人源化抗人肺癌二价和四价VH单域抗体的制备及活性分析

目的为提高人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3vH的功能性亲和力,制备其二价和四价的抗体分子。方法重组PCR分别将SV5-Cys短肽和p53四聚化结构域基因与hu3D3VH基因融合,而获得同源二聚体dihu3D3VH和同源四聚体tehu3D3VH基因。将两种基因克隆至pET-22b( )表达载体,并分别在E.coli BL21(DE3)中表达。表达产物通过N2 亲和层析柱纯化。用FITC分别标记hu3D3vH、dihu3D3VH和tehu3D3V三种抗体分子,通过免疫荧光实验分析其抗原反应性和特异性,并利用流式细胞术比较分析其功能性亲和力。结果两种基因均以单体形式并主要以包涵体的形式表达,纯化并复性后,其蛋白溶液中分别存在约50%的二聚体和70%的四聚体。dihu3D3VH和te- hu3D3VH均保留了hu3D3VH的抗原反应性和特异性;且与hu3D3VH相比,其功能性亲和力分别提高了约60%和160%。结论采用增加结合价的策略,有效地改善了hu3D3VH的功能性亲和力。     

人源化抗炭疽芽胞杆菌保护性抗原单链抗体的设计和表达

目的:应用抗体"框架区重塑"技术,对鼠单克隆抗体(mAb)框架区进行人源化,制备人源化单链抗体(scFv)并检测其活性。方法:在获得抗炭疽芽胞杆菌保护性抗原鼠mAb(5E1)可变区基因的基础上,保持鼠mAb互补决定区(CDR)不变,选择与框架区同源性最高的人源序列替换鼠mAb的框架区,保留个别关键的鼠源残基。通过融合PCR技术构建人源化的scFv,并在大肠杆菌中进行了表达。表达产物以包涵体形式存在,通过变性、镍柱亲和层析和复性,获得复性后的可溶蛋白。对纯化产物进行了SDS-PAGE、ELISA和抑制炭疽毒素中和活性的检测。结果:人源化后的序列具有与鼠源scFv一致的抗原结合活性和细胞水平的中和炭疽毒素活性。结论:获得了具有功能的人源化的抗体基因序列,为表达具有中和炭疽毒素活性的全分子人源化抗体奠定了基础。     

人源抗癌胚抗原单克隆抗体的获得与鉴定

目的：获得抗癌胚抗原（CEA）的单克隆抗体（mAb）。方法：采用特殊的5轮筛选法（逐轮降低抗原包被量，严格洗脱条件），以固相化的人源CEA抗原淘筛本室构建的人源特异性噬菌体抗体库。获得有特异结合活性的CEA噬菌体抗体，酶切鉴定插入的抗体基因。切去噬菌粒上衣壳蛋白gⅢ基因，构建表达载体，在大肠杆菌中可溶性表达抗CEA抗体Fab段，ELISA、Western blot检测抗体免疫学活性，测序分析抗体基因。结果：筛选出4株与CEA抗原特异结合而与BSA、HBsAg无交叉结合反应的噬菌体抗体。切去gⅢ基因，在大肠杆菌中表达可溶性抗体Fab段，表达量在细菌培养液上清和细菌裂解液中无统计学意义。可溶性抗体与人CEA抗原有特异结合活性，与BSA、HBsAg无交叉结合反应。Western blot显示在略大于相对分子质量（Mr）45000处有一明显条带，与Mr48000的Fab大小一致。DNA测序分析表明Fab段VH属于IgGVH3基因家族，VL属于VK1基因家族。结论：抗CEA噬菌体抗体库的构建和人源抗CEAmAb的制备，为CEA阳性表达肿瘤的靶向治疗奠定基础。     

