肠上皮细胞中性氨基酸载体B0AT1的真核表达及稳定转染体系的建立

目的: 构建可表达人中性氨基酸载体B0AT1基因的真核表达载体,建立重组质粒转染的Hela细胞系,筛选出稳定表达人B0AT1的细胞株. 方法: 提取人正常小肠上皮细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出B0AT1基因片段,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后,将其插入至真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-B0AT1,转化E.coli DH5α菌株感受态细胞,将阳性克隆脂质体法转染Hela细胞,经G418筛选获得稳定表达株,用RT-PCR法检测B0AT1基因的mRNA表达. 结果: 从小肠上皮细胞中成功克隆到人B0AT1基因.酶切和序列测定表明已成功构建真核表达载体pcDNA3.1-B0AT1,将此重组质粒转染的Hela细胞,可稳定表达人B0AT1基因,并筛选出稳定表达B0AT1的Hela细胞系.氨基酸摄取实验证实,转染pcDNA3.1-B0AT1的Hela细胞具有B0AT1基因的生物学活性. 结论: 重组人中性氨基酸载体B0AT1克隆成功,并在Hela细胞中获得稳定表达.     

HO-1真核表达质粒的构建及在肾小管上皮细胞中的表达

[目的]构建HO-1基因真核表达质粒,转染大鼠肾小管上皮细胞,检测其在细胞中的表达效果.[方法]从大鼠肾组织中提取总RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增大鼠HO-1基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )中,运用脂质体将重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1转染大鼠肾小管上皮细胞,通过RT-PCR和Western blot分析HO-1基因细胞转染及表达的效果. [结果]成功构建了HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1.RT-PCR及Western blot分析显示,HO-1基因能转染大鼠肾小管上度细胞并在细胞内有效表达. [结论]HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1的成功构建及其在肾小管上皮细胞中的有效表达为深入研究其生物学作用奠定了基础.     

端粒和端粒酶相互作用蛋白在真核细胞中的表达

目的从人肝癌细胞系HepG2中获得PinX1基因,构建真核表达载体,转染Hek293细胞。方法采用RT-PCR技术从HepG2中扩增PinX1,克隆入真核表达载体pcDNA3,重组质粒转染Hek293细胞,免疫组化法检测蛋白的表达。结果RT-PCR方法扩增获得PinX1基因,构建真核表达载体pcDNA3-PinXl-vsv重组质粒转染Hek293细胞,免疫组化检测结果表明在细胞核内有PinX1表达。结论成功获得PinX1基因,构建的重组载体可在Hek293细胞内表达,为探索PinX1在端粒、端粒酶调控中的作用机制奠定基础。     

潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:采用基因工程技术,将转化生长因子β前体相关蛋白(LAP)通过基质金属蛋白酶(MMP)水解部位与人可溶性TNFⅠ型受体(hsTNFRⅠ)连接,构建pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白真核表达载体,获得LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白。方法:将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3.1( ),得到pcDNA3.1/MMP重组体;将TGF-β1的LAP段和hsTNFRⅠ与MMP水解部位连接,获得pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ真核表达载体。测序鉴定后,脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果:酶切及测序结果证实pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ重组载体构建成功,转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论:成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ,并获得融合基因的瞬时表达,为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

人类免疫缺陷病毒I型Tat真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类免疫缺陷病毒Tat基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1 Tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Western Blot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,RT-PCR和Western blot方法证实该质粒能在huh-7真核细胞中有效表达HIV-1 Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1 Tat基因的真核表达质粒载体,并在huh-7中表达,为在huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。     

人乳腺珠蛋白基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.[方法]利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM.将重组载体用脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达.[结果]成功扩增hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达.[结论]hMAM基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据.     

