人子宫颈癌异常表达程序性死亡配体-1并促CD4+T和CD8+T细胞凋亡

目的:探讨程序性死亡配体-1(Programmed death ligand-1,PD-L1)在人子宫颈癌的表达及其与肿瘤内CD4+T和CD8+T细胞浸润的相关性,体外实验观察重组人PD-L1蛋白对宫颈癌患者外周血T细胞凋亡的影响。方法:采用免疫组化SP法检测PD-L1在10例正常人宫颈组织和67例宫颈癌组织中的表达以及死亡受体-1(Programmed death receptor-1,PD-1)在宫颈癌内浸润淋巴细胞的表达;TUNEL法检测肿瘤内浸润的淋巴细胞凋亡;免疫荧光分析宫颈癌内浸润的CD4+T和CD8+T淋巴细胞数量;流式细胞术分析PD-L1促进宫颈癌患者外周血活化CD4+T和CD8+T细胞凋亡情况。结果:正常子宫颈上皮不表达PD-L1;宫颈癌PD-L1的表达率为70%(47/67)。部分宫颈癌内浸润的淋巴细胞表达PD-1,且淋巴细胞存在凋亡现象。PD-L1阳性宫颈癌肿瘤内浸润的CD8+T细胞数量明显减少(P<0.05)。体外实验发现PD-L1与健康人或宫颈癌患者外周血活化T细胞混合培养48 h后,T细胞凋亡率明显高于空白组,2组平均凋亡率分别为(32.8±1.4)%、(38.3±1.5)%(P<0.05)和(27.7±1.3)%、(30.9±1.9)%(P<0.05);抗PD-1抗体使PD-L1诱导的T细胞凋亡率下降,分别为(29.8±1.6)%和(31.6±1.4)%(P>0.05)。PD-L1对人外周血活化CD4+T和CD8+T细胞均有促凋亡作用。结论:人子宫颈癌异常表达PD-L1与肿瘤内浸润的淋巴细胞凋亡及CD8+T细胞数量减少有关。PD-L1经PD-1促进活化的CD4+T和CD8+T细胞凋亡。     

CKMT1A对人鼻咽癌HONE1细胞铂类化疗药物敏感性的影响及机制研究

近年来鼻咽癌患者五年生存率的提升难度明显增加,对铂类化疗药物的敏感性较差是主要原因,探讨耐药机制具有重要意义。本研究将鼻咽癌细胞转染分为空载体对照组(空载体质粒)、线粒体肌酸激酶1A(CKMT1A)过表达组(CKMT1A过表达载体质粒),分别进行MTT法检测、流式细胞术检测、实时荧光定量PCR检测和Western blot检测。结果显示随着顺铂浓度的增加,CKMT1A过表达组吸光度值下降幅度更明显(P<0.01)。根据顺铂IC₅₀结果选取2 μmol/L顺铂处理细胞24 h后,两组细胞均表现为G0/G1期比例明显下降,S期和G2/M期比例明显增多。2 μmol/L顺铂处理细胞48 h后,CKMT1A过表达组细胞凋亡率明显高于空载体对照组(P<0.01);CKMT1A过表达组c-PARP、Bax相对表达量明显高于空载体对照组,BCL-2相对表达量明显低于空载体对照组(P<0.05)。2 μmol/L顺铂处理细胞6 h后, CKMT1A过表达组p-STAT3相对表达量明显高于空载体对照组(P<0.01)。过表达CKMT1A可通过细胞凋亡信号通路下调STAT3磷酸化水平,抑制靶基因表达,促进人鼻咽癌细胞株HONE1凋亡,提升对铂类化疗药物的敏感性。     

