB通路的激活有关。     

All-trans retinoic acid (ATRA) differentiates acute promyelocytic leukemia cells independently of P-glycoprotein (P-gp) related multidrug resistance.

Here the relationship between all-trans retinoic acid (ATRA)-resistance and P-glycoprotein (P-gp)-associated multidrug resistance (MDR) is discussed in acute promyelocytic leukemia (APL). First, the remission rates of ATRA therapy are similar in relapsed/refractory APL to the preceding chemotherapy given and in newly diagnosed APL. Second, MDR1 cDNA-transduced NB4 (NB4/MDR) cells accumulate less Rhodamine-123 (Rh123) than NB4 cells, but there is no difference in the intracellular ATRA concentration between them. PSC833 or MS209. MDR modifiers, increases the intracellular accumulation of Rh123 in NB4/MDR and APL cells expressing P-gp, but not of ATRA. Third, the expression of CD11b, the NBT reduction activity, the proportion of apoptotic cells and the morphology are not different between NB4/MDR and NB4 cells, and between APL cells expressing P-gp and not. APL cells express little P-gp, and mainly express CD33 but no CD34. Despite previous reports that ATRA-resistant APL cells express more P-gp than ATRA-sensitive ones, P-gp and ATRA-resistance seems to exist independently.     

Cyclooxygenase-1, but not -2, is upregulated in NB4 leukemic cells and human primary promyelocytic blasts during differentiation.

Cyclooxygenase (COX)-1 or -2 and specific prostaglandin (PG) synthases catalyze the formation of various PGs. We investigated the expression and activity of COX-1 and -2 during granulocyte-oriented maturation induced by all-trans-retinoic acid (ATRA) of NB4 cells, originated from a human acute promyelocytic leukemia (APL), and in blasts from APL patients. The expression of COX isoenzymes or prostaglandin synthases was also investigated in circulating granulocytes and human bone marrow. COX-1 was expressed and enzymatically active in NB4 cells and primary blasts. COX-1 mRNA and protein were induced by ATRA. COX-1 protein increased approximately 2-3.5-fold by culture day 3 in NB4 cells and primary blasts, while basal COX-2 expression was very low and unaffected by ATRA. COX-1-dependent PGE(2) biosynthesis increased during differentiation approx. 5-fold. Indomethacin and the selective COX-1 inhibitor SC-560, but not selective COX-2 inhibition, impaired NB4 differentiation, reducing NADPH-oxidase activity, CD11b and CD11c expression. The immunohistochemistry of granulocytes and myeloid precursors in the bone marrow showed a large prevalence of COX-1 as compared to COX-2. In conclusion, COX-1 is induced during ATRA-dependent maturation and appears to contribute to myeloid differentiation both in vitro and ex vivo, and COX-1 activity may potentiate the differentiation of human APL.Leukemia (2004) 18, 1373-1379. doi:10.1038/sj.leu.2403407 Published online 10 June 2004