蛋白质芯片在鼠疫患者血清抗体谱检测中的应用

目的检测鼠疫患者血清抗体谱,为鼠疫的疫苗研究奠定基础。方法利用鼠疫耶尔森氏菌毒流力相关蛋白的蛋白质芯片检测鼠疫患者血清抗体谱。结果利用一个包含145个鼠疫菌毒力相关蛋白的蛋白质芯片,在鼠疫患者血清中检测到37种鼠疫菌蛋白相应的抗体。结论通过对鼠疫患者血清抗体谱的分析,寻找到新的能在人体内产生体液免疫的蛋白。     

鼠疫血清抗体谱的研究进展

目的 利用蛋白芯片技术对鼠疫血清进行检测,分析其血清抗体谱.方法 用制备好的蛋白芯片和未知的血清进行杂交后荧光检测并数据分析.结果 发现具有抗原性,免疫原性的相关蛋白.结论 通过分析血清抗体谱而得到新的具有免疫原性的蛋白作为潜在的候选疫苗组;得到新的可以用于鼠疫菌诊断的抗原,作为目前血清学检测的辅助诊断抗原;通过对系列血清抗体变化趋势以及不同种属间抗体谱的区别的分析,加深对鼠疫菌致病机制的认识.     

鼠疫菌感染兔血清抗体谱分析

目的分析鼠疫耶尔森菌感染的兔血清(鼠疫菌感染兔血清)中抗体产生的种类与规律,为了解鼠疫菌的致病机制及筛选新的疫苗亚单位提供实验依据。方法利用含有145个鼠疫菌毒力相关蛋白的蛋白质芯片检测鼠疫菌感染兔血清抗体谱,并与鼠疫菌活疫苗EV76株免疫兔血清(免疫兔血清)抗体谱比较。结果在鼠疫菌感染兔血清中共检测到41个蛋白相应的抗体,其中28个抗体在免疫兔血清中也检测到,有6个蛋白抗体只在鼠疫菌感染兔血清中检测到。结论鼠疫菌感染兔血清的抗体谱与免疫兔血清的抗体谱不完全一致,通过对鼠疫菌感染兔血清抗体谱的研究,可为深入了解细菌的致病机制及筛选新的疫苗亚单位奠定基础。     

腺鼠疫患者血清抗体谱的研究

目的检测腺鼠疫患者血清抗体谱及抗体随时间变化趋势。方法利用一包含145个鼠疫耶尔森氏菌毒力相关蛋白质的蛋白芯片检测云南腺鼠疫患者血清抗体谱及抗体随时间变化趋势。结果在腺鼠疫患者体内检测到32种蛋白相应的抗体。结论FI抗体产生的速度最快、幅度最高、持续的时间最长;YopM、YopH、YopE抗体升高不明显;V抗体在患者体内未检测到;在发病后14 d才检测到pH6抗原的抗体,3个月时抗体荧光值没有下降,可持续半年。YopD的抗体在部分患者体内明显升高,但在半年后下降到正常水平。     

肺鼠疫患者血清蛋白抗体的测定

目的 分析肺鼠疫患者血清中蛋白抗体产生的种类和机体免疫应答能力,为筛选新的疫苗亚单位提供试验依据.方法 利用蛋白微阵列技术构建蛋白芯片.对2例肺鼠疫患者发病后6个月的血清,采用蛋白质芯片(含有149个鼠疫菌毒力相关基因蛋白)技术检测血清中鼠疫蛋白抗体的种类和机体的免疫应答能力.结果 患者1血清中除了YPMT1.23c、YPMT1.86、YP00406、YP01071基因编码的蛋白没检测出相应的蛋白抗体外,其他88种蛋白均检测出相应的蛋白抗体;患者2血清中检测出43种基因编码的蛋白抗体,其他49种没有检查到.有39种基因蛋白抗体在患者1、2血清中都存在,其中有YPMT1.81c、YPMT1.84、rv10、YPCD1.31c、YPCD1.28、YPCD1.58、YPMT1.62c、YP03247共8种蛋白抗体明显升高.与正常值比较,患者1、2血清中8种蛋白抗体升高的阳性倍数分别为:109.96、176.4,20.64、17.73,16.50、7.16,23.51、7.65,46.00、25.61,4.50、8.24,5.98、5.08,23.98、4.76.结论 通过对肺鼠疫患者血清抗体测定,8种蛋白抗体不仅可作为免疫诊断的靶标,同时也是今后亚单位疫苗的研究重点.     