抗人整合素αυβ3单链抗体的构建和表达

目的：利用基因工程抗体技术构建抗人整合素αυβ3单链抗体(scFv)。方法：从分泌抗人整合素αυβ3单抗(mAb)的杂交瘤细胞E10总RNA中，用RT-PCR扩增VH和VL基因，对其核苷酸序列分析后，通过PCR在VH和VL基因间插入柔性连接子(Gly4Ser)3 组装成scFv基因，并克隆至原核表达载体pTIG—TRX中。以重组子转化大肠杆菌B121(DE3)诱导目的基因表达。结果：转化菌可表达相对分子质量(Mr)为31000的scFv。Western blot证实，具有His6标签蛋白的表达。经低剂量的IPTG诱导和较低温度培养，scFv获得了可溶性形式表达。表达产物经Ni—NTA琼脂糖层析纯化后纯度达91％以上。ELISA鉴定证实，scFv具有良好的抗原结合活性。结论：成功地构建并表达抗人整合素αυβ3的scFv，为进一步临床研究奠定了基础。     

人源抗NH-LBP Fab抗体的制备和初步鉴定

目的：构建人源抗脂多糖结合蛋白氨基端片段（NH-LBP）Fab抗体的原核表达载体, 并制备高稳定性Fab抗体.方法：用PCR方法, 从可溶性表达抗NH-LBP抗体的重组质粒pComb3H-Fab中扩增出VH链和VL链基因序列, 分别构建表达质粒pET-28a（＋）-VH和pET-28a（＋）-VL, 并于工程菌BL21（DE3）star中分别表达及TALON柱芯亲和纯化, 将抗体片段VH和VL共同复性, 通过二硫键形成Fab抗体, 再采用ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力.结果：扩增出VL链和VH基因片段长约为650 bp和700 bp, 经BL21star表达出相对分子质量（Mr）约为28　000和30　000的目的蛋白, 共同折叠后所获得Fab抗体与NH-LBP具有较高的结合力.结论：成功地制备抗NH-LBP Fab抗体, 为临床抗炎研究提供了条件.     

抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的：从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区（V）基因，构建bFGF单链抗体（scFv），并进行可溶性表达。方法：从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA，用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因（VH）和轻链的可变区基因（VL）；再通过重叠延伸拼接（SOE）PCR方法，在VH和VL基因之间引入linker（Gly4Ser）3，构建bFGF scFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB 5E中，选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达；经SDS—PAGE检测抗体表达水平，ELISA鉴定其抗原结合活性。结果：测序分析结果显示，VH基因序列全长375碱基对，编码125个氨基酸，VL基因序列全长399碱基对，编码133个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FR）、3个抗原互补决定区（CDR）及抗体特征性的2个半胱氨酸残基；构建的scFv全长789碱基对，编码263个氨基酸，连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达，表达产物主要位于周质腔中，表达产物的Mr为27000，与理论预期值相符；间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论：成功地克隆bFGF mAb可变区基因，并构建表达bFGF scFv，为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。     

诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定

目的:构建适于原核表达的人诱骗受体DcR3基因,并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定。方法:查得人DcR3cDNA全序列,将其分段设计引物,通过重叠PCR获得DcR3基因。构建pET-22b( )/DcR3表达载体,转化大肠杆菌Rosseta-gami,IPTG诱导表达,Ni柱纯化。采用ELISA进行特异性鉴定。结果:通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,蛋白纯度达95%以上。ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合。结论:诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化,为进一步的功能研究奠定了基础。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

抗人整合素ανβ3单链抗体的构建和表达

目的 :利用基因工程抗体技术构建抗人整合素ανβ3 单链抗体(scFv)。方法 :从分泌抗人整合素ανβ3 单抗 (mAb)的杂交瘤细胞E10总RNA中 ,用RT PCR扩增VH 和VL 基因 ,对其核苷酸序列分析后 ,通过PCR在VH 和VL 基因间插入柔性连接子(Gly4Ser) 3,组装成scFv基因 ,并克隆至原核表达载体pTIG TRX中。以重组子转化大肠杆菌BL2 1(DE3 )诱导目的基因表达。结果 :转化菌可表达相对分子质量 (Mr)为 3 10 0 0的scFv。Westernblot证实 ,具有His6标签蛋白的表达。经低剂量的IPTG诱导和较低温度培养 ,scFv获得了可溶性形式表达。表达产物经Ni NTA琼脂糖层析纯化后纯度达 91%以上。ELISA鉴定证实 ,scFv具有良好的抗原结合活性。结论 :成功地构建并表达抗人整合素ανβ3 的scFv ,为进一步临床研究奠定了基础。     

