犁头霉11α-羟基化制备16β-甲基-11α，17α，21 三羟基孕甾-1，4 二烯 3，20 二酮

选育到一株对16β-甲基-17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯3,20-二酮(Ⅱa)11α-羟基化活性强的犁头霉A28菌株,并发现底物21乙酰化(Ⅱb)可明显提高11α-羟基化的能力。在适宜的转化条件下,Ⅱb投料浓度0.5%,产物16β-甲基-11α,17α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯3,20-二酮(Ⅲ)收率为73%,结构经波谱分析确认。     

微生物学方法制备16α-甲基-11α，17α，21-三羟基孕甾-1，4-二烯3，20-二酮

本文报道了简单节杆菌A69-2和球孢白僵菌AS69同时存在下对16α-甲基-17α-羟基孕甾-4．烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(16MRSA)的协周转化作用。 这种协同转化怍用既能解除16α-甲基-11α,17a,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮(16MllaHC)对球孢白僵菌AS69的11α羟化酶的抑制作用,又可降低高浓度的16M11aHC对节杆菌A69—2脱氢酶活性的影响,同时还能抑制节杆菌脱氢过程的副反应。在底物浓度为0.15％(W／V)时,l6α-甲基-11α,17a,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(16MDHC)的收率约50%,故是制备1 6MDHC的一种理想的微生物学方法。     

新月弯孢霉AS 3.4381对新型甾体底物C11β-羟基化

应用本实验室保藏的新月弯孢霉Curvularia lunataAS 3.4381对新型甾体化合物(Ⅰ)(16α,17β-二甲基-17-丙酰基雄甾-1,4-二烯-3-酮)作为底物进行生物转化C11β-羟基化反应的研究。实验研究结果表明,采用Ⅱ级发酵的工艺,收获新月弯孢霉菌丝体作为生物催化剂,在磷酸缓冲液介质体系中,对化合物Ⅰ的C11位实现β羟基化,生成皮质激素药物。测试数据TLC,MS,IR及1H NMR证明了该产物的化学结构,表明生物转化产物为C11β-羟基-16α,17β-二甲基-17-丙酰基雄甾-1,4-二烯-3-酮。     

分枝杆菌细胞裂解液催化甾体激素C_(1,2)位脱氢反应的研究

9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮(Ⅳ)是生产9-氟甾体激素的关键前体,以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(Ⅰ)为底物合成Ⅳ是工业化生产Ⅳ的重要方法。通过比较分枝杆菌全细胞转化法与细胞裂解液转化法,发现分枝杆菌全细胞只能将Ⅰ转化为9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮(Ⅱ),而细胞裂解液可以有效地将Ⅰ转化为Ⅳ,其反应机制为底物Ⅰ自发水解为中间体Ⅱ,Ⅱ在C_(1,2)位脱氢酶(KSTD)的催化作用下发生C_(1,2)位脱氢反应生成产物Ⅳ。为进一步提高产物Ⅳ的转化率,利用基因工程手段在分枝杆菌中分别过表达编码KSTD的关键基因:kst D、kst D3和kstD_M,提高脱氢反应效率,结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH7.0的重组菌株MS136-kst D_M细胞裂解液中反应45h,Ⅳ的转化率为78.4%,比出发菌株提高了38.9%;并优化缓冲液pH,提高反应速率,结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH7.5的重组菌株MS136-kstD_M细胞裂解液中反应45 h,Ⅳ的转化率为92.8%,比出发菌株提高了63.4%。     

梨头霉11α—羟基化制备16β—甲基—11α,17α21—三烃基孕甾—1, …

选育到一株对１６β－甲基－１７α,２１－二羟基孕甾－１,４＝－二烯－３,２０－二酮（Ⅱａ）１１α－羟基化活性强的梨头霉Ａ２８菌株,并发现底物２１－乙酰化（Ⅱｂ）可明显提高１１α－羟工 能力。在适宜的转化条件下,１１ｂ投料浓度０．５％,产物１６β－基１１α,１７α,２１－三羟基孕甾－１,４－二烯－３,２０－二酮（Ⅲ）收率为７３％,结构经波谱分析确认。     

