大肠埃希菌细菌膜外蛋白A对小肠上皮细胞增殖的影响及其作用机制

目的探讨大肠埃希菌细菌膜外蛋白A(outer-membrane protein A,OMPA)对小肠上皮细胞增殖的影响及其作用机制。方法采用3种浓度的OMPA(10、20及40 ng/mL)作用于小肠上皮细胞,分别作用0、24、48和72 h,MTT法检测细胞的增殖情况。采用抑制效果最佳浓度的OMPA分别作用小肠上皮细胞0、20、40、60 min,通过Western blot法检测小肠上皮细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中ERK、JNK及p38的磷酸化情况。结果 20 ng/mL的OMPA作用48 h时对小肠上皮细胞的生长抑制程度最大,细胞生长率为(23. 12±0. 21)%。与作用0 min时比较,20 ng/mL的OMPA作用20、40及60 min时,小肠上皮细胞中p-JNK/JNK比值显著降低(P 0. 01),p-ERK/ERK及p-p38/p38差异均无统计学意义(P 0. 05);与作用20 min时比较,20 ng/mL的OMPA作用40及60 min时,小肠上皮细胞中p-JNK/JNK比值显著降低(P 0. 01),p-ERK/ERK及p-p38/p38差异均无统计学意义(P 0. 05)。结论 OMPA可抑制小肠上皮细胞的增殖,该抑制作用是通过抑制MAPK通路中JNK的磷酸化实现的。     

脂多糖对人结肠癌细胞产生β-防御素3的影响

目的分析脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对人结肠癌RKO细胞产生的β-防御素3(mouseβ-defensins-3,mBD-3)的影响。方法将不同浓度(0、10、20和40 ng/ml)的LPS作用于RKO细胞0、24、48和72 h,MTT法检测LPS对RKO细胞的最佳抑制浓度;定量RT-PCR及Western blot法检测LPS作用的RKO细胞中mBD-3的表达情况。结果 LPS对RKO细胞的抑制作用在浓度20 ng/ml、培养48 h时最佳。10、20和40 ng/ml LPS作用的RKO细胞,mBD-3 mRNA及蛋白表达水平均明显高于0 ng/ml LPS组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 LPS可以促进mBD-3的表达,为进一步研究mBD-3的产生机制奠定了基础。     

黄芩苷对大肠埃希菌的抗菌活性及其作用机制

目的探讨黄芩苷对大肠埃希菌的抗菌活性及具可能的作用机制。方法在检测黄芩苷对大肠埃希菌最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)及抑菌活力的基础上,进一步检测1倍MIC的黄芩苷对大肠埃希菌胞外乳酸脱氢酶活力、前向散射光及DNA含量的影响。结果黄芩苷对大肠埃希菌的MIC为7 mg/mL,干预2 h时即可达到抑菌活性高峰。1倍MIC的黄芩苷作用大肠埃希菌后,菌液中乳酸脱氢酶活力逐渐上升,8 h时抑菌活力高达(201. 48±19. 06)U/L。1倍MIC的黄芩苷作用大肠埃希菌2 h后,细胞体积缩小、DNA含量减少,与对照组相比,差异均有统计学意义(P <0. 05)。结论黄芩苷通过对大肠埃希菌细胞膜造成损伤而增加其通透性,使菌体物质大量外渗,从而实现其抗菌活性。     

EB病毒抑制小肠上皮细胞增殖的ERK1/2途径分析

目的分析EB病毒(EB virus,EBV)抑制小肠上皮细胞增殖的机理,初步探讨EBV导致腹泻的病理机制。方法应用EBV作用于小肠上皮细胞,作用后0、12、24、36和48 h,采用MTT法检测细胞的增殖情况,Western blot法检测细胞MAPK(磷酸化的ERK1/2、JNK、p38)通路的表达情况。结果经EBV作用36及48 h的小肠上皮细胞存活率较24及12 h显著降低,并显著低于0 h(P 0. 05);磷酸化ERK1/2的表达在36和48 h最低,显著低于其他3个时间点(P 0. 05)。结论 EBV可抑制小肠上皮细胞的增殖,且通过抑制ERK1/2磷酸化途径实现。本实验为进一步研究EBV导致腹泻的发病机理提供了参考。     