大鼠转化生长因子β3基因的克隆及其转染肝星状细胞后的表达

目的:克隆大鼠转化生长因子β3(TGFβ3)基因并研究其转染肝星状细胞(HSC)后的表达情况。方法:采用逆转录—聚合酶链式应(RT-PCR)从大鼠成骨细胞中扩增出特异性片段,经酶切鉴定证实为大鼠TGFβ3cDNA,将此片段插入pcDNA3.1(+)表达载体,构建得到pcDNA3.1(+)-TGFβ3重组质粒。应用阳离子脂质体介导的基因转移技术将TGFβ3表达载体导入大鼠HSC,24 h、48 h、72 h后用荧光定量PCR法进行瞬时表达的检测。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-TGFβ3经限制性内切酶NheI、XbaI酶切,电泳后显示的TGFβ3目的片段和5.4 kb的pcDNA3.1(+)载体片段,测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGFβ3全长序列相同,证实pcDNA3.1(+)-TGFβ3真核表达载体构建成功,转染48 h后,肝星状细胞的表达明显增高(P0.05)。结论:重组TGFβ3真核表达载体构建正确,并在转染大鼠HSC48 h后获得高效表达,为转基因治疗肝纤维化疾病提供理论依据。     

人乳腺珠蛋白基因疫苗的构建及其免疫原性研究

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因重组质粒pcDNA3.1-hMAM,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM。将重组载体脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA检测目的基因的表达。结果:成功扩增hMAM基因,酶切测序表明,重组质粒含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM基因疫苗构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒构建与表达

[目的]构建大鼠源卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒,进行表达。[方法]以卡氏肺孢子虫DNA为模板,应用PCR扩增MSG基因片段,连接至pGEM-T Easy载体,再克隆至PCDNA3.1( )载体。构建的重组表达质粒经酶切、PCR鉴定后转染至COS-7细胞,并进行大量增殖。RT-PCR验证转染基因的表达。[结果]重组表达质粒PCDNA3.1( )/MSG经酶切及PCR鉴定结果表明构建成功。RT-PCR结果显示MSG基因片段成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达。[结论]成功构建了PCDNA3.1( )/MSG重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究打下基础。     

TPT1真核表达载体的构建及在肝癌细胞系SMMC-7721中的表达

目的：构建TPT1真核表达载体，并转染肝癌细胞系SMMC-7721，为进一步研究奠定基础。方法：通过PCR的方法在TPT1 ORF（open reading frame，开放读码框）两侧添加EcoRI和BamHI的识别序列，将其定向插入真核报告表达载体pEGFP-N3中，构成pEGFP-N3TPT1重构体，卡那霉素筛选阳性克隆，碱裂解法抽提质粒，Sanger法测序，VeeScreen和BLAST分析测序结果，lipofeetAMINE转染肝癌细胞系SMMC-7721，荧光显微镜及RT-PCR方法检测表达效率。结果：成功扩增了带有特异性核酸内切酶识别位点的TPT1 ORF片段，双酶切后连入pEGFP-N3，测序结果证明，rPT1正确插入pEGFP-N3中，转导SMMC-7721后，在荧光显微镜下，可见细胞发出明亮的绿色荧光，转染效率在30％左右。RT-PCR分析显示，pEGFP-N3TPT1转导的细胞，TPT1 mRNA水平较对照高0．78倍（P〈0．05）。结论：成功构建了TPT1的真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1，pEGFP-N3TPT1可在SMMC-7721细胞内高效表达。     

两元腺病毒载体系统转移bax基因诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的：采用两元腺病毒载体系统，介导bax基因转移至培养的肝癌细胞SMMC－7721，探讨腺病毒介导转移bax基因抗肝癌的活性。方法：常规方法在293细胞中扩增腺病毒Ad/GT-Bax和Ad/PGK-GV16,CsCl密度梯度离心法纯化病毒后测定病毒滴度。结果：（1）Bax蛋白表达情况：感染Ad/GT-Bax和Ad/PGK-GV16的SMMC－7721细胞，其在24、48和72小时的Bax蛋白表达量依次为阴性对照细胞的2．5、3．1和3．9倍；（2）PI染色后，感染Ad/GT-Bax和Ad/PGK-GV16的SMMC－7721细胞出现亚二倍体峰，该峰面积占总面积的值在24、48、72小时时依次为31．65％、50．44％和61．81％。结论：两元腺病毒载体系统介导转移Bax基因可诱导人肝癌SMMC－7721细胞凋亡，可望成为治疗肝癌的有力工具。     

