转反义磷脂酶Dγ基因白三叶草的获得

利用根癌农杆菌介导法将反义磷脂酶Dγ基因 (PLDγ)转入白三叶草。建立了白三叶草的继代及高频再生系统 ,对传统农杆菌侵染方法进行了改良 ,通过抗生素筛选获得大量抗性植株。对抗性植株进行了PCR和PCR Southern杂交鉴定 ,证实PLDγ基因已整合入白三叶草核基因组中。     

农杆菌介导转化小麦幼胚获得抗除草剂再生植株

采用农杆菌介导法转化小麦品种G54授粉10 d后的幼胚,经5‰和2‰ PPT筛选获得83株正常再生植株.PCR及Southern杂交检测证明其中8株再生苗为转bar基因植株,这些植株对除草剂Basta的抗性明显提高.实验结果还证明,高糖浓度的培养基对愈伤组织诱导、植株再生及生根都有显著的促进作用;在感染液和共培养基中添加乙酰丁香酮有利于转化株的筛选.     

以胆碱脱氢酶基因对小黑杨花粉植株的遗传转化

以小黑杨（Populus simoniixP．nigra）花粉植株叶片为外植体,用根癌农杆菌介导法将胆碱脱氢酶基因（betA）导入其中,将获得的4株卡那霉素抗性转基因株系进行PCR检测,结果均为阳性。用荧光定量PCR对转基因株系的betA基因转录结果检测表明,4个转基因株系均已表达外源基因,但表达量有差异。对获得的4株转基因株系及对照进行NaCl胁迫处理,当NaCl浓度为0．55％时,非转基因小黑杨花粉植株生根率为0,转基因株系生根率为80％～100％;在NaCl为0．70％～0.80％时,则转基因株系生根率也为0。4个转基因株系的甜菜碱含量显著高于未转基因对照,说明抛融基因的导入提高了转基因株系的耐盐性。     

利用根癌农杆菌和基因枪法转化获得转抗虫融合蛋白基因(Bt-CpTI)甘蓝植株

以下胚轴、带柄子叶和茎尖为外植体,利用根癌农杆菌和基因枪法将抗虫融合蛋白基因(Bt-CpTI)导人甘蓝品种“中甘8号”,得到了13株卡那霉素抗性植株。经PCR扩增反应和Southern blot分子验证表明:农杆菌介导转化下胚轴和带柄子叶来源的Ⅰ型抗性植株均为转基因植株,而农杆菌介导转化茎尖外植体得到的Ⅱ型抗性植株属“假阳性”植株,基因枪介导转化茎尖的2株Ⅲ型植株中,有1株是非转基因植株。经胰蛋白酶抑制剂活性分析和抗虫测试证明,部分转基因植株有较高的胰蛋白酶抑制剂活性和抗菜青虫能力。     

利用根癌农杆菌和基因枪法转化获得转抗虫融合蛋白基因（Bt—CpTI）甘蓝植株

以下胚轴,带柄子叶和茎尖为外植体,利用根癌农杆菌和基因枪法将抗虫融合蛋白基因（Bt-CpTI)导入甘蓝品种“中甘8号”,得到了13株卡那霉素抗性植株,经PCR扩增反应和Southern blot分子验证表明;农杆菌介导转化下胚轴和带柄子叶来源的Ⅰ型抗性植株均为转基因植株,而农杆菌介导转化茎尖外植体得到的Ⅱ型抗性植株属“假阳性”植株,基因枪介导转化茎尖的2株Ⅲ型植株中,有1株是非转基因植株,经胰蛋白酶抑制剂活性分析和抗虫测试证明,部分转基因植株有较高的胰蛋白酶抑制剂活性和抗菜青虫能力。     

甘蓝型油菜抗虫转基因植株及其抗性分析

通过油菜子叶外植体－农杆菌共培养法将苏云金杆菌杀虫蛋白基因导入甘蓝型油菜,获得抗虫的转基因植株。带有１￣２ｍｍ子叶柄的油菜子叶经农杆菌感染后,共培养２￣３天,然后转移到附加１５ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＭＳ选择培养基上筛选转化愈伤组织及不定芽。卡那霉素抗性苗相继在含２０￣５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素的选择培养基上继代培养,再转移到含２５ｍｇ／Ｌ卡那霉素的生根培养基上诱导生根。以苏云金杆菌杀虫蛋白基因为探针,进行１     

高效烟草遗传转化体系的建立及甜蛋白基因的导入

以烟草无菌茁叶片为外植体,通过根癌农杆菌LBA4404介导法,将Thamnatin基因导人烟草中,经梯度卡那霉素(Kana-mycin,Km)筛选,获得可在含75mg／L、100mg／L Km选择生根培养基上再生的抗性植株,其中部分Km抗性植株经PCR检测为阳性,转化率为31．3％,初步鉴定已成功地建立了烟草遗传转化系统,为进一步探讨甜蛋白在植物中的转化和表达情况奠定基础。     