沙门菌对小鼠胃癌细胞增殖及β-防御素-2表达的影响

目的探讨沙门菌对小鼠胃癌细胞MFC增殖及β-防御素-2(mouseβ-defensin,m BD-2)表达的影响。方法将不同浓度(10、10~2、10~3和10~4个/ml)沙门菌分别作用MFC细胞不同时间(12、24和48 h)后,MTT法检测沙门菌对细胞抑制的最佳浓度及时间;TUNEL法检测不同浓度(10、10~2、10~3和10~4个/ml)沙门菌作用MFC细胞不同时间(12、24和48 h)对细胞凋亡的影响;将不同浓度(10、10~2、10~3和10~4个/ml)沙门菌作用MFC细胞4、8和12 h,定量PCR及Western blot法检测m BD-2 m RNA及蛋白水平。结果浓度103个/ml沙门菌作用24 h对MFC细胞的抑制作用明显,细胞凋亡也明显;沙门菌作用MFC细胞8 h时,m BD-2的表达量无论在蛋白还是m RNA水平均较高。结论m BD-2的表达在浓度103个/ml沙门菌作用8 h后达到最高,为进一步研究m BD-2的产生机制奠定了基础。     

大肠埃希菌O157:H7新型多重PCR检测方法的建立及其初步应用

目的建立一种能够满足现场快速检测、完全脱离实验室仪器设备的大肠埃希菌O157∶H7多重PCR检测方法。方法利用大肠埃希菌O157∶H7抗原基因保守序列fli Ch7和rfb E设计2对引物,并对Palm PCR G1-12退火温度、循环数、引物浓度及引物最佳比例进行优化,建立微量快速检测大肠埃希菌O157∶H7的多重PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行验证。取疑似病牛粪便共9份,利用粪便DNA提取试剂盒提取DNA,按照建立的PCR方法进行扩增,扩增产物经微型电泳仪电泳检测并照相。结果确定大肠埃希菌O157∶H7 PCR的最佳退火温度为54℃,循环数为25个循环,上下游引物浓度为10μmol/L,2对引物最适比为fli Ch7∶rfb E=1∶3。大肠埃希菌O157∶H7扩增产物可见625 bp(fli Ch7)和213 bp(rfb E)的特异性片段,而大肠埃希菌(ATCC25922)、猪链球菌2型、金黄葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、小肠耶尔森菌、单增李斯特菌、沙门菌的PCR检测结果均为阴性,最低扩增DNA浓度为10 pg/μl,重复扩增5次均可见目的条带。9份疑似病牛粪便样品中,共检测出7份大肠埃希菌O157∶H7阳性样品。结论建立了大肠埃希菌O157∶H7微量快速多重PCR检测方法,该方法特异性、灵敏性和重复性均良好,可在现场约1 h报告结果,对突发性传染病的防治具有重要意义。     