多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

目的:构建多样性良好的人源天然噬菌体抗体库。方法:从正常人外周血中分离淋巴细胞,以RT-PCR和半巢式PCR扩增重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因,以重叠延伸PCR将VH、VL组装成scFv基因,并将其克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中。以pCANTAB-5E电转化大肠杆菌TG1,构建人源天然噬菌体抗体库,测序分析抗体基因的家族信息和多样性,并用多种抗原对其进行筛选。结果:获得了库容为2×108的人源天然噬菌体抗体库。分别用5种抗原对其进行筛选,均可获得特异性噬菌体抗体的富集。结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

天然抗角蛋白单克隆抗体3B4的噬菌体呈现的scFv的构建及表达

目的:构建并表达噬菌体呈现的天然抗角蛋白单克隆抗体(mAb)3B4的单链抗体(scFv),并测定其活性。方法:分别以pMD18TmAb3B4VH和pMD18TmAb3B4VL为模板进行PCR,扩增mAb3B4的VH和VL基因,然后将其依次插入噬菌体表达载体pscMH中。经DNA序列测定正确后,转化大肠杆菌,用辅助噬菌体VCSM13超感染诱导表达scFv;用ELISA检测其与亲本mAb3B4的抗原结合活性的改变。结果:对扩增的mAb3B4的VH和VL基因进行测序,结果表明VH基因与原序列完全一致,VL基因在骨架区FR1有1个碱基发生突变。用VCSM13超感染后能检测到scFv的表达,其与亲本一样具有多反应性,但抗原结合模式不完全相同。结论:成功地构建并表达了天然抗角蛋白mAb3B4噬菌体呈现的单链抗体,表达的scFv与mAb3B4的抗原结合活性有一定的差异,为探讨天然自身抗体的抗原结合模式奠定了基础。     

人源性抗角蛋白单链抗体的构建及表达

目的:克隆抗角蛋白抗体的可变区(V区)基因,构建抗角蛋白单链抗体(scFv)表达载体并表达。方法:根据人源性抗角蛋白Fab段的基因序列设计引物,用PCR方法克隆抗角蛋白抗体的V区基因,并重组到scFv的表达载体中,在大肠杆菌进行表达,表达产物经体外变性复性后进行SDS-PAGE鉴定。用ELISA检测其特异性结合活性。结果:成功地克隆抗角蛋白抗体的V区基因,构建了scFv的表达载体,并在大肠杆菌中表达。ELISA检测证实,表达的scFv保留了亲本Fab抗体的特异结合活性。结论:获得功能性抗角蛋白的scFv,可用于进一步的临床应用研究。     

抗KDR单链抗体的构建、表达及生物学活性鉴定

目的: 构建并表达抗人血管内皮生长因子受体KDR单链抗体(scFv)蛋白, 并测定其生物学活性。方法: 设计合成抗KDR单抗 (mAb)Ycom1D3VH、VL引物, 通过重叠延伸拼接 (splicingoverlapextensive, SOE)PCR, 在VH 和VL基因间引入柔性短肽(Gly4Ser)3, 构建抗KDRscFv基因并进行序列分析。将其克隆入pAYZH原核表达载体, 在大肠杆菌中诱导表达, 并以ELISA及免疫荧光结合实验测定重组蛋白的生物学活性。结果: 序列分析表明, 抗KDRscFv基因的全长为 729bp, 编码 243个氨基酸。将重组体表达产物进行SDS PAGE及Westernblot分析显示, 融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为 30 000, 同预期的结果一致。表达产物主要以不溶性包涵体的形式存在, 表达量占菌体总蛋白的 20%。表达产物经变性、纯化及体外复性后, 纯度达 90%以上。ELISA和竞争性免疫荧光结合实验显示, 重组小分子scFv可与可溶性KDR抗原及表达KDR受体的人脐静脉内皮细胞特异性结合, 保留了亲本mAb的抗原结合活性。结论: 成功地构建了抗KDRscFv基因, 并在大肠杆菌中功能性表达, 为靶向诊断、治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。     

