家蚕微孢子虫核糖-5-磷酸异构酶A基因的克隆及表达特征分析

核糖-5-磷酸异构酶A(ribose 5-phosphate isomerase A,RpiA)是多种生物中普遍存在的一种高度保守的蛋白酶,在磷酸戊糖途径(PPP)中起着核心作用,参与原核生物与真核生物核糖-5-磷酸(R5P)与核酮糖-5-磷酸(Ru5P)之间的可逆异构化反应及植物二氧化碳固定的卡尔文循环。为探索RpiA在家蚕微孢子虫侵染家蚕后能量代谢与物质合成过程中所发挥的作用,通过PCR扩增得到NbRpiA基因的编码区。该开放阅读框全长345 bp,编码114个氨基酸,预测蛋白质的分子质量约为13.145 kD,等电点为7.72,未发现明显已知功能结构域。实时荧光定量PCR检测发现,NbRpiA基因在家蚕微孢子虫感染家蚕后7 d内均有表达:从感染后2 h起,NbRpiA基因的表达水平呈缓慢上升的趋势,第2天达到最高,随后表达水平逐渐降低,从第4天开始表达水平大幅降低,至第7天降至最低。初步推测NbRpiA可能在家蚕微孢子虫孢子发芽及增殖阶段发挥作用。研究结果为了解NbRpiA在家蚕微孢子虫能量代谢与物质合成中的作用提供了初步线索。     

家蚕微孢子虫己糖激酶基因的克隆及序列结构分析和原核表达

己糖激酶(hexokinase,HXK)是糖酵解途径的限速酶,在能量代谢中充当极其重要的角色。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)具有完整的糖酵解途径,其基因组中有2个序列相似度较高的己糖激酶编码基因拷贝(NBO_1320g0001,NBO_27g0008)。根据其中的一个基因拷贝(NBO_27g0008)序列设计特异性引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板成功克隆了该基因,命名为Nb HXK-1。该基因大小为894 bp,包含完整的ORF,编码297个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为34.241 k D,等电点(p I)为5.26,蛋白质的氨基酸序列有31个磷酸化位点和4个潜在的N-糖基化位点,无跨膜结构域,有信号肽,二级结构主要由α螺旋(54.55%)、延伸片段(17.80%)和无规则卷曲(27.61%)组成。系统进化分析显示Nb HXK-1与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)己糖激酶(Nc HXK)氨基酸序列的亲缘关系较近。将Nb HXK-1基因插入原核表达载体p ET-28a(+)并转化BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达后经蛋白质串联质谱鉴定和Western blot分析显示,获得了与预期大小一致的约35 k D的重组Nb HXK-1蛋白,为进一步阐明Nb HXK-1的生物学功能奠定了基础。     

家蚕微孢子虫6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Nb6PGDH的克隆及表达特征分析

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)是戊糖磷酸途径的限速酶,参与生物体内递氢体NADPH的产生。通过检索微孢子虫数据库获得家蚕微孢子虫6PGDH基因序列,以家蚕微孢子虫镇江株基因组为模板,设计特异性引物成功克隆了该基因,命名为Nb6PGDH,并对该基因进行序列特征和表达特征分析,为了解6PGDH基因在微孢子虫生长发育过程中的功能提供有用信息。克隆得到的序列全长1 374 bp,包含一个完整的ORF,编码457个氨基酸;与Gen Bank数据库中家蚕微孢子虫6PGDH基因长度相同,相似度为99. 42%,其中8个碱基存在差异,编码的3个氨基酸发生改变。生物信息学分析表明Nb6PGDH蛋白没有信号肽,无跨膜结构域,分子质量为51. 8 k D,等电点5. 83,存在38个磷酸化位点和2个N-糖基化位点。实时荧光定量PCR分析结果表明,家蚕微孢子虫感染家蚕后2~168 h,中肠组织中Nb6PGDH基因都有所表达,且表达水平在生长发育过程中发生变化,说明Nb6PGDH基因在家蚕微孢子虫增殖发育过程中具有一定的生理功能。     

