照射抑制成年大鼠海马齿状回神经元再生的实验

目的:观察照射对成年大鼠海马齿状回神经元再生的影响。方法:实验于2004-05/2005-04在南方医科大学生理学教研室完成。选择成年雄性Wistar大鼠32只,随机分为对照组和照射组,每组16只。用6MV高能X射线行全脑照射10Gy后,灌注固定取脑,行组织学检查。照射后12h,用末端脱氧核苷酸转移酶介导的切口末端标记法检测海马齿状回凋亡细胞;照射后2个月,用神经巢蛋白免疫组织化学标记计数神经前体细胞,用5-溴脱氧尿苷标记法检测再生神经细胞数量,用5-溴脱氧尿苷与神经特异核蛋白双染法标记再生神经元,计数双染阳性细胞占5-溴脱氧尿苷单染阳性细胞数的比例。结果:32只实验动物照射过程中照射组与对照组因麻醉各死亡1只,30只进入结果分析。①正常大鼠海马齿状回颗粒下层基本无末端脱氧核苷酸转移酶介导的切口末端标记阳性细胞,照射后12h,可见该区域末端脱氧核苷酸转移酶介导的切口末端标记阳性细胞数量较对照组明显增加,差异有显著性[(0.25±0.46),(42.1±9.6)个/张,P<0.001]。②照射后2个月,神经巢蛋白的免疫组织化学标记结果表明,照射组大鼠海马齿状回神经巢蛋白阳性细胞数量与正常对照组接近,差异无统计学意义[(226.0±33.3),(195.0±39.1)个/张,P=0.11]。③5-溴脱氧尿苷与神经特异核蛋白双染标记显示,照射组5-溴脱氧尿苷与神经特异核蛋白双染阳性细胞占5-溴脱氧尿苷阳性细胞数比例较对照组显著降低[(12.8±5.0)%,(81.3±6.6)%,P<0.001],表明照射明显抑制再生神经细胞向神经元方向分化。结论:照射可选择性诱导大鼠海马齿状回神经增殖细胞凋亡,照射后2个月神经前体细胞数量无明显减少,而神经前体细胞增殖活性及向神经元方向分化均受到明显阻滞。     

睡眠剥夺引起成年大鼠脑海马神经细胞增殖及干细胞因子的表达

目的：观察快眼动睡眠剥夺对成年大鼠脑海马齿状回神经细胞增殖的影响，并探讨干细胞因子mRNA表达的变化。方法：实验于2000-03／2002-03在郑州大学医学院完成。将SD大鼠36只随机分为正常对照组、快眼动睡眠剥夺组及快眼动睡眠剥夺对照组，每组12只，其中6只动物在睡眠剥夺后立即灌流固定，余6只动物饲养3周后进行同样的处理。各组动物于剥夺睡眠当日12：00腹腔注射5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷100mg／kg，连续剥夺快眼动睡眠72h，应用细胞增殖标记免疫组化及原位杂交染色观察各组动物脑海马神经细胞增殖分化及干细胞因子mRNA表达的变化。结果：36只大鼠全部进入结果分析。①快眼动睡眠剥夺组脑海马齿状回区细胞增殖率[(22．21&;#177;0．84)％]明显高于快眼动睡眠剥夺对照组和正常对照组[(3．97&;#177;0．53)％和(3．81&;#177;0．50)％，(F：1594，P&;lt;0．001)1。正常对照组和快眼动睡眠剥夺对照组脑海马齿状回区细胞增殖率相似(P&;gt;0．05)。②快眼动睡眠剥夺组脑海马齿状回区干细胞因子mRNA表达增强，阳性积分高于快眼动睡眠剥夺对照组和正常对照组[(134．50&;#177;52．06)，(67．69&;#177;16．95)，(70．61&;#177;19．84)分，(F=6．305，P&;lt;0．05)]，睡眠剥夺3周后部分增殖细胞可表达成熟神经元标记神经元特异性烯醇化酶。结论：快眼动睡眠剥夺可引起成年大鼠脑海马齿状回区神经细胞增殖数目增多，部分新增殖细胞3周后能分化为成熟神经元。表明睡眠不仅对神经系统的成熟和发育具有重要影响，而且对成熟大脑的神经干细胞增殖也具有一定的作用。     