肾综合征出血热病毒核酸的免疫研究

目的编码NP的S基因进行病毒核酸的免疫研究.方法进行实验动物的DNA免疫,细胞因子的测定,淋巴细胞增殖反应测定,免疫鼠血清的抗核蛋白NP抗体的测定.结果蛋白在Vero-E6细胞中的瞬时表达.免疫鼠细胞因子：接种pcDNA3.1＋S的鼠IL-4的产生和IFN-γ的产生均较对照组要高.细胞增殖反应：阳性对照刀豆蛋白A（ConA）刺激组的增殖指数为2.1,对照空载体增殖指数较低为0.797,而实验组pcDNA3.1＋S接种组和pcDNA3.1＋S（ISS）接种组的增殖指数分别为1.43和1.67.免疫鼠血清特异性抗体的检测：接种pcDNA3.1＋S（ISS）免疫鼠的血清抗体水平较接种pcDNA3.1＋S免疫鼠的血清抗体水平升高明显.而空载体pcDNA3.1＋接种组的小鼠血清抗体水平低.结论肾综合征出血热（HFRS）病毒编码NP的S基因作为病原体的抗原基因进行的核酸免疫,可以起到免疫保护作用.     

hMAM与人HSP70融合基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)与人热休克蛋白70(hHSP70)融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,经酶切测序分析后,与人HSP70基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建了融合基因真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70。将重组载体电穿孔法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果:成功扩增了人HSP70基因与hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM与人HSP70的融合基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM与人HSP70融合基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

Humoral immunoreaction induced by TCR DNA vaccine for beta chain of T cell lymphoma

We exploited the humoral immunoreaction of mice induced by TCR DNA vaccine of beta chain of T cell lymphoma. The plasmids of pcDNA3.1/TCR V beta 8 was constructed. The BALB/c mice were randomly divided into four groups which were pcDNA3.1, pcDNA3.1/TCR V beta 8, pcDNA3.1/TCR V beta 8 + CpG + liposome and phosphorothioate CpG groups with six mice in each group. Vaccines were injected in bilateral musculus quadriceps femoris of mice in the 0, second, and fourth week, respectively. The antibody formation was tested by indirect immuofluorescence in the 0, second, fourth, sixth and eighth weeks, respectively, before and after immunization. Production of antibody against TCR V beta 8 antigen was observed in the groups of pcDNA3.1/TCR V beta 8 and pcDNA3.1/TCR V beta 8 + CpG + liposome. The antibody titer began to rise in the fourth week and attain the maximal value in the sixth week. The antibody titer in the group of pcDNA3.1/TCR V beta 8 + CpG + liposome was higher than that in the group of pcDNA3.1/TCR V beta 8 in the fourth and eighth weeks (both P<0.01); the antibody titer in the group of pcDNA3.1/TCR V beta 8 + CpG + liposome was markedly higher than that in the group of pcDNA3.1/TCR V beta 8 in the sixth week (P<0.001). The result indicate that TCR V beta 8 antigen can induce formation of special antibody in mice. CpG and liposome can improve the humoral immunoreaction induced by TCR V beta 8 gene vaccine.     

不同端粒酶抑制剂对肝癌细胞端粒酶活力的影响

目的通过多种端粒酶抑制剂同时作用于人肝癌SMMC-7721细胞,比较各种端粒酶抑制剂抑制癌细胞端粒酶活力的效果。方法利用针对端粒酶RNA的反义寡核苷酸(ASODN)和正义寡核苷酸(NODN),针对端粒酶催化亚基的反义寡核苷酸(HASODN)和正义寡核苷酸(HNODN),以及没食子酰表没食子儿茶素(EGCG),3’-叠氮3’-脱氧胸苷(AZT),全反式维甲酸(ATRA),盐酸阿酶素(ADM)作用于人肝癌SMMC-7721细胞株,实时荧光定量端粒重复序列扩增法(real-timefluorescentquantitativeTRAPassay,FQ-TRAP)检测端粒酶抑制剂作用后SMMC-7721细胞端粒酶活力变化。结果FQ-TRAP法可检测到102个细胞的端粒酶活力,ASODN、NODN、HASODN、HNODN、EGCG、AZT、ADM、ATRA作用于SMMC-7721细胞后,与对照组比较,癌细胞的端粒酶活力均受到抑制(P<0.05),其端粒酶活力的下调率分别为93.30%、43.44%、41.02%、39.26%、58.15%、48.93%、24.44%和53.49%。结论FQ-TRAP法可快速、简便及定量检测人端粒酶活力。ASODN,EGCG抑制SMMC-7721细胞端粒酶活力的效果较明显。     