大肠埃希菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸

目的为大规模工业化生产S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)提供一套经济合理的生产工艺。方法将经DNA序列测定正确的SAM合成酶基因(SAMS)片段,经Eco RⅠ和NotⅠ双酶切,亚克隆至大肠埃希菌表达载体p ET-28a上,构建SAMS基因重组表达质粒p ET-28a-SAMS。将重组表达质粒转入大肠埃希菌表达宿主BL21(DE3),构建大肠埃希菌表达菌株BL21(p ET-28a-SAMS)。采用混合悬浮培养法,利用含有SAMS基因的重组大肠埃希菌BL21(p ET-28a-SAMS)中的SAM合成酶系和酿酒酵母JM-310中的ATP生物合成酶系,构建一个以葡萄糖为能源的中间偶合ATP再生系统,并对两种细胞的偶联合成比例、偶联时间、通透剂的种类及浓度、偶联缓冲液主要成分的浓度进行优化。结果经双酶切及菌落PCR鉴定证明,重组表达质粒p ET-28a-SAMS及大肠埃希菌表达菌株BL21(p ET-28a-SAMS)构建正确。大肠埃希菌BL21(p ET-28a-SAMS)与酿酒酵母的最佳偶联合成比例为4∶1,最佳偶联时间为5 h,添加5%甲苯通透效果最好,200 mmol/L磷酸缓冲液、200 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L腺苷、30 mmol/L Mg Cl2·6H2O、30 mmol/L L-甲硫氨酸为最适偶联缓冲体系。最佳偶联条件下,偶联系统中SAM的浓度最高达1.7 g/L,对照组中SAM的浓度为0.17 g/L。结论本研究建立的方法操作方便,工艺简单,为SAM的廉价生产提供了一条新的途径。     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药性分析

目的分析临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的分布情况及耐药性。方法收集吉林大学中日联谊医院临床标本中分离的221株大肠埃希菌和152株肺炎克雷伯菌,采用纸片扩散法检测抗菌素的敏感性;双纸片协同试验和纸片表型确证试验筛选并确证产超广谱β-内酰胺酶的菌株;按照美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)2005年版的标准判断结果。结果大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的敏感性最高,均达100%;对头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦和头孢西丁的敏感性也较高,均大于70%,而对氨苄西林的耐药性均大于90%。共检出产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌118株,检出率为53.4%;肺炎克雷伯菌21株,检出率为13.8%;产超广谱β-内酰胺酶的两种菌株与非产超广谱β-内酰胺酶的同种菌株相比,对抗菌素的耐药性均明显增加。结论大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌仍是产超广谱的β-内酰胺酶的主要菌株,且对常用抗菌素产生了较高的耐药性。     

大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶基因型分析

目的研究临床分离产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌医院感染的临床分布及其基因型特征,为临床合理用药治疗大肠埃希菌引起的感染提供参考依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)分别检测162株产ESBLS大肠埃希菌3种易常见的ESBLS基因TEM,SHV和CTX-M并对其标本来源和科室分布进行分析。结果ESBLS大肠埃希菌最多的科室为重外科(22.9%),可能与手术预防性用抗生素的因素有关。     

一种铜锌超氧化物歧化酶突变体的原核表达、纯化及酶活性测定

目的原核表达、纯化一种铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)突变体,并检测其酶活性。方法将经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体基因亚克隆至pET-28a载体中,构建重组表达质粒SOD1-pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达;在500 mL摇瓶培养条件下,通过改变加入Cu、Zn离子的量优化诱导表达条件;表达的重组蛋白经初步纯化后,测定酶活性。结果重组表达质粒SOD-pET-28a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为15 000,主要以可溶性形式表达;工程菌株在500 mL摇瓶培养条件下培养至10 h左右,A_(600)至3. 5左右时加入终浓度为0. 1 mmol/L IPTG、0. 2 mmol/L ZnCl_2、0. 5 mmol/L CuSO4,可获得最佳表达量(29. 2%);初步纯化获得的重组蛋白纯度为97. 32%,比活为5. 08×103U/mg。结论成功利用大肠埃希菌表达系统表达了一种经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体,初步纯化的突变体具有较好的酶活性,为进一步摸索大规模生产工艺及实际应用奠定了基础。     