PINK1在人卵巢癌细胞系SKOV3增殖 及顺铂诱导细胞死亡中的作用

目的 研究线粒体丝苏氨酸蛋白激酶PINK1(PTEN induced putative kinase 1)在卵巢癌细胞生长增殖中的作用,及其表达在顺铂诱导细胞死亡中的作用.方法 转染并用G418筛选稳定表达pcDNA3.1-PINK1及pcDNA3.1的SKOV3细胞系,细胞设3组:正常培养组、转染空质粒pcDNA3.1组,过表达PINK1组.采用实时定量PCR检测各组细胞PINK1 mRNA的表达,MTT和流式细胞仪检测各组细胞生长增殖及细胞周期分布情况.观察PINK1在顺铂(DDP)诱导卵巢癌细胞死亡中的作用,并检测耐药基因MDR1、MRP1以及ABCG2在各处理组中的表达水平.结果 过表达PINK1的SKOV3细胞系PINK1 mRNA的表达水平显著高于正常培养组及转染空质粒pcDNA3.1组细胞(P＜0.05).过表达PINK1组较其他两组细胞增殖率显著提高,细胞进入S和G2/M期比例增加(P＜0.05).过表达PINK1显著抑制了10 μmol/L和20 μmol/L顺铂诱导细胞死亡,并诱导了耐药基因MDR1、MRP1和ABCG2的表达升高.结论 上调PINK1的表达可促进卵巢癌细胞增殖,降低细胞对顺铂作用的敏感性并诱导耐药基因的表达.     

PD-L1/PD-1通路在宫颈癌中的研究进展

程序性死亡受体1（programmed death 1,PD-1）和程序性死亡配体1（PD-1 ligand,PD-L1）共同组成T细胞介导的适应性免疫过程中的协同刺激信号通路。肿瘤发生时,T细胞表面的PD-1受体与肿瘤细胞表面表达的PD-1配体结合,通过抑制T细胞活性及其增殖、分化影响肿瘤细胞对常规治疗的耐受及肿瘤患者远期预后。据报道PD-L1在宫颈癌等多种肿瘤中过高表达,提示PD-1/PD-L1通路可能参与肿瘤的发生、发展及转归,因此阻断该通路或许成为肿瘤靶向治疗的一个具有划时代意义的创新。本文就PD-1/PD-L1信号通路的作用机制和与宫颈癌之间的关系进行综述,探讨该通路相关的免疫疗法在宫颈癌临床治疗中的意义。     

高迁移率族蛋白B1对宫颈癌细胞化学治疗敏感性的影响及其机制

目的：探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1,HMGB1)对宫颈癌细胞化学治疗敏感性 的影响及其机制。方法：采用Western印迹法检测宫颈癌细胞HeLa和CaSki经不同药物浓度顺铂处理后LC3, Beclin1及P62的表达水平,检测使用自噬抑制剂和/或顺铂处理后宫颈癌细胞HeLa和CaSki中LC3,Beclin1及P62 的表达水平;采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖水平。构建HeLa-shHMGB1,CaSki- shHMGB1,HeLa-CTR及CaSki-CTR的稳定细胞系。以CCK-8检测上述细胞系顺铂半数抑制浓度(half maximum inhibitory concentration,IC50)水平;Western印迹法检测上述细胞系中HMGB1, LC3,Beclin1及P62的表达水 平。结果：在一定浓度范围内,随着顺铂药物浓度的增加,宫颈癌细胞HeLa和CaSki中LC3及Beclin1的表达 增加,P62表达降低。与单用顺铂组相比,顺铂联合自噬抑制剂组细胞存活率更低(P<0.05)。在宫颈癌细胞 中,HMGB1的表达与顺铂药物敏感性有关(P<0.05),与LC3,Beclin1表达呈正相关,与P62表达呈负相关。 结论：HMGB1可能通过调控宫颈癌细胞内自噬的水平,影响其对顺铂的敏感性。铂类药物结合自噬抑制剂可能成为 宫颈癌治疗的新策略。HMGB1可能成为预测化学治疗药物敏感性的分子标志物。     

蛋白激酶D1甲基化对胃癌细胞株BGC-823增殖侵袭的影响

目的:检测蛋白激酶D1(PKD1)在胃癌细胞中的表达,并探讨其对胃癌细胞增殖侵袭的影响。方法:体外培养胃癌细胞系BGC-823,使用PKD1甲基化特异性阻断剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理胃癌细胞,Western Blot法检测胃癌细胞中PKD1蛋白的表达情况,MTT法检测胃癌细胞的增殖,Transwell实验检测胃癌细胞的侵袭力。结果:5-Aza-CdR作用后,胃癌细胞中PKD1蛋白表达明显增加(P<0.05),细胞增殖速度减慢,侵袭能力减弱(P<0.05)。结论:胃癌细胞中PKD1表达的下调在胃癌的发病过程中可能起重要作用,并可能与胃癌细胞增殖侵袭能力改变有关。     