碱性成纤维细胞生长因子对海马伞切断大鼠海马神经的影响

目的 了解碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对海马伞切断造成的阿尔茨海默病(AD)模型大鼠海马齿状回神经发生的影响，探讨bFGF治疗AD的前景。方法 36只SD大鼠随机分成正常对照组(n=12)、AD对照组(n=12)和AD处理组(n=12)。AD处理组及AD对照组大鼠左侧海马伞切断制造AD模型；正常对照组注射生理盐水。AD处理组造模后每天侧脑室注射bFGF共7d；AD对照组及正常对照组同时间注射生理盐水。BrdU标记增殖细胞。TUNEL方法标记DNA片段。原位检测凋亡细胞。计数海马齿状回BrdU阳性细胞与凋亡细胞数。结果 AD处理组大鼠与AD对照组大鼠相比，海马齿状回BrdU阳性细胞增加[两组在颗粒细胞层阳性细胞分别为(163&;#177;37)，(53&;#177;5)个／切片平面；海马门(28．5&;#177;5．5)，(12．3&;#177;2．8)个／切片平面；分子层(10．7&;#177;2．2)，(6．0&;#177;1．4)个／切片平面]，差异有非常显著性意义(F=103．4，83．4，33．4,P&;lt;0．01)，而凋亡细胞差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。AD对照组大鼠与正常对照组大鼠相比，海马齿状回BrdU阳性细胞数及凋亡细胞差异均无显著性意义(P&;gt;0．05)。结论 bFGF可刺激AD模型大鼠海马神经发生。     

氦氖激光对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤后海马齿状回细胞增殖的影响

目的：氦氖激光照射致新生大鼠缺血缺氧性脑损伤(hypoxia-ischemia brain damage，HIBD)，观察其对海马齿状回细胞增殖的影响，为临床治疗HIBD提供新思路。方法：7d健康Wistar大鼠56只随机分为假手术组，缺血缺氧组，缺血缺氧激光非穴位照射组，缺血缺氧激光穴位照射组。常规苏木精-伊红、Nissl染色以及采用抗Brdu抗体进行免疫组织化学染色。结果：激光穴位照射组与其他组相比海马神经元变性坏死减轻，胞体内Nissl体丢失较少，海马齿状回Brdu标记阳性细胞的表达量明显增加24．06&;#177;3．55，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。结论：激光穴位照射对海马神经元有保护作用，促进了海马齿状回细胞的增殖。     

电针对成年脑缺血大鼠缺血侧神经干细胞巢蛋白表达的影响

目的：观察电针治疗对成年人鼠脑缺血后缺血侧神经干细胞特异性标记物巢蛋白表达的影响。方法：实验于2003—06／2004—03在广州中医药夫学实验动物中心进行。取清洁级SD雄性大鼠72只，随机分为两组，即模型组（n=36）与电针组（n=36），均采用开颅热凝闭法制作人鼠局灶性脑缺血模型，按缺血时间3，7，14和21d将模型组与电针组又各分为4组，即8个亚组（n=9）。对电针组采用1寸毫针针刺大椎、百会．联接G6805-1型电针治疗仪，选择5～10Hz频率的等幅疏密波，刺激强度以大鼠身体轻微颤动为宜，持续30min。模型组大鼠只予以同等条件抓取，但不实施电针治疗处理。观察不同时相脑缺血情况，采用巢蛋白免疫组化法记录大鼠巢蛋白表达阳性细胞的数量，其数量增加表明神经干细胞的增殖。结果：①模型组脑缺血后不同时相（3，7，14和21d）巢蛋白在缺血侧脑皮质、海马齿状回均有阳性表达细胞[（5．20&;#177;1．70，14．16&;#177;3．95，9．26&;#177;3．29，6．70&;#177;2．27），（13．58&;#177;2．33，20．34&;#177;2．73，13．12&;#177;2．25．8．64&;#177;1．56）1，其中7d的阳性细胞数量比其他时相明显增加，差异显著（P〈0．05）；（爹电针组在不同时相的巢蛋白阳性细胞数量均较同时相模型组有明显的增加（缺血侧脑皮质：11．50&;#177;3．39，26．40&;#177;4．65，18．16&;#177;3．03，12．66&;#177;2．57；海马齿状回：20．04&;#177;3．60，29．26&;#177;3．16，18．78&;#177;2．24，13．52&;#177;2．10），差异显著（P〈0．05）。结论：电针具有促进大鼠脑缺血后巢蛋白在缺血侧阳性表达保持在较高水平的作用.     