ERK1/2抑制对沙门菌侵袭小鼠胃癌细胞后小鼠β-防御素-2表达的影响

目的探讨ERK1/2抑制对沙门菌侵袭小鼠胃癌(mouse forestomach carcinoma,MFC)细胞后小鼠β-防御素-2(mouseβ-defensin-2,m BD-2)表达的影响及作用机制。方法采用RNA干扰的方法抑制MFC细胞中ERK1/2的表达,并经G418筛选稳定细胞株,经RT-PCR和Western blot法检测ERK1/2基因的抑制效率。用10~3个/ml的沙门菌对干扰组及对照组(未转染)的MFC细胞分别作用4、8及12 h,通过Western blot法检测m BD-2蛋白表达及Rsk~(90)的磷酸化水平。同时采用MTT法检测沙门菌作用两组MFC细胞12、24及48 h时的生长情况。结果RT-PCR和Western blot法检测结果表明,ERK1/2基因抑制效果显著。沙门菌作用MFC细胞后4、8和12 h后,各时间点间干扰组细胞中m BD-2蛋白表达及Rsk~(90)蛋白磷酸化水平差异无统计学意义(P0.05),且均显著低于各时间点的对照组(P0.05)。沙门菌作用12和24 h,干扰组细胞的抑制率明显高于对照组(P0.05),作用48 h时,两组细胞的抑制率差异无统计学意义(P0.05),细胞几乎全部死亡,且干扰组细胞抑制率的增加速度较快,作用24 h时已达97.7%。结论ERK1/2抑制可明显降低沙门菌侵袭MFC后m BD-2的表达水平,表明ERK1/2可调控m BD-2的表达。     

牛产肠毒素性大肠埃希菌菌蜕的制备及裂解条件的优化

目的制备牛产肠毒素性大肠埃希菌菌蜕,并对裂解条件进行优化。方法将裂解质粒pHH43电转入牛肠产毒素性大肠埃希菌中,37℃培养至A_(600)值为0.6时,升温至42℃诱导裂解,制备菌蜕。同时对起始诱导A_(600)值(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2)和培养基成分含量(2/3、3/4、4/5和正常含量)进行优化,并计算裂解效率。结果在起始诱导A_(600)值为0.6,培养基营养成分为正常含量的3/4时,裂解效率最高,达99.93%。结论成功制备了牛产肠毒素性大肠埃希菌菌蜕,并对其制备条件进行了优化,为进一步开展对其免疫效果和佐剂效应等研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E0和E2蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠埃希菌中融合表达牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E0和E2基因,并进行纯化。方法采用RT-PCR法分别扩增BVDV BA株的E0和E2基因片段,通过酶切位点将二者串联并克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-E0-E2,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白E0-E2经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot分析。结果重组表达质粒pET-28a-E0-E2经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白E0-E2相对分子质量约为68 500,表达量约占菌体总蛋白的20%,主要以包涵体形式存在;纯化的融合蛋白纯度达95%,可与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应。结论在大肠埃希菌中融合表达了BVDV E0和E2蛋白,纯化后的融合蛋白纯度较高,为BVDV抗体ELISA检测方法的建立及新型疫苗的研制奠定了基础。     

分子伴侣共表达对牛成纤维细胞生长因子-2在大肠埃希菌中表达水平和生物活性的影响

目的研究分子伴侣共表达对重组牛成纤维细胞生长因子-2(recombinant bovine fibroblast growth factor-2,rb FGF-2)表达水平及生物活性的影响。方法根据大肠埃希菌密码子使用偏好性,设计合成rbFGF-2核苷酸序列全长,构建表达rbFGF-2的载体pET-15b-rbFGF-2。将编码伴侣蛋白GroES-GroEL的质粒pGro7和载体pET-15b-rbFGF-2先后转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中进行共表达。表达产物进行Western blot鉴定,经Ni-Agarose亲和层析纯化后,MTS法测定其生物学活性。结果酶切鉴定和测序结果证实,rbFGF-2基因序列与设计序列相同,且在NdeⅠ和Bam HⅠ位点连入表达载体。表达的rbFGF-2蛋白相对分子质量约21 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的37.8%,可与牛FGF-2单克隆抗体特异性结合;纯化后,SDS-PAGE检测其纯度超过95%。含有共表达系统的大肠埃希菌中rbFGF-2蛋白表达量为仅含表达载体的大肠埃希菌的2.28倍。在6.25 ng/ml浓度时,rbFGF-2蛋白具有显著的促细胞增殖作用。结论分子伴侣GroES-GroEL共表达能够显著提高rbFGF-2蛋白的表达水平及其生物活性。     