鼠疫耶尔森菌重要功能蛋白caf 1抗原表位的精细定位

目的完成鼠疫耶尔森氏菌重要功能蛋白caf 1的精细线性抗原表位鉴定。方法利用DNA重组技术获得重组蛋白rcaf 1,免疫新西兰兔制备抗rcaf 1多克隆抗体;使用DNA Star-protean软件及生物网站http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/预测rcaf 1的抗原表位,并通过基因工程技术获得连接KLH载体蛋白的多肽;使用ELISA方法鉴定预测的精细抗原表位。结果对鼠疫耶尔森氏菌重要功能蛋白caf 1预测的精细线性抗原表位,经ELISA法检测,其中多肽片段P1为弱阳性、P2为阳性,具有较好的免疫原性。结论针对鼠疫耶尔森菌重要功能蛋白caf 1抗原表位的预测是准确的,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗的选择提供了可靠依据。     

鼠疫耶尔森氏菌染色体上重要致病相关基因的克隆与表达

目的 在大肠杆菌中表达鼠疫耶尔森氏菌染色体编码的重要致病相关基因。方法 运用生物信息学技术对鼠疫耶尔森氏菌基因组序列信息进行分析，选定了18个与病原菌粘附、侵袭宿主细胞相关的基因为克隆与表达的目的基因。通过PCR和TA克隆技术从鼠疫耶尔森氏菌基因组中克隆了这些目的基因。上述目的基因经双酶切回收后，分别导入原核表达载体pET32a中，转化大肠杆菌BL21（DE3），用异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和Westernblot检测蛋白表达。结果 共获得14个可经IPTG诱导的高表达的重组转化子菌株。结论 上述重组转化子菌株表达的融合蛋白经进一步纯化可进行宿主感染鼠疫耶尔森氏菌后免疫应答的研究及抗体表达谱变化的研究。这些研究不仅对于鼠疫耶尔森氏菌致病机理的研究有意义，而且在鼠疫疫苗的研制上有重要价值。     

大黄抑制鼠疫耶尔森菌的基因芯片检测

目的 研究基因组芯片检测大黄抑制鼠疫耶尔森菌分子机制的方法 .方法 使用的鼠疫耶尔森菌全基因组芯片包含4005条鼠疫耶尔森菌基囚.应用液体稀释法测定大黄对鼠疫耶尔森菌的最小抑菌浓度(MIC),基因芯片表达谱实验中,大黄作用鼠疫耶尔森菌的浓度为10×MIC,作用时间为30 min,提取并纯化鼠疫耶尔森菌总RNA,反转录合成cDNA,用Cy3,Cy5染料标记后,与鼠疫耶尔森菌全基因组芯片杂交,通过芯片扫描仪获得表达谱分析结果 .应用实时定量PCR技术对芯片结果 进行验证.结果 大黄对鼠疫耶尔森菌的MIC为0.02500 kg/L.获得了大黄作用鼠疫耶尔森菌的基因芯片表达谱.大黄作用鼠疫菌的明显差异表达基凶共有498个,上渊基闪358个,下凋基因140个.结论 应用鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片可以进行大黄抑制鼠疫耶尔森菌的分子作用机制研究.     

鼠疫耶尔森氏菌外膜蛋白研究进展

耶尔森氏菌属中致病性细菌有3种，即鼠疫耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌。其中鼠疫耶尔森氏菌是致病性最强的一种。随着分子生物学的研究进展，人们对鼠疫菌有了深入的了解。鼠疫菌外膜蛋白（Yops）是近些年对鼠疫菌的基础研究内容焦点之一。国内在世界上首先发现鼠疫菌锡林郭勒高原型病原体缺少32Kd外膜蛋白和40Kd蛋白位于膜内，     

OmniLogTM微生物鉴定系统在青海高原野生型鼠疫噬菌体宿主谱检测中的应用研究

目的 采用两种微量法检测青海高原野生型鼠疫噬菌体的宿主谱,为今后噬菌体生态学研究和基于宿主范围噬菌体分类研究提供科学依据。方法 基于OmniLog^TM微生物鉴定系统微量法和微量点滴法,检测3株鼠疫噬菌体对2株鼠疫耶尔森菌(鼠疫疫苗株EV₇₆、614F)和4株非鼠疫耶尔森菌(假结核耶尔森菌PTB3、PTB5、大肠杆菌V517、小肠结肠炎耶尔森菌52302-2)的裂解情况。结果 476号、087号和072204号鼠疫噬菌体均能成功感染鼠疫疫苗株EV₇₆、614F并依赖其生长繁殖,且基于OmniLog^TM系统33℃培养48 h也能够观察到试验孔中四唑类染料颜色随着噬菌体数量的增加和宿主菌数量的减少而变淡。利用微量点滴法检测3株鼠疫噬菌体对4株非鼠疫耶尔森菌敏感性结果显示,28℃和37℃时476号鼠疫噬菌体对假结核耶尔森菌PTB5敏感,而087号和072204号对其不敏感;476号、087号和072204号鼠疫噬菌体对假结核耶尔森菌PTB3、大肠杆菌V517、小肠结肠炎耶尔森菌52302-2这3株非鼠疫耶尔...     