制备16a-甲基孕甾1，4，9(11)一三烯的微生物学方法

17a,21一二羟基-16a-甲基孕甾-4,9(11)-二3,20一二酮-21-醋酸醌(I)与节杆菌A69-2培养物中,出现较大量结晶物,经分离和鉴定,确认为17a,21一二羟基一16a-甲基孕甾-1,4,9(11)一三烯-3,20一二酮(III)。结晶母液中还残存少量17a,21-二羟基卅16a-甲基孕甾-4,9(11)-二烯一3,20-二酮(IV)和化合物(I)和(I)的简单脱氢类似物(II),提出了合成(III)的可能途径．     

A环饱和甾体的微生物转化作用IV．节杆菌9-2菌株的环氧化反应

经各项理化性质包括熔点、比旋值、紫外,红外吸收光谱、核磁共振谱、质谱及元素分析等项的鉴定,证明节杆菌9—2在低浓度(0．02％)的氯化钻存在下,氧化16β一甲基一3β、17a、21-三羟基一5a一△9(11)孕甾烯-20-酮-21-醋酸酯(I)的产物是16β一甲基9a,11a-环氧-17a,21-二羟基一△1,4,孕甾二烯一3,20一二酮(IV),收率48．8％。试验还发现氯化钻是调节产物16β-甲基-17a,21-二羟基△1,4,9(11)孕甾三烯-3,20-二酮(II)和(IV)累积量的有效因素;进一步讨论了该菌环氧化作用的机制。     

总状毛霉对4-烯-3-酮甾体的生物转化研究

从土样中筛选到一株能转化甾体的菌株,经形态观察,鉴定为总状毛霉(Mucor racemosus)。首次利用该菌株对4-烯-3-酮类甾体衍生物进行生物转化,目的是合成具有潜在活性的羟基类4-烯-3-酮衍生物。转化条件为27℃,220r/min振荡培养4d。转化产物经乙酸乙酯萃取,用硅胶柱层析法分离,通过红外、质谱和核磁分析确定了甾体转化产物的化学结构。黄体酮生物转化得到的产物是14α-羟基-4-孕甾烯-3,20-二酮和7α,14α-二羟基-4-孕甾烯-3,20-二酮;4-雄烯二酮的转化产物是14α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮1、4α,17β-二羟基-雄甾-4-烯-3-酮和6α,17β-二羟基-雄甾-4-烯-3-酮。研究结果表明总状毛霉具有转化甾体的能力,对4-烯-3-酮类甾体进行生物转化的主要产物是14α-羟基甾体衍生物。     

A环饱和甾体的微生物转化作用III．倍他美松中间体16β-甲基-5a-△9(11)-孕甾烯-3β,17a, 21-三羟基一20一酮一21一醋酸酯的△1.4 作用

节杆菌9—2在一定浓度的氯化钻存在下转化16β一甲基一5a一△9(11)一孕甾烯-3β,17a,21-三羟基一20一酮21-醋酸酯(I)为16β-甲基-A1.4,9(11)-孕甾三烯-17a,21一二羟基-3,20-二酮(n)。转化的最适条件为氯化钴浓度0．08％;乙醇2一4％;pH 7—8;温度28—30℃。在此条件下,产物(II)的收率在60％以上。     

黑曲霉催化雄甾-4-烯-3,17-二酮16β-羟基化

为进一步确定黑曲霉菌株TCCC41650的生物转化能力,以雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androstenedione)为底物,利用黑曲霉菌株TCCC41650进行催化,产物经纯化、重结晶后,通过单晶衍射鉴定为16β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮。转化条件为:培养液pH 6.0,乙醇添加量为2%,投料浓度为1‰时,72 h转化率为85.8%。目前甾体研究领域对于C16β-羟基化的微生物转化未见报道,研究结果为C16β-羟基甾体药物的研发奠定了基础。     