小黑杨花药培养植株转化胆碱氧化酶基因提高耐盐性

以小黑杨(Populus simonii ×P. nigra)花药培养植株无菌苗叶片为外植体, 通过根癌农杆菌(Agrob acteriumtumefaciens)介导法将胆碱氧化酶基因(codA)导入小黑杨中, 共获得4株转化株系, PCR扩增和Southern杂交检测结果全部 呈阳性, 表明codA基因已整合到小黑杨花药培养植株基因组中。荧光定量RT-PCR检测证明, codA基因在小黑杨花药培养植株中获得表达。耐盐实验结果显示, 各转基因株系在0.6%的NaCl浓度下能够生长, 而非转基因对照小黑杨受盐害严重, 说明codA基因的导入提高了转基因植株的耐盐性。     

小黑杨转双价抗虫基因的研究

用根癌农杆菌介导的叶盘法,将蜘蛛杀虫肽与Bt基因C肽序列的融合基因导入小黑杨(Populus simonii×P.nigra),所获得的3株卡那霉素抗性再生植株进行PCR和PCR-Southern杂交检测的结果均为阳性,Southern杂交检测的结果2株为阳性.抗虫试验结果显示,3个转基因株系均具有明显的抗虫效果,能显著抑制舞毒蛾幼虫的生长发育,表现出强烈的抗虫作用.     

农杆菌介导的橡胶草遗传转化体系的建立

以橡胶草为试验材料,利用农杆菌介导法进行遗传转化研究。结果表明：50 mg/L的卡那霉素(Kan)对橡胶草的抗性芽具有很好地筛选效果,生根筛选时,Kan的适宜质量浓度为35 mg/L;最佳抑菌抗生素为羧苄青霉素（cb）,适宜质量浓度为500 mg/L,获得35株抗性试管苗,通过GUS染色及分子生物学检测,最终获得6株转基因植株,转化率为17.1%。可见,获得的橡胶草转基因植株,为橡胶草后续的遗传转化研究奠定了基础。     

博落回遗传转化体系的初步建立

博落回是一种重要且应用广泛的药源植物,市场前景广阔。现以博落回无菌苗叶片为材料,通过优化卡那霉素和头孢霉素两种抗生素的浓度,初步建立了博落回遗传转化体系,同时利用农杆菌介导法将MtDREB1C基因导入博落回,获得卡那霉素抗性植株。随机抽取50株转基因植株进行PCR鉴定,其中3株成功扩增出了目的条带,经初步统计,获得博落回阳性苗的概率是6%。实验结果表明植物基因工程技术可作为博落回遗传改良的新途径,为博落回分子育种奠定基础。     

抗菌肽基因转化厚皮甜瓜的研究

以厚皮甜瓜FY1的子叶为试材,研究不同激素组合和配比对甜瓜植株再生的影响,并用农杆菌介导法将银杏抗菌肽基因Gnk2-1转化甜瓜。结果表明:(1)甜瓜子叶的最佳愈伤组织及不定芽诱导培养基为MS+2.0mg.L-1 6-BA+0.1mg.L-1 IAA,出愈率和出芽率均达95%以上;最佳芽伸长培养基为MS+0.2mg.L-1 KT;最佳生根培养基为1/2MS+0.1mg.L-1 IAA。(2)卡那霉素对甜瓜外植体的生长和分化有明显的抑制作用,适宜的筛选压力为100mg.L-1。(3)将子叶预培养2d,在农杆菌菌液浓度OD600值为0.5左右时,侵染外植体10min左右,共培养3d,转化效率最高。(4)经PCR鉴定获得了抗性植株,抗病性鉴定显示,转基因植株对枯萎病的抗性有所增强,发病迟缓。     

反义磷脂酶Dγ基因转化毛白杨的研究

利用根癌农杆菌介导法将反义磷脂酶Dγ基因（PLDγ）转入BT-18号三倍体毛白杨。本研究建立了三倍体毛白杨的高频再生系统,对传统农杆菌侵染方法进行了改良,通过抗生素筛选获得大量抗性植株。对抗性植株进行了PCR和PCR-Southern杂交鉴定,证实反义基因,已整合入杨树核基因组中。通过对转基因植株的耐盐性鉴定,获得一批可耐0.7%NaCl的植株。 Abstract:Antisense Phospholipase Dγ（ PLDγ）gene was introduced into Populus tomentosa mediated by Agrobactrium tumefaciens.The young leaves of triploid populus were used as the material and the regeneration system of high frequency has been established.We have developed the traditional transgene method by Agrobactrium trmefaciens and obtained many transgenic plants of anti-PLDγ gene.Tests showed that the transgenic plants can grow well on the culture medium with 0.7% NaCl.     