构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3 mAb的人源化Fab

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。     

抗HEV中和抗体13D8的单链抗体的构建及表达

目的 :降低HEV中和性单抗 (mAb) 13D8的鼠源性 ,表达其单链抗体 (scFv)。方法 :从分泌 13D8鼠mAb的杂交瘤细胞中 ,通过RT PCR克隆mAb的VL、VH 基因 ,并进一步组装成VH linker VL 型的scFv片段。将scFv片段克隆到pTO T7载体中 ,在大肠杆菌中进行表达。用ELISA、Westernblot检测scFv的活性。结果 :SDS PAGE表明 ,13D8的scFv在E .coli中得到高效表达 ,表达量达菌体总蛋白的 2 6 .8%左右 ,表达产物主要以包涵体的形式存在。间接ELISA和Westernblot检测表明 ,表达的 13D8的scFv能与HEVOFR2区中一段重组蛋白(NE2 )特异结合。竞争ELISA表明 ,scFv与原鼠mAb识别的为同一表位。结论 :成功地表达出具有免疫学活性的 13D8的scFv。     

乙型脑炎病毒prM蛋白单克隆抗体的制备

目的 克隆日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)前膜蛋白(prM)编码基因,原核表达、纯化prM蛋白,以纯化产物为免疫原制备单克隆抗体(mAb);方法从感染JEV病毒的鼠脑中克隆编码JEV prM蛋白的基因并将其克隆入原核表达载体pET32a,转化大肠埃希菌BL21(DE3)LvsS后以IPTG诱导表达.表达产物经Ni-NTA纯化后进行SDS-PAGE分析.用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和亚克隆后筛选出能分泌识别prM蛋白的mAb的杂交瘤细胞株.用Western Blot和免疫组化方法检测单克隆抗体的特异性.结果 从鼠脑中克隆出约500 bp的JEV prM基因,将其克隆入原核表达载体中,在大肠埃希菌中获得了较好表达.纯化的prM蛋白免疫BALB/c小鼠,经传统细胞融合及筛选方法制备出单克隆抗体,抗体滴度为105.ELISA、Western Blot和免疫组化检测结果证实该株单抗具有较好的特异性.结论 成功的表达和纯化了日本乙型脑炎病毒的prM蛋白,并完成了单克隆抗体的制备,为乙型脑炎病毒感染的早期诊断及预防的研究奠定了良好的基础.     

The expression, renaturation, purification and preliminary identification of human IgE Cepsilon3-Cepsilon4]

AIM: To gain recombinant protein Cepsilon3-Cepsilon4 of IgE Fc (E34). METHODS: We cloned the gene coding human IgE Cepsilon3-Cepsilon4 (E34) and constructed an expression vector pET28a(+)-E34. The target protein was expressed as inclusion body in E.coli BL-21. Following renaturation and purification through a CM sephorose FF column, the soluble protein was acquired, and its binding ability to murine anti-hIgE mAb was identified by Western blot and ELISA. RESULTS: The cloned E34 gene was sequenced and proved by SDS-PAGE to be the same as reported sequence. SDS-PAGE analysis showed the relative molecular mass of E34 protein obtained was correct as predicted. Western blot and ELISA data revealed that it owned the epitope of binding to murine anti-hIgE mAb. CONCLUSION: The expression vector pET28a(+)-E34 has been successfully constructed and the target protein E34 recognized specifically by murine anti-hIgE mAb is obtained.     

人CD20跨膜区与g3pN端融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :构建g3pN1 hCD2 0跨膜及胞外区基因表达载体 ,并在大肠杆菌中进行高效融合表达。方法 :利用反转录PCR和PCR方法 ,分别从Daudi细胞和M13K0 7噬菌体中扩增hCD2 0基因和编码g3pN1蛋白N1端的基因 ,并重组到pTIG Trx表达载体中 ,在大肠杆菌中融合表达。结果 :表达产物可被抗CD2 0分子的单克隆抗体 (mAb)识别。结论 :成功地表达并鉴定了目的蛋白。