家蚕微孢子虫烯醇化酶(Enolase)基因的克隆及序列分析与原核表达

烯醇化酶(enolase,ENO)是糖酵解途径的限速酶,对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)烯醇化酶的研究有助于了解微孢子虫的能量代谢机制。依据微孢子虫基因组数据库中的家蚕微孢子虫烯醇化酶编码序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得家蚕微孢子虫烯醇化酶基因(Nb ENO)。该基因ORF全长1 242 bp,编码413个氨基酸,预测蛋白质分子质量46.323 k D,等电点6.13;蛋白质二级结构主要由α螺旋(28.33%)、延伸片段(22.52%)和无规则卷曲(49.15%)组成,含有25个磷酸化位点和1个糖基化位点,无信号肽和跨膜结构域。系统进化树分析Nb ENO与蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)烯醇化酶基因序列(Nc ENO)的亲缘关系较近,序列比对显示二者的一致性为62.10%。将Nb ENO基因插入原核表达载体p ET-28a并转化大肠埃希菌Rosatta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后获得预期大小约50 k D的重组Nb ENO蛋白,有利于进一步研究Nb ENO的功能及亚细胞定位。     

家蚕微孢子虫的一个Dicer相似蛋白基因的鉴定及系统进化和转录活性分析

Dicer是一种具有RNaseⅢ酶活性的蛋白质,参与RNAi起始阶段siRNA和miRNA的形成,为RNA诱导沉默复合物(RISC)形成的关键因子之一,在基因的转录后调控中扮演重要角色。采用生物信息学方法从家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)全基因组数据中鉴定到一个Dicer相似蛋白(Dicer-like)基因,命名为Nb DCL(Gen Bank登录号:EOB15391)。预测Nb DCL的二级结构中含有RNaseⅢ结构域和dsRNA结合结构域。基于Dicer-like基因的系统进化分析显示,家蚕微孢子虫与柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)的亲缘关系最近,并与真菌形成姊妹枝,说明微孢子虫Dicer-like与真菌的同源基因来自共同的祖先。基因组共线性分析显示,Dicer-like基因及其两侧基因在微孢子虫基因组中的排列顺序具有显著的保守性,但兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)和比氏肠道微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)基因组中的Dicer-like基因在物种分化过程中发生了丢失。对Dicer-like基因和Agronaute相似蛋白基因、转座子的共存分析表明,家蚕微孢子虫等Nosema属微孢子虫均保留了古老的RNAi作用机制。RT-PCR检测被家蚕微孢子虫感染48~240 h的家蚕幼虫中肠中Nb DCL基因均有转录。研究结果为进一步探究家蚕微孢子虫RNAi的调控机制提供了有益线索。     

家蚕微孢子虫表面蛋白NBO_33g0013的序列特征及亚细胞定位与功能分析

选择家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)表面蛋白质谱数据库中新发现的假定表面蛋白NBO_33g0013进行研究,了解该蛋白质的功能及是否参与微孢子虫对宿主细胞的侵染过程。预测该蛋白质分子质量为26.1 k D,等电点为4.59,其序列N端具有信号肽,无跨膜螺旋结构,含3个N-糖基化位点,无O-糖基化位点,不具有典型的功能结构域,与柑橘凤蝶微孢子虫(Papilio xuthus)的一个假定蛋白序列相似度达到93%。以家蚕微孢子虫CQ1分离株的基因组DNA为模板克隆该蛋白质的编码基因,构建重组表达载体进行该蛋白质的原核表达,并制备获得多克隆抗体,通过间接免疫荧光分析确证该蛋白质定位在家蚕微孢子虫孢子表面。经体外细胞感染实验初步分析,尚未发现该蛋白质参与了微孢子虫孢子对宿主Bm E细胞的粘附过程,推测该蛋白质可能为家蚕微孢子虫孢壁的结构组成型蛋白质,在孢壁的构架形成中发挥作用。     

家蚕微孢子虫感染BmN细胞的差异表达基因筛选及Akirin的原核表达

为探究家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染宿主细胞的分子机制,以感染Nb的家蚕卵巢上皮细胞(BmN)为材料,通过GeneFishing技术进行基因差异表达分析,发现感染Nb的BmN细胞有10个基因被诱导或抑制表达,这些差异表达基因功能涉及蛋白质合成、细胞信号转导、线粒体呼吸链电子传递、细胞能量代谢、细胞免疫及一些未知功能。运用RT-PCR方法克隆在感染Nb的BmN细胞中差异表达的免疫相关基因Akirin,获得一个长588 bp的完整ORF,编码195个氨基酸,预测蛋白质分子质量21.98 kD,等电点为8.97,属于碱性蛋白,该蛋白质经SignalP在线预测未见信号肽。通过原核表达获得家蚕Akirin的外源融合表达蛋白,为进一步研究家蚕Akirin在家蚕先天免疫系统中的功能奠定了基础。     