融合蛋白FliC-Pfs25在trxB和gor基因双突变大肠埃希菌中的表达

目的检测恶性疟原虫表面蛋白25(Plasmodium falciparum surface protein 25,Pfs25)与鼠伤寒沙门菌1相鞭毛蛋白(phase 1 flagellin of Salmonella enterica serovar Typhimurium,FliC)的融合蛋白FliC-Pfs25,在硫氧还蛋白还原酶基因(thioredoxin reductase gene,trxB)和谷胱甘肽还原酶基因(glutathione reductase gene,gor)双突变大肠埃希菌Origami2(DE3)中的表达。方法将含有Pfs25和FliC基因的重组质粒pET28a(+)-fliC-pfs25转化Origami2(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白FliC-Pfs25,破菌上清经Ni-Sepharose纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。将纯化的融合蛋白配制成不同的疫苗制剂免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠免疫血清中抗Pfs25抗体水平。结果融合蛋白FliC-Pfs25在Origami2(DE3)中以可溶性形式表达;纯化的融合蛋白可被两个抗Pfs25的单抗mAb 1A6和mAb 4D10识别;融合蛋白与铝佐剂结合在小鼠中激发出抗Pfs25的抗体应答,但Origami2(DE3)表达的FliCPfs25与抗Pfs25单抗的反应以及在小鼠中激发抗Pfs25抗体的能力,均弱于大肠埃希菌BL21(DE3)表达的FliCPfs25。结论融合蛋白FliC-Pfs25在大肠埃希菌Origami2(DE3)中成功获得表达,但trxB和gor两个基因的突变未显示出能够提高该融合蛋白在大肠埃希菌中的表达量。     

重组人神经生长因子在大肠埃希菌中的表达及活性测定

目的在大肠埃希菌中表达重组人神经生长因子(recombinant human nerve growth factor,rhNGF),并检测其活性。方法通过密码子优化,设计表达rhNGF的基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-hNGF,转化大肠埃希菌BL21pLyS(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的蛋白经层析纯化后,SDS-PAGE及HPLC法检测纯度,Lowry法检测蛋白浓度,TF-1细胞增殖法检测生物学活性。结果构建了融合表达rhNGF的大肠埃希菌表达系统,表达的3批外源蛋白纯化后纯度均达到100%,比活分别为5.5×10~5、6.8×10~5和7.4×10~5 IU/mg,均高于小鼠颌下腺提取的NGF标准品。结论成功表达了rhNGF,纯化后纯度高,比活强,为规模化生产hNGF提供了参考。     

应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌GapC1的大肠埃希菌

目的应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌Gap C1-150 aa(Gap C1)的大肠埃希菌,为进一步构建大肠埃希菌表面展示重组菌株奠定基础。方法根据Gen Bank中登录的gap C基因序列(GI:30348860)设计引物,以质粒p KD3、p QE30/lpp-omp A-gap C为模板进行PCR扩增、融合,获得融合片段,转化入含p KD46质粒的大肠埃希菌HB101中,利用p KD46编码的RED系统将融合片段重组入基因组中,经氨苄西林(Amp)和氯霉素(Cm)抗性筛选,获得去除p KD46质粒的重组菌(HB101LOG)。对重组菌株进行PCR、Western blot、流式细胞术、荧光显微镜及生物学特性检测。结果 PCR结果显示,重组菌株构建正确;重组大肠埃希菌HB101LOG在菌体表面表达了外源蛋白Gap C1-150 aa;激光共聚焦显微镜观察到HB101LOG可见明显的绿色荧光,HB101未见绿色荧光;重组菌株HB101LOG和HB101的生长曲线符合大肠埃希菌的生长规律。结论应用RED系统成功构建了能展示链球菌Gap C1-150 aa的大肠埃希菌重组菌株。     