甲硫氨酸饥饿通过抑制程序性死亡配体1诱导胃癌细胞凋亡

目的 研究甲硫氨酸饥饿诱导胃癌细胞凋亡的分子机制。方法 TCGA数据库分析胃癌组织中PD-L1的表达;胃癌AGS细胞分为对照组、甲硫氨酸饥饿处理组、siPD-L1处理组、甲硫氨酸饥饿联合siPD-L1处理组,CCK-8检测胃癌细胞活力,AO/EB双染检测胃癌细胞凋亡数目,流式细胞仪检测胃癌细胞凋亡率,western blotting检测胃癌细胞PD-L1、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达;Starbase数据库分析PD-L1与Bcl-2抗凋亡蛋白家族(BCL2A1,MCL1,BCL2,BCL2L1)之间的联系。结果 PD-L1在胃癌组织中高表达(P=0.0011),PD-L1的表达与胃癌G分级相关(P＜0.05);甲硫氨酸饥饿和siPD-L1能够抑制胃癌细胞存活率(P＜0.05),促进凋亡(P＜0.05),抑制PD-L1和Bcl-2表达(P＜0.05),上调促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达(P＜0.05);甲硫氨酸饥饿联合siPD-L1处理显示siPD-L1与甲硫氨酸饥饿起协同作用(P＜0.05)。PD-L1与Bcl-2抗凋亡蛋白家族之间存在正相关(P＜0.005)。结论 甲硫氨酸饥饿是通过抑制PD-L1的表达下调抗凋亡蛋白Bcl-2、上调促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达从而诱导胃癌细胞凋亡。     

干扰NOS1表达对增强宫颈癌干细胞化疗敏感性的研究

目的:探讨干扰NOS1表达对宫颈癌干细胞顺铂治疗敏感性的影响。方法:收集CASKI肿瘤干细胞与非干细胞,分为干细胞组(R组)与非干细胞组(S组),检测NOS1在两组干细胞之间的表达差异;收集干扰NOS1表达的CASKI干细胞(si-NOS1组)及转染siRNA对照序列的CASKI干细胞(si-NC组),使用MTT法检测两组干细胞对顺铂的敏感性差异;收集对数生长期的CASKI干细胞,使用顺铂、NOS特异性抑制剂以及NO供体分别进行处理,分为对照组、顺铂组、NOS1抑制剂组、NO供体组,使用流式细胞仪检测各组干细胞凋亡率以及细胞死亡率。结果:NOS1在宫颈癌CASKI干细胞中的表达水平高于非干细胞组(t=1.172,P=0.024);顺铂作用48 h后,si-NC组干细胞的半数抑制率(17.109±1.127)与si-NOS1组干细胞(14.420±0.255)比较,差异有统计学意义(t=4.03,P<0.05);对照组、顺铂组、NOS1抑制剂组、NO供体组之间的细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(χ~2=20.054,P<0.01),且两两比较显示,DDP+NOS1抑制剂组>顺铂组>NO供体组+DDP>对照组;对照组、顺铂组、NOS1抑制剂组、NO供体组之间的细胞非凋亡性死亡率比较,差异有统计学意义(χ~2=17.657,P<0.01),且两两比较显示,DDP+NOS1抑制剂组>顺铂组>NO供体组+DDP>对照组。结论:干扰NOS1的表达可增加宫颈癌干细胞对顺铂的敏感性。     

siRNA沉默膀胱癌T24细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达的研究

目的 研究siRNA对膀胱癌细胞T24 DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达的沉默作用.方法 将筛选出的siRNA转染入膀胱癌T24细胞分为空白组、脂质体组、阴性对照组和siRNA组,分别运用RT-PCR、Western blot检测转染后不同时段DNMT1 mRNA水平、蛋白水平变化.结果 筛选出的siRNA转染膀胱癌T24细胞DNMT1 24 h开始出现mRNA减少,24 h、48 h、72 h分别降至(66.05±4.87)％、(39.36±4.53)％和(40.86±4.81)％(P＜0.05).转染后24 h、48 h、72 h蛋白水平分别降至(90.21±3.68)％、(71.45±3.44)％和(67.74±3.38)％(P＜0.05).结论 siRNA能有效地沉默膀胱癌细胞T24 DNMT1的表达.     