Serologic survey of the sentinel animals for plague surveillance and screening for complementary diagnostic markers to F1 antigen by protein microarray

Plague is a deadly infectious disease caused by the gram-negative bacterium, Yersinia pestis. In 2005, five plague patients were confirmed in the Yulong County of the Yunnan Province, China. In this study, the serologic survey of > 2,900 serum samples from domestic dogs and cats in and around the county, where human plague occurred, confirmed that domestic dogs and cats could serve as sentinel animals for plague surveillance. Meanwhile, the antibody responses in the infected dogs and cats were profiled by microarray containing 218 proteins of Y. pestis. In addition to F1, LcrV, YPCD1.28c, and YPO2118 induced humoral responses in all or most of the individuals, providing complementary candidates to F1 antigen for diagnostic markers of plague.     

云南省不同型鼠疫自然疫源地鼠疫菌生化特性比较

目的 通过对云南省不同流行地区、宿主、媒介分离出的鼠疫菌生化特性及毒力因子Pst Ⅰ的鉴定结果,比较云南省家、野鼠型鼠疫自然疫源地及新发现玉龙县鼠疫疫源地鼠疫菌生化特性的差别及疫源地相互之间的联系.方法 采用资料回顾方法,收集用试管法鉴定的云南省218株鼠疫菌生化特性(酵解鼠李糖、甘油、麦芽糖、阿胶糖、密二糖)和毒力因子Pst Ⅰ的结果,利用SAS 8.0统计软件进行汇总,采用双向无序R×C表χ2检验的Fisher确切概毕法对鉴定结果进行分析.结果 收集野鼠型鼠疫疫源地鼠疫菌48株.其中有1株发酵麦芽糖,48株均发酵甘油;收集家鼠型鼠疫疫源地鼠疫菌165株,其中有1株不发酵麦芽糖、发酵甘油,1株脱氮阴性,属变异菌株;收集玉龙县新分离鼠疫菌5株,均发酵甘油、麦芽糖.对不同疫源地鼠疫菌麦芽糖、甘油发酵试验结果进行比较,差异有统计学意义(P<0.01);对鼠疫菌鼠李糖、阿胶糖、密二糖发酵试验和毒力因子Pst Ⅰ进行比较.差异无统计学意义(P>0.01).结论 云南省不同型鼠疫自然疫源地鼠疫菌生化特性不同,其中家、野鼠型疫源地鼠疫菌生化特性有交串现象;玉龙县鼠疫菌生化特性与家、野鼠型疫源地鼠疫菌截然不同,与西藏北部旱獭鼠疫菌的生化特性接近.     

长尾黄鼠带鼠疫菌越冬实验观察

目的 通过长尾黄鼠(简称黄鼠)带鼠疫菌越冬实验,分析黄鼠是否存在带菌越冬的可能性,为探讨鼠疫菌在黄鼠体内越冬保存提供依据.方法 在2006年9月至2007年4月和2007年9月至2008年4月,于新疆乌苏古尔图鼠疫自然疫源地内,在自然条件下模拟黄鼠带菌越冬过程,按1000万个菌/鼠,将鼠疫菌注射到178只黄鼠鼠鼷部皮下,进行黄鼠人工感染.将感染鼠疫菌的黄鼠置于鼠疫疫源地内人工修建的全黑(温度:1～5℃)地下室(距离地面下2 m)内,使其与外环境的黄鼠同步自然冬眠,待次年4月自然醒眠后,观察存活黄鼠体内的带菌情况.结果 接种鼠疫菌的178只黄鼠,经过6个多月的冬眠期(当年的10月至下年的4月),醒眠后存活鼠68只,其余110只未度过冬眠期全部死亡,存活率为38.2%(68/178).未完成整个冬眠期死亡的110只黄鼠进行解剖和脏器鼠疫菌培养,67只阴性(-),43只阳性(+),阳性牢为39.1%(43/110).在这些鼠疫菌阳性鼠中,可见明显的肺充血水肿,心、肝、脾、肾及注射部位可见明显出血性炎症等病理改变;阴性鼠未见任何病理改变.完成整个冬眠期醒眠后存活的黄鼠,正常饲养20 d后处死,经解剖观察,脏器中未见任何病理改变;取心、肝、脾、肺等脏器及注射部位进行鼠疫菌培养,全部呈阴性(-);抗体检查阳性率为69.1%(47/68),抗体滴度范围主要在1:32～1:64.结论 黄鼠可以带菌冬眠,但带菌过程未能覆盖整个冬眠期,呈不完全迁延性带菌过程;完成整个冬眠期存活的黄鼠未能检出鼠疫菌,表明黄鼠不能带菌越冬.     