家蚕微孢子虫几丁质酶基因的比较基因组学分析

几丁质是构成家蚕微孢子虫细胞壁的主要成分,广泛分布于原生生物、真菌、节肢动物和甲壳类生物之中,能够被几丁质酶(EC 3.2.1.14)水解。本文基于家蚕微孢子全基因组数据,采用生物信息学方法,鉴定获得家蚕微孢子虫几丁质酶基因,命名为Nb_chi。该基因有2个拷贝,其中一个Nb_chi_1长度为2 286bp,编码761aa,pI为6.35。含有一个信号肽以及一个Glyco_hydro_19结构域。另一个拷贝Nb_chi_2仅含552bp,183aa,仅含Glyco_hydro_19结构域部分,可能为一不完整的拷贝。系统进化分析显示,家蚕微孢子虫与其他种类的微孢子虫聚在同一个进化枝,均属几丁质酶第19族。本文为深入进行家蚕微孢子虫几丁质酶的功能研究奠定了基础。     

家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶基因的克隆及表达和亚细胞定位

半胱氨酸脱硫酶是一类活性依赖于磷酸吡哆醛的酶类,可催化L-半胱氨酸转化为L-丙氨酸和硫烷硫原子,为铁硫簇组装提供硫原子。基于家蚕微孢子虫基因组数据,克隆了家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶(NbNfs)基因。序列结构分析显示NbNfs含有其活性所需的保守氨基酸位点,但不具有线粒体型N端导肽;系统发育分析表明微孢子虫半胱氨酸脱硫酶与真菌线粒体型半胱氨酸脱硫酶聚为一类,属于类群Ⅰ,起源于α-变形细菌;共线性分析表明半胱氨酸脱硫酶基因在不同微孢子虫之间其基因座位保守,具有共线性。构建重组质粒pET30a(+)-NbNfs,并转化到E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达NbNfs融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化后,将融合蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,Western blotting检测NbNfs在成熟家蚕微孢子虫具有表达。胶体金免疫定位显示NbNfs主要定位于成熟家蚕微孢子虫的细胞质中。研究结果为家蚕微孢子虫铁硫簇组装途径的研究奠定了基础。     

重度感染家蚕微孢子虫的家蚕丝腺cDNA文库构建及EST测序分析

用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染家蚕品种大造的3龄幼虫,于感染后第10天选择有Nb重度感染特征的家蚕丝腺组织无菌操作提取RNA,构建Nb和家蚕丝腺混合样品cDNA文库(文库滴度≥1.6×106PFU/mL)。对文库进行测序,获得EST序列5 026条,其中家蚕丝腺EST3 901条、家蚕微孢子虫EST970条。拼接后,分别获得家蚕丝腺和Nb的单一EST(unique EST)563和383条。对EST和unique EST进行分析发现,感染后第10天家蚕丝腺中Nb的组蛋白、细胞分裂激酶等与孢子分裂增殖相关的基因表达水平较高,一些可能与Nb侵染或寄生适应相关的基因,如Nb孢壁蛋白、极丝蛋白、转运体蛋白等基因亦在此时期较高水平表达,尤其是此期间有相对高水平的组蛋白脱乙酰基酶基因表达,说明Nb基因的表达受到组蛋白去乙酰化方式的调控。对家蚕微孢子虫uniqueEST的序列特征分析发现,Nb mRNA UTR的长度和GC含量与其它微孢子虫差异较小,但ORF区的AT含量较高,即家蚕微孢子虫基因ORF序列较其它微孢子虫发生了高AT变化。Nb unique EST的功能注释及分类结果表明感染后第10天家蚕丝腺中的Nb孢子仍处于多形期,还未完全成熟化。     

响应面法优化桑椹白藜芦醇的提取工艺条件

白藜芦醇是一种具有抗氧化、抑菌、抗癌、保护心血管、延缓衰老等诸多生理作用的多酚化合物。以药食两用的桑椹为原料,在单因素试验基础上,采用中心组合法设计响应面试验优化桑椹白藜芦醇的提取工艺条件。结果表明,桑椹中白藜芦醇提取的最佳工艺参数为:以甲醇作为提取剂,料液比1∶30,提取温度27.5℃,提取时间8.0 h。通过液相色谱对桑椹中的白藜芦醇进行定性定量分析,桑椹冻干粉中白藜芦醇的提取量为315.30μg/g。     

家蚕Prosβ1基因在蛾翅及早期发育中的作用

家蚕是鳞翅目的代表物种,研究其翅发育相关基因有助于理解影响昆虫翅发育的内在因素,为鳞翅目害虫的遗传防治提供理论基础和靶标。家蚕的蛋白酶体β亚基1(Bombyx mori proteasome subunitβtype-1,BmProsβ1)是家