结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3-Rv3873，并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆至原核载体pGEx-4T-1中，经测序鉴定后，将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组子pcDNA3．1-Rv3873，通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100％，限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3．1（＋）中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体，为进—步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。     

沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位基因的免疫原性研究

目的 构建包含沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(major outermembrsne protein,MOMP)多表位基因的真核表达质粒PcDNA3.1-Ct MOMP168,检测其诱导BALB/c小鼠产生Ct MOMP特异性体液和细胞免疫反应的水平.方法 构建包含Ct MOMP多表位基因的重组质粒PcDNA3.1-Ct MOMP168并以肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠,同时设置pcDNA3.1组和PBS组对照(每组12只,每只100μg/次).采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳酸脱氢酶释放法及细胞内细胞因子染色-流式细胞术(ICS-FACS)分别检测免疫小鼠血清中Ct MOMP特异性抗体的滴度及其抗体亚型、脾脏中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性及特异性分泌细胞因子,如γ-干扰素-(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)等的CD3+T细胞的水平.结果 同pcDNA3.1(A490=0.180±0.025)和PBS免疫(A490=0.110±0.015)相比,PcDNA3.1-Ct MOMP168免疫可刺激小鼠产生高效价Ct特异性IgG抗体(A490=0.973±0.136;血清滴度1:1000),且抗体亚型以IgG2a为主,差异有统计学意义(F=106.884,P<0.05);pcDNA3.1-Ct MOMP168免疫组小鼠脾细胞中CTL杀伤活性(41.71%±8.34%)高于pcDNA3.1组(18.40%±3.45%)和PBS组(14.50%±2.42%),差异有统计学意义(F=22.315,P<0.05;效靶比为50:1);pcDNA3.1-Ct MOMP168免疫组小鼠的脾细胞中Ct MOMP特异性CD3+IFN-γ+T细胞的水平(1.15%±0.16%)高于pcDNA3.1组(0.12%±0.08%)和PBS组(0.09%±0.03%),差异有统计学意义(F=99.638,P<0.05),而PcDNA3.1-CtMOMP168组IL-4+CD3+T细胞(0.13%±0.08%)和IL-10+CD3+T细胞(0.14%±0.08%)的水平与pcDNA3.1(0.07%±0.05%,0.13%±0.06%)和PBS(0.08%±0.04%,0.07%±0.04%)组比较差异无统计学意义(F值分别为0.886、1.112,P值均>0.05).结论pcDNA3.1-Ct MOMP168重组质粒能诱导BALB/c小鼠产生Ct MOMP特异性的体液免疫和细胞免疫应答.     

恶性人脑胶质瘤的HSV-Tk/GCV自杀基因治疗系统的构建及应用研究

目的构建恶性人脑胶质瘤细胞株TJ899的单纯疱疹病毒的胸腺激酶/丙氧鸟苷（HSV-Tk/GCV）自杀基因治疗系统，探讨该体系在脑胶质瘤治疗中的作用。方法采用PCR、RT-PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建由自杀基因pcDNA3.1（-）CMVTK表达载体；用脂质体介导法将pCMVTK质粒转染进入TJ899恶性人脑胶质瘤细胞，并用M IT法检测感染后细胞对（GCV）的敏感性。结果pCMVTK质粒经测序证实含有TK目的基因；脂质体介导Pcmvtk质粒成功转染了TJ899细胞，并在体外实验研究中显示很好的治疗效果。结论建立了作用于恶性人脑胶质瘤细胞株TJ899的HSV-Tk/GCV自杀基因治疗系统，为脑胶质瘤的临床研究打下了基础。