溴脱氧尿苷标记滞留细胞表达干细胞标记物神经巢蛋白

背景：干细胞和某些种类的肿瘤细胞都存在永生化DNA链的不对称分裂现象，具有自我更新长期存活以及相对无限增殖等特征，这些生物学特性为它们多重变异累积提供潜在的可能性。溴脱氧尿苷能够在细胞代谢过程中掺入到DNA双链中，可以观察标记物长期存在状况。目的：拟应用免疫荧光双染法观察C6胶质瘤细胞中的溴脱氧尿苷标记滞留细胞是否表达干细胞标记物神经巢蛋白。设计、时间及地点：观察对比细胞学实验，于200601／2007—02在哈尔滨医科大学第一临床附属医院神经外科研究所完成。材料：Wistar大鼠由哈尔滨医科大学第一临床医院实验动物室提供，C6胶质瘤细胞由哈尔滨医科大学第一临床医院神经外科研究所提供。方法：C6胶质瘤细胞处于指数生长期时加入溴脱氧尿苷，细胞培养2d后更换不含溴脱氧尿苷的细胞培养液。分别在不同时间点用免疫荧光法测定溴脱氧尿苷阳性细胞数目变化，确定溴脱氧尿苷在肿瘤细胞中的标记滞留时间，同时用免疫荧光双染法检测这些溴脱氧尿苷标记滞留细胞是否能够表达干细胞标记物神经巢蛋白。主要观察指标：C6细胞中溴脱氧尿苷免疫荧光染色细胞随时间变化的情况，溴脱氧尿苷-神经巢蛋白免疫荧光双染色细胞数目。结果：细胞指数生长期时溴脱氧尿苷的标记阳性率达97％以上，溴脱氧尿苷标记结束之后，随着时间的延长，阳性细胞数目逐渐减少，到第12天，仅残留少量阳性细胞，数目占细胞总数的1．77％，随后的一两天阳性细胞几乎无法测出。溴脱氧尿苷标记后第12天，溴脱氧尿苷标记滞留的阳性细胞神经巢蛋白染色也为阳性，阳性率为1．61％。结论：C6胶质瘤细胞中的溴脱氧尿苷标记滞留时间为12d，溴脱氧尿苷标记滞留细胞能够表达神经巢蛋白。     