犬干扰素α1基因在大肠埃希菌中的表达及其抗病毒活性的测定

目的在大肠埃希菌中高效表达重组犬干扰素α1(canine interferon alpha1,CaIFNα1)基因,并对其抗病毒活性进行初步研究。方法根据大肠埃希菌密码子的偏嗜性,人工合成犬干扰素α1成熟蛋白编码基因,同时引入大肠埃希菌EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,将改造后合成的CaIFNα1核苷酸序列定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-CaIFNα1,并进行PCR及双酶切鉴定;将鉴定正确的重组表达质粒pET-CaIFNα1转化BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗VSV病毒活性。结果重组表达质粒经PCR及双酶切鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白CaIFNα1相对分子质量约39 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的61.5%,可被鼠抗His单克隆抗体及鼠抗CaIFNα1多克隆抗体特异性识别,在MDCK细胞上呈现较高的抗病毒活性,为2.0×106U/ml。结论已成功改造了CaIFNα1基因,并在大肠埃希菌中实现了高效表达,表达产物具有较高的抗病毒活性。     

重组蛋白制品中大肠埃希菌宿主蛋白残留测定试剂盒的适用性验证

目的验证重组蛋白制品中大肠埃希菌宿主蛋白(host cell protein,HCP)残留检测试剂盒的适用性。方法对淄博云桥生物技术有限公司制备的大肠埃希菌HCP的ELISA检测试剂盒进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,同时进行基质干扰试验和稀释回收试验。采用该试剂盒及一款市售进口试剂盒分别对本公司制备的3批重组碱性成纤维细胞生长因子(recombinant basic fibroblast growth factor,rbFGF)制品原液及纯化工艺中间样品的HCP残留量进行检测。结果试剂盒可特异性检测大肠埃希菌HCP残留量;线性范围为3.33~810 ng/ml;检测限和定量限均为3.33 ng/ml;试验内变异系数(CV)和试验间CV均16%;低、中、高3个浓度样品的回收率分别为113.1%、113.7%和97.5%;原液样品基质对测定基本无影响,原液基质中DTT含量5 mmol/L对测定结果的影响在可接受范围内;原液样品在测定HCP含量时存在干扰,稀释3倍时,干扰最小;该试剂盒与另一款市售试剂盒检测3批rbFGF制品原液及纯化工艺中间样品的HCP残留量基本一致。结论该试剂盒具有良好的特异性、灵敏度、准确性、精密度和线性,可用于本公司重组蛋白制品中大肠埃希菌HCP残留的检测。     

鲎血G因子的原核表达

目的在大肠埃希菌中表达重组鲎血G因子,并检测其酶活性。方法根据大肠埃希菌偏好性优化G因子成熟肽编码序列,将G因子α亚基及β亚基克隆至原核表达载体pET32a-sumo上,分别构建pET32a-sumo/factorG-α及pET32a-sumo/factorG-β原核表达质粒,转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达;产物经Ni-NTA亲和层析,SUMO蛋白酶切割融合伴侣,获得重组目的蛋白factorG-α及factorG-β;将二者等摩尔质量重组获得复合物G,荧光底物Boc-Glu-(OBzl)-Gly-Arg-MCA检测其酶活性。结果经PCR及测序鉴定,重组质粒pET32a-sumo/factorG-α及p ET32a-sumo/factorG-β构建正确;表达蛋白均以包涵体的形式存在沉淀中,表达量占菌体总蛋白的30%及45%;纯化的factorG-α及factorG-β蛋白相对分子质量约为74 000和31 000,每1 L LB培养基酶切回收蛋白分别为0. 7和1. 7 mg。factorG-α及factorG-β蛋白与荧光底物几乎不反应,而复合物G可与荧光底物反应产生较高的荧光强度。结论成功表达了具有酶活性的鲎血G因子,为进一步探讨鲎血G因子的生物学功能及新型真菌感染检测试剂盒开发奠定了基础。