偶联羟化反应和辅酶再生体系产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,可以用来制备β-甾酮,地塞米松和其他类固醇化合物。3-甾酮9α-羟基化酶(KSH)是由两个亚基即末端氧化亚基(KshA)和铁氧还蛋白还原亚基(KshB)构成的。在本研究中,人工合成了来源于分枝杆菌Mycobacterium sp.Strain VKM Ac-1817D的kshA和kshB基因,通过优化表达载体促进了KshA和KshB在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达,并探究了催化体系中KSH还原亚基和氧化亚基的最适添加比例。此外,KSH转化雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为9-OH-AD的过程中需要辅酶NADH。本研究构建了羟基化反应与利用葡萄糖脱氢酶(GDH)的NADH辅酶再生反应的偶联体系。为了进一步提高转化效率,本研究进行了转化条件的优化,并采取了分批补料的策略,最终9-OH-AD产量为4.78 g/L,转化率为96.7%。此种酶介导的转化生产9-OH-AD的方法为甾体药物生产提供了一种环境友好和经济实用型的新策略。     

节杆菌9—2对皮质甾类C20-酮基的还原作用II．转化3β，17a，21-三羟基-5a-孕甾-20酮

根据多项物理性质,包括熔点、比旋值、分子旋光度、紫外光谱,红外光谱、核磁共振、质谱等的测定,确定节杆菌(Arthrobacter)9-2生物转化3β,17a,21-三羟基-5a-孕甾-3-酮(I)所生成的产物(Ⅱ)的分子结构为17a,20,21-三羟基-孕甾-1,4-二烯-3-酮,其中C20-羟基的构型是β-型。并讨论了该菌转化(I)的可能途径。     

静息细胞连续两批次生物催化生产氢化可的松

以新月弯孢霉（Curvularia lunata）的Ⅱ级培养18h的活菌丝作为C11β位羟基化生物催化剂,在选定的含有微粒结晶甾体底物（0．2％,质量分数）17α,21-二羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮的磷酸缓冲液（0．05mol／L,pH6．0）介质体系中,在经过连续两批次约55h的转化反应,底物转化率可维持在较高水平,产物氢化可的松净收率可达60％;从菌丝回收的底物RS可再利用。此工艺提高了生物催化剂的利用率,具有工业应用价值。     

Δ5-3β,7β-二羟基甾醇及其C-7差向异构体波谱特征及胆碱酯酶的抑制活性

本文对Δ5-3β,7β-二羟基甾醇(1~3)和Δ5-3β,7α-二羟基甾醇(4~6)的一些核磁共振波谱特征进行了比较。活性测试表明化合物1~6对乙酰胆碱酯酶(AChE)无明显的抑制活性,对丁酰胆碱酯酶(BuChE)则有较强的抑制活性,其中24-亚甲基胆甾-5-烯-3β,7α-二醇(6)的IC50值为9.5μM。通过活性数据比较我们发现7α-羟基甾醇对丁酰胆碱酯酶的抑制活性明显比相应的7β-羟基甾醇高。我们通过计算7位羟基和四环平面之间的二面角角度来尝试解释这些活性差别。     

粉红单端孢Trichothecium roseum对雄甾-4-烯-3,17-二酮的生物转化

雄甾-4-烯-3,17-二酮（4AD）是甾体化合物合成过程中的关键中间体,其羟化产物通常具有良好的药理活性或作为工业生产甾体药物的重要中间体。利用粉红单端孢Trichothecium roseum对4AD进行生物转化,从其发酵提取物中共分离鉴定了3个4AD羟基化产物：6β-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮（6β-OH-4AD,1）,14α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮（14α-OH-4AD,2）,6β,14α-双羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮（6β,14α-di-OH-4AD,3）,表明T. roseum对4AD的C-6β位和C-14α位具有较强的羟化能力,其中14α-OH-4AD(2)可作为合成强心甾类化合物毛地黄毒素的重要中间体,6β,14α-di-OH-4AD(3)可作为合成具有抗肿瘤活性的14α-羟基-雄甾-4-烯-3,6,17-三酮的重要中间体。提供了1株能够高效制备活性甾醇中间体14α-OH-4AD和6β,14α-di-OH-4AD的菌株,同时可为研究其他甾醇药物奠定基础。     