Protective immunity against respiratory tract challenge with Yersinia pestis in mice immunized with an adenovirus-based vaccine vector expressing V antigen

The aerosol form of the bacterium Yersinia pestis causes the pneumonic plague, a rapidly fatal disease. At present, no plague vaccines are available for use in the United States. One candidate for the development of a subunit vaccine is the Y. pestis virulence (V) antigen, a protein that mediates the function of the Yersinia outer protein virulence factors and suppresses inflammatory responses in the host. On the basis of the knowledge that adenovirus (Ad) gene-transfer vectors act as adjuvants in eliciting host immunity against the transgene they carry, we tested the hypothesis that a single administration of a replication-defective Ad gene-transfer vector encoding the Y. pestis V antigen (AdsecV) could stimulate strong protective immune responses without a requirement for repeat administration. AdsecV elicited specific T cell responses and high IgG titers in serum within 2 weeks after a single intramuscular immunization. Importantly, the mice were protected from a lethal intranasal challenge of Y. pestis CO92 from 4 weeks up to 6 months after immunization with a single intramuscular dose of AdsecV. These observations suggest that an Ad gene-transfer vector expressing V antigen is a candidate for development of an effective anti-plague vaccine.     

基于地理信息系统的青海省鼠疫菌毒力研究

目的测定青海省鼠疫自然疫源地鼠疫菌毒力,建立青海省鼠疫自然疫源地毒力基础数据。方法选取392株鼠疫菌进行毒力试验,用SPSS18．0计算各试验菌株的半数致死量（LD50）,运用地方病地理信息系统分析其空间构成。结果392株鼠疫菌中鼠疫强毒株有367株,占93．62％;鼠疫中等毒力株有10株,占2．55％;鼠疫低毒株有10株,占2．55％;鼠疫弱毒株有5株,占1．27％;发现青海省鼠疫自然疫源地祁连山型菌株毒力比青藏高原型菌株毒力强。结论青海省鼠疫自然疫源地鼠疫菌以鼠疫强毒株为主。     

基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌

目的 实现荧光定量PCR技术在鼠疫现场和基层的应用。方法 本试验将已建立的基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法应用于我国各鼠疫疫源地野生菌株的检测,进行特异性评价。选取分布于我国境内不同鼠疫疫源地野生鼠疫耶尔森氏菌株、鼠疫减毒菌株、耶尔森菌属近缘菌株假结核菌及小肠结肠炎菌进行荧光定量PCR检测。结果 55株鼠疫耶尔森氏菌及鼠疫减毒菌株扩增阳性,假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌无阳性扩增,冻干试剂在室温25 ℃和37 ℃条件下可保存6个月,敏感性与冷冻保存无差异,核酸扩增诊断可在1 h内完成。结论 应用基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法对我国各鼠疫疫源地55株鼠疫耶尔森氏菌检测呈现高度特异性,本试验冻干试剂具有可室温保存、便于运输、检测结果精准、快速等特点,具有较好的鼠疫现场应用前景。     

中国鼠疫菌某些生化特征及地理分布

目的 探讨中国鼠疫菌株生化性状及地理分布特征。方法 采用常规方法,研究我国现有11种类型的鼠疫自然疫源地2 370株鼠疫菌酵解麦芽糖、鼠李糖、蜜二糖、阿胶糖、甘油及脱氮反应的变化。结果 根据测定结果,与地理分布生物群落联系起来,可将中国鼠疫自然疫源地鼠疫菌分为新的17个生化型:青藏高原青海田鼠鼠疫自然疫源地分离的鼠疫菌定名为川青高原型,新疆准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地鼠疫菌定名为准噶尔型,云南省玉龙县大绒鼠、齐氏姬鼠分离暂定名为玉龙型。青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地生化性状较为复杂,含5种类型生化型,其中藏南地区1983年后新增加了27个疫源县,本研究发现青藏高原型菌株不仅只分部在藏北高原,在藏南地区已有分布,且岗底斯山型菌株原来只分布在西南地区的仲巴、普兰,现已延伸到藏南地区。还发现一些鼠疫自然疫源地鼠疫菌生化特性有交串现象,如云南省家、野鼠鼠疫自然疫源地鼠疫菌,内蒙古高原长爪沙鼠、达乌尔黄鼠鼠疫自然疫源地。结论 中国鼠疫菌对糖酵解特性较稳定,鼠疫菌生化型在各疫源地呈明显的地区性分布,与主要宿主、地理气候条件、植被等密切相关,分为17个生化型。