顺铂诱导宫颈癌细胞上皮间质转化的研究

目的研究短时间应用顺铂是否会引起宫颈癌细胞株HCE1发生上皮间质转化(EMT),明确Twist1是否为调控顺铂诱导宫颈癌细胞EMT的关键转录因子。方法采用倒置相差显微镜、四甲基偶氮唑盐(MTT)法和免疫组织化学法分别从细胞形态、生长曲线和标志性蛋白E-cadherin、vimentin的表达情况。以HCE1细胞株为对照组,加顺铂组(终浓度0.1mg/L)为实验组,观察加入顺铂24、48、72、96h后,宫颈癌细胞株HCE1是否发生EMT及其时间点。采用Transwell小室实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力,免疫组织化学方法检测P糖蛋白(P-gp)蛋白表达证实EMT发生。半定量RT-PCR方法比较EMT前、后Twist1表达。结果低剂量顺铂处理HCE1 72h后,HCE1细胞形态发生EMT的改变;上皮细胞标志性蛋白细胞黏附分子(E-cadherin)表达减少、间质细胞标志性蛋白Vimentin表达增强,P-gp蛋白表达增强;对照组HCE1平均穿膜细胞数为(39.000 0±2.828 4)个,EMT组HCE1平均穿膜细胞数为(100.166 7±3.868 7)个;RT-PCR法测得Twist1/内参OD比值在对照组0.200 2±0.000 9,EMT组0.615 6±0.005 1,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论低剂量顺铂早期即可诱导HCE1发生EMT,发生EMT的HCE1细胞体外侵袭能力和耐药性增强,Twist1是调控顺铂诱导宫颈癌细胞EMT的关键转录因子。     

SPA-1通过Rap1信号通路参与疾病的发生和发展

SPA-1为一种小分子蛋白酶激活蛋白,目前在细胞及肿瘤中研究较多。在细胞中,SPA-1通过与不同的分子或者蛋白相互作用,影响Rap1三磷酸鸟苷酶活性,从而参与细胞功能的调节。在肿瘤方面,SPA-1在乳腺癌和白血病中的研究较多,大量临床研究发现SPA-1与乳腺癌有重要联系,而动物实验发现SPA-1与白血病有关,还发现SPA-1-/-的小鼠部分发生了狼疮样肾小球肾炎,猜测SPA-1在自身免疫疾病中起一定作用。但SPA-1在这些疾病中具体作用机制尚在进一步探索之中。     

Ksp-Gpx1-k1k1载体的构建及鉴定

目的 构建含有肾组织特异性启动子(Ksp-cadherin)的Gpx1与k1k1载体质粒,为下一步构建转基因动物、研究在动物模型体内表达和基因治疗提供基础.方法 以KLK1 cDNA、GPX1 cDNA、Ksp-cadherin BAC为模板,PCR扩增获得人源Gpx1、KLK1、Ksp-cadherin cDNA.PCR产物大小与预期结果一致,序列分析完全正确.选择多个相应酶切位点,分步将Ksp-cadherin、Gpx1、KLK1插入至pIRES-EGFP质粒中.构建pKSP-GPX1-IRES-KLK1重组质粒.应用酶切鉴定和序列分析方法验证所构建载体的正确性.结果 成功构建了含有Ksp-cadherin的GpX1与k1k1载体质粒.结论 该重组载体的构建为下一步构建转基因动物,研究其在哺乳动物肾组织内过表达及在移植肾缺血冉灌注损伤的基因治疗中的作用奠定了基础.     

AP1对人CD226/PTA1启动子的调控作用

目的：确定血小板／T细胞活化抗原1(PTA1)基因的转录起始点,及激活蛋白1(AP1)对PTA1启动子的调控作用．方法：采用5’-RACE方法确定PTA1基因的转录起始点;将含AP1的真核表达载体和含有PTA1启动子的荧光素酶的报告基因载体共转染人肝癌细胞系HHCC,培养48h后检测其荧光素酶活性．结果：人PTA1基因的转录起始点定位于ATG上游229bp处,AP1可以显地增强PTA1启动子P1和P2的活性,转录因子etsl对AP1上调P1和P2活性有不同的调控作用．结论：PTA1的转录起始点位于ATG上游229bp处,AP1可能参与调控PTA1的表达．     

谷胱苷肽转硫酶GSTM1、GSTT1和GSTP1基因多态性与江苏人群直肠癌易感性的关系

目的:探讨谷胱苷肽转硫酶M1、T1、P1(GSTM1、GSTT1和GSTP1)基因多态性和吸烟饮酒习惯与直肠癌易感性的关系.方法:以直肠癌患者210例,人群对照439例为研究对象,调查研究对象的生活习惯,以多重PCR技术检测GSTM1和GSTT1基因缺失,PCR-RFLP技术检测GSTP1基因单核苷酸多态(第105密码子A→G).结果:GSTM1和GSTT1基因缺失频率在病例组和对照组差异无显著性;GSTP1 A/A、A/G和G/G基因型频率分布在病例组和对照组差异无显著性;与GSTP1 A/A基因型携带者相比,G/G基因型者发生直肠癌的危险性无显著升高,调整OR值为1.11(95%CI:0.77～1.60).结论:GSTM1、GSTT1和GSTP1基因多态性与直肠癌易感性无关.     