氢化可的松生产菌—淡紫犁头霉的形态学观察

甾体化合物氢化可的松(即皮质醇11β.17α.21-三羟基-4-孕烯-3,20-二酮)是一种重要的肾上腺皮质激素,在临床上用于治疗肾上腺皮质功能紊乱;风湿性与类风湿关节炎、心肌炎等炎症;各种休克;多种眼疾和变态性疾病     

3-甾酮-9α-羟基化酶基因的表达及其催化合成9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮

研究应用于甾体9α-羟基化的高效催化剂和催化体系是实现甾体药物9α位羟基高效合成的关键。本文中,笔者对来源于分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv和红平红球菌(Rhodococcus erythropolis) SQ1的3-甾酮-9α-羟基化酶基因(reksh A,mtksh A)进行优化,并对2个基因的催化活性进行检测。通过构建工程表达菌株,以雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为底物,对制备9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)的催化反应进行了探索。结果表明:基因序列优化显著提升了Re Ksh A和MtKshA蛋白的可溶性表达,其中Re Ksh A具有较好的雄甾-4-烯-3,17-二酮9α位羟基化活性。用TB培养基培养Re Ksh A的工程表达菌株BL21(DE3)-p ET28a-reksh A-yh,在30℃、500μmol/L底物浓度、0. 8%(体积分数)乙醇为助溶剂、0. 1 mmol/L IPTG诱导浓度、底物与诱导剂同时加入到工程菌液中的条件下,9α-OH-AD得率达到97. 09%。     

葡枝根霉NG0305酶催化甾体C11α-羟基化的研究

应用本实验室保藏的葡枝根霉Rhizopus stolonifer NG0305对甾体化合物烯睾丙内酯(3-oxo-4,6-diene-Pregna-17-aloha-hydroxy-21-carboxylic acid gama-lactone)进行酶催化C11α-羟基化反应的研究。研究结果表明,菌体培养的碳源供应对菌体所产羟化酶的活力有重要影响。采用葡萄糖和淀粉组合碳源,并加入适量的黑曲霉糖化酶的方式,解决了葡萄糖抑制的问题,并缩短了菌体培养反应时间,得到高羟化转化率。酶转化反应88h后,提取吸附在菌丝球内的产物,应用液相色谱测定,结果表明C11α-羟基化转化率达到了53．0％。     

甾体化合物RSA的11β-羟基化反应

原生质体在甾体中的应用起始于Ｄｌｕｇｏｎｓｋｉ在 1984年采用Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａｅｌｅｇａｎｓ转化可的松龙 ( 17α ,2 1 二羟基孕甾 4 烯 3 ,2 0 二酮 )和Ｈｙｐｈｏｄｅｒｍａｒｏｓｅｕｍ转化 6α 氟 可的松龙 16,17 醋酸酯 ( 6α Ｆｌｕ 17α ,2 1 二羟基孕甾 4 烯 3 ,2 0 二酮 16,17 醋酸酯 ) ,发现原生质体具有甾体转化能力[1 ,2 ] 。Ｓｅｄｌａｃｚｅｋ进一步采用等重的原生质体和菌丝体进行比较 ,原生质体的羟基化能力较后者提高了 3倍 ,表现出很高的转化能力[3] ,从而引起人们的关注。随后展开了有关原生质…     

万年蒿中两个新贝壳杉烷型二萜的分离与结构测定

自菊科蒿属植物万年蒿(Artemisia sacrorum Ledeb.)地上部分首次分得3个单体化合物(两个贝壳杉烷型二萜和一个酸性化合物),经理化常数测定及光谱分析(UV,IR,~1H-NMR,~(13)C-NMR,MS)鉴定其结构分别为3α,16α-二羟基贝壳杉烷-200-O-β-D-葡萄糖甙(Ⅰ)(3α,16α-dihydroxykaurane-20-O-β-D-glucoside(Ⅰ)),3α,6α-二羟基贝壳杉烷-19-O-β-D-葡萄糖甙(Ⅱ)(3α,16α-dihydroxykaurane-19-O-β-D-glucoside(Ⅱ))和1,4-二咖啡酰奎宁酸(Ⅲ)(1,4-dicaffeylquinic acid(Ⅲ))。(Ⅰ)和(Ⅱ)为两个未见报道的新化合物。