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点及可行性

背景：骨髓干细胞移植成功的定性指标是标记移植的细胞至组织器官后存活并发挥了正常的功能。目前细胞学研究方面采用的标记方法有酶联标记、氚胸腺嘧啶核苷标记、荧光标记和5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记等。目的：观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点。设计：单一样本观察。单位：华北煤炭医学院附属医院心胸外科。材料：实验于2003-07／2004-12在华北煤炭医学院中心实验室完成。取月龄3个月的日本大耳白兔6只，雌雄不限，体质量（3．00&;#177;0．25）kg。方法：①利用密度为1073g／L的Percoll分离骨髓的单核细胞，以含体积分数为0．1的胎牛血清的低糖Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基培养与扩增间充质干细胞，纯度可达95％左右。②用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞24，48，72，96h后的检测标记率（标记组）；阴性对照为未经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞；空白对照为以磷酸盐缓冲液或正常鼠血清替代一抗。主要观察指标：①3组各检测200个细胞，并在不同时间点观察。②5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的骨髓间充质干细胞免疫组织化学染色结果及细胞计数结果：结果：①标记组均见5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞，5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性反应物位于细胞核，呈棕色、颗粒状或弥漫性分布：对照组未见阳性细胞。②标记组24，48，72，96h5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞的数目分别为48&;#177;2，100&;#177;4，173&;#177;2，178&;#177;3．随着标记时间的延长，标记率逐渐增高，标记72h后标记率在85％以上。③阴性对照和空白对照组各时间点均为0。结论：①用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的最佳时间是72h。②标记后检测的敏感性好．在低倍镜中亦可见．适合于大块组织的定量研究。③结果表明5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞是可行的。     

去大脑皮质血管后对成年大鼠海马齿状回神经干细胞的影响

背景：脑缺血、癫痫等损伤可刺激成年海马的齿状回颗粒细胞下层(subgranular zone，SGZ)神经干细胞增殖分化。去大脑皮质血管状态下引起碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)表达增多是否是刺激SGZ神经干细胞增殖的主要原因之一呢?目的：探讨去皮质血管对成年大鼠海马齿状回SGZ神经干细胞增殖、分化的影响以及去大脑皮质血管状态下bFGF的表达情况。设计：随机对照实验研究。地点和对象：实验地点：北京中医药大学基础医学院科学试验中心。成年Wistar雄性大鼠33只，随机分为正常组(15只)和模型组(18只)。干预：采用去Wister大鼠脑皮质血管脑缺血模型及免疫组织化学方法观测大鼠海马齿状回溴化脱氧尿核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)，Tuj-1，Vimentin，Nestin，增殖细胞核抗原(proliferation neuclear antigen，PCNA)，bFGF的表达情况。主要观察指标：大鼠海马齿状回的BrdU，Tuj-1，Vimentin，Nestin，PCNA，bFGF的表达情况。、结果：去大脑皮质血管后成年大鼠SGZ中BrdU，Tuj-1，PCNA阳性细胞的数目增多。模型组大鼠齿状回BrdU免疫阳性细胞数目[去在脑皮质15d为(46．667&;#177;6．614)个／脑片，去大脑皮质30d为(14．111&;#177;3．408)个／脑片]与正常组[9．556&;#177;1．236)个／脑片]比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。模型组大鼠齿状回Tuj-1阳性细胞数目[去大脑皮质15d为(18．778&;#177;2．224)个／脑片，去大脑皮质30d为(31．333&;#177;2．646)个／脑片]与正常组[(6．778&;#177;1．481)个／脑片]比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。齿状回bFGF表达上调，相反Vimentin阳性细胞减少。结论：成年大鼠海马SGZ神经干细胞在脑缺血情况下，通过上调bFGF的表达，可能通过自分泌、旁分泌等方式作用于其受体，促进其自我更新和多向分化能力。     