利用农杆菌介导法将γ-生育酚甲基转移酶基因导入油菜的研究

将γ-生育酚甲基转移酶基因导入油菜,旨在提高菜油中的维生素E含量。为了使该基因在油菜种子中特异表达,采用油菜种子特异启动子BcNA1,构建了植物表达载体pBIBE。以花油五号和花油六号油菜品种子叶柄为受体,将γ-生育酚甲基转移酶基因(γ-TMT)通过农杆菌介导法转化油菜,获得了22株抗卡那霉素再生植株。经过PCR检测,其中有7株表现为阳性,初步证明γ-TMT已整合到油菜基因组中。     

农杆菌介导法获得转反义磷脂酶Dγ基因大麦

在含有反义磷脂酶Dγ基因（PLDγ）的根癌农杆菌介导下,以自然状态下生长的大麦作受体进行转基因实验。对获得的T1代种子进行抗生素筛选、PCR和PCR—Southern杂交鉴定,证实反义PLDγ基因已整合到大麦基因组中。通过对转基因植株的耐盐性鉴定,获得了一批可耐0．7％NaCl的植株。     

碱性成纤维细胞生长因子在苜蓿中的表达

为了降低bFGF(basic fibroblast growth factor)的生产成本,结合植物生物反应器的优点,就bFGF在转基因苜蓿中的表达进行了探索.将bFGF插入植物表达载体pBⅡ21中,获得了含有bFGF基因的植物表达pBIcbFGF,再将pBIcbFGF利用冻融法转到农杆菌中.利用农杆菌介导法将基因转化保定苜蓿,转基因苜蓿在TM-1培养基+20 mg/L卡那霉素(Kan)+200 mg/L特美汀(Tim)中诱导分化,在生根培养基中生根,获得再生植株.再生植株通过PCR检测、RT-PCR及Western blot证实外源基因已经在苜蓿中成功表达.获得含有目的蛋白的阳性植株.为苜蓿作为植物生物反应器生产bFGF奠定了理论及技术基础.     

杨树NL-80106转Bt基因植株的获得及抗虫性

通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒蛋白基因Bt转入杨树NL-80106(美洲黑杨×小叶杨,Populus deltoides×Populus simonii),获得了再生植株.PCR及PCR-Southernblotting的分析结果表明,Bt基因已整合到基因组中.部分转基因植株的杀虫实验表明,转基因植株B45和B64对一龄舞毒蛾(Lymantria dispar Linn.)幼虫有明显抗性,饲喂转基因杨树叶片的幼虫死亡率显著高于未转基因的对照植株.     

将抗真菌病基因导入马铃薯的研究

实验采用微束激光穿刺技术和农杆菌介导方法,将携带有Ⅰ型烟草β－１,３－葡聚糖酶基因和Ⅰ型菜豆几丁质酶基因的ｐＢＬＧＣ质粒导入马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）品种“津引８号”。微束激光穿刺技术转化中,获得了７株卡那霉素抗性再生苗,分子检测证明,其中有１株为菜豆几丁质酶基因单基因转化植株。在农杆菌介导方法中得到了１３株卡那霉素抗性再生苗,其中有３株为烟草β－１,３－葡聚糖酶基因单基因     

农杆菌介导的AtNDPK2基因转化亚麻的研究

以双亚7号亚麻为试验材料,通过农杆菌介导法,将抗性基因At NDPK2导入亚麻,并对影响遗传转化的主要因素进行了优化研究,结果表明:双亚7号培养5d苗龄的亚麻,下胚轴切成0.5 cm左右,预培养2 d后,取出放于OD 0.6-0.8的农杆菌菌液中摇动10-15 min。然后用灭过菌的滤纸吸干下胚轴表面的农杆菌,置于不含抗生素的共培养基上共培养3 d,共培养结束后将下胚轴转入含50 mg·L-1G418和300 mg·L-1Cef的下胚轴分化增殖的筛选培养基中进行分化增殖。获得抗性植株6株,PCR检测表明有4株阳性植株,转化率为66.67%,初步表明At NDPK2基因已导入亚麻中。     

反义磷脂酶Dγ基因转化小麦的研究

目的:获得抗寒、耐盐等能力增强的小麦新种质或新品种。方法:利用穗茎注射法将含有反义磷脂酶Dγ基因(PLDγ)的根癌农杆菌菌液注入到春小麦富硒乌麦旗叶鞘内,T1代经田间表型选择筛选到10株变异株,通过特异PCR扩增和Southern杂交技术对获得的变异株进行分子检测,并对转基因植株进行耐盐性鉴定。结果:变异株均扩增出大小为430bp的目的片段,Southern印迹结果与其一致,证实反义PLDγ基因已经整合到小麦的核基因组中;6株转基因植株的抗寒力比对照显著增强,4株的熟期提早3～4d;在室内耐盐性筛选中,2株变异植株耐NaCl的能力比对照有不同程度的提高。结论:反义PLDγ基因在提高小麦的抗寒、耐盐性上具有很大的应用价值。