甲型H1N1流感病案的管理

目的保护好甲型H1N1流感病案,为进行医学研究和攻关提供重要参考依据。方法针对甲型H1N1病毒流行病学特点,结合SARS病案的管理经验,甲型H1N1流感病案应实行病案消毒,设身专人管理,专柜存放,病案整份复印,作为特存病案严格规范对甲型H1N1流感病案的借阅制度。结论病案管理人员要最大限度地保护病案的完整性,维护其原貌,保障和提高病案的使用价值。     

气相色谱法测定作业场所空气中1，1-二氯-1-氟乙烷

目的建立工作场所中1，1-二氯-1-氟乙烷的分析方法。方法用活性炭管采样，二硫化碳解吸，HP—FFAP，25m×0．2mm×0．33μm石英弹性毛细管柱分离，火焰离子化检测器检测空气中的1，1-二氯-1-氟乙烷，标准曲线法定量。结果1，1-二氯-1-氟乙烷浓度在61．8—3090μg／ml范围内呈线性关系，回归方程为A=0．227089C＋0．781703，相关系数r=0．99999；方法检出限为1．4μg/ml。以750ml的采样量计算对应于空气中的浓度为1.9mg／m^3。溶液和空气中的定量检出限分别为4．8μg／ml和6．4mg／m^3。碳管的解吸效率范围为98．7％～102．3％，重复测定和平行测定的相对标准偏差（P,SD）均小于2．0％。结论建立的方法灵敏、准确，可以应用于工作场所空气中1，1-二氯-1-氟乙烷的测定。     

Sp1和Egr-1对LCRG1基因启动子转录活性的调节研究

目的:目前LCRG1基因转录调控机制不清,现拟研究Sp1和Egr-1对人LCRG1基因启动子的转录调节. 方法:利用MatInspector软件分析LCRG1基因启动子区域内潜在的转录因子结合位点,Sp1、wtEgr-1、mtEgr-1真核表达质粒与LCRG1启动子重组质粒的共转染实验,分析其对LCRG1启动子活性的影响. 结果:生物信息学提示LCRG1基因启动子区域存在Sp1和Egr-1等位点,外源性突变型转录因子Egr-1能上调LCRG1基因启动子的活性.结论:突变型转录因子Egr-1可能参与该基因的表达调控.     

多发性内分泌腺瘤综合征1型1例报告

1 病例资料 女,65岁,因＂发作性晨起心悸、抽搐15＋年,再发1h＂入院.入院前15＋年,常于凌晨无明显诱因出现心悸、大汗,继发意识丧失、抽搐,每次持续2 h～3 h,可自行缓解,无明显饥饿感,发作间期正常,入院前1 h再发类似症状.发病后体重增加约15 kg.无类似家族史.     

不孕妇女支原体感染及相关因素分析

目的 探讨女性不孕症与生殖道支原体感染的关系.方法 选择300例生育期不孕妇女分为原发性不孕症135例和继发性不孕症165例,观察支原体感染的检出情况、支原体感染与宫颈糜烂的关系和危险因素1ogistic逐步回归的分析结果.结果 原发性不孕组和继发性不孕组UU、MH及混合感染率均明显高于对照组,差异有统计学意义(χ2=4.12,P<0.01);宫颈糜烂患者支原体感染阳性率58.04%,明显高于宫颈光滑患者12.3%(χ2=3.99,P<0.01);1ogistic回归模型分析发现,继发性不孕的主要危险因素有人流、盆腔炎、输卵管病变、月经不调、子宫内膜异位症(简称E M7)、早年性交、支原体感染(宫颈分泌物U U+).结论 不孕妇女支原体感染率很高,且与宫颈糜烂密切相关.减少人流率,防治感染是降低继发性不孕的重要措施.