锂-匹鲁卡品致痫后大鼠齿状回颗粒细胞下层神经前体细胞增殖活性的变化

目的：观察锂-匹鲁卡品致痫后大鼠齿状回颗粒细胞下层神经前体细胞增殖活性的变化，探讨自体神经前体细胞在颞叶癫痫病理进程中的潜在作用。方法：实验于2004—08／12在华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科实验室进行。取健康成年SD雄性大鼠64只，随机分为致痫组和对照组2组，每组32只。①给药：致痫组采用锂（3mmoL／kg）-匹鲁卡品（50mg／kg）腹腔注射以诱导大鼠急性癫痫模型，持续抽搐达30min后．给予阿托品（1ms／kg）腹腔注射，30min后或大鼠抽搐濒危时再给予地西泮（10mg／kg），水合氯醛（5mL／kg）联合腹腔注射；对照组以生理盐水（4mL／kg，4mL／kg）取代氯化锂和匹鲁卡品，其余用药步骤及方法同致痫组。每组又分给药后3，7，14和28d4个时间点，每个时间点8只。②标本制备：两组大鼠于相应时间点前1d以增殖性细胞的标记物5一溴脱氧尿苷50mg／kg腹腔注射给药3次，问隔4h1次。24h后麻醉状态下处死取材。③观察指标：利用Nissle染色观察海马区域神经元的丢失情况，免疫组化方法观察齿状回颗粒细胞下层5．溴脱氧尿苷阳性细胞数目的变化，评估自体神经前体细胞增殖情况。结果：经补充后64只大鼠进入结果分析。①各致痫组大鼠齿状回门区、CA1和CA3区可见不同程度的内氏小体减少或者消失。（④齿状回颗粒细胞下层5-溴脱氧尿苷阳性细胞数：致痫组致痫后即逐渐上升，第14天达到高峰，第28天已开始下降（F=655．61，P〈0．0001）。致痫组致痫后7，14和28d高于对照组[（31&;#177;5），（95&;#177;5），（18&;#177;3）个／mm。；（10&;#177;2），（11&;#177;1），（1l&;#177;1）个／mm^2，P〈0．00011。结论：急性痫性发作可造成脑海马神经元脱失，并能促进大鼠海马齿状回颗粒细胞下层神经前体细胞的明显增殖，后者在颞叶癫痫的病理进程中具有意义。     

脑缺血大鼠缺血同侧海马齿状回突触可塑性的变化

目的：观察缺血性脑损伤对缺血同侧海马齿状回突触可塑性的影响。 方法：实验于2005-06／2005-08在中国科技大学生命科学院神经毒理实验室完成。24只雄性Wistar大鼠分为假手术2周组和缺血2周组两组，采用热凝闭大鼠大脑中动脉致局灶性脑缺血模型，待大鼠苏醒后（术后3h）及2周后分别观察大鼠行为表现并进行神经功能缺损评分。模型制作14d后进行海马齿状回区反应波形测定和实验参数测定，观察缺血同侧海马齿状回区的I／O曲线，缺血同侧海马齿状回区长时程增强，缺血同侧海马齿状回区长时程抑制。 结果：2组各12只大鼠均进入结果分析。假手术组有9只大鼠引出反应波形，缺血组有8只大鼠引出反应波形，排除过高或过低数值，每组有6只大鼠进人数据分析。①缺血2周后缺血同侧海马齿状回兴奋性突触后电位的I／O曲线幅度显著降低（F=43．95，P〈0．05），群峰电位的I／O曲线幅度也显著降低（F=4．58，P〈0．05）。②兴奋性突触后电位的长时程增强幅度在假手术组为（109．0&;#177;3．8）％，缺血2周后升高为（114．0&;#177;1．9）％（F=13．79，P〈0．05）。群峰电位的长时程增强幅度在假手术组为（201&;#177;13）％，而在缺血组群峰电位的长时程增强幅度明显降低为（179．0&;#177;13）％（F=4．56，P〈0．05）。③兴奋性突触后电位的长时程抑制幅度在假手术组为（98．7&;#177;3.4）％，缺血2周后明显降低为（89．0&;#177;3．5）％（F=18．95，P〈0．05）。群峰电位的长时程抑制幅度在假手术组为（84．7&;#177;5．3）％，而在缺血组群峰电位的长时程抑制幅度为（85．6&;#177;3．9）％，与假手术组无明显区别（F=0．63，P〉0．05）。 结论：脑缺血降低了海马齿状回区基本的突触传递，同时降低单脉冲刺激海马穿通纤维引起的齿状回颗粒细胞的共同发放幅度；缺血损伤了海马齿状回区群峰电位的长时程增强诱导，而对兴奋性突触后电位的长时程增强诱导有促进作用；缺血损伤了海马齿状回区兴备性突触后电位的长时程抑制诱导，而对群峰电位的长时程抑制诱导没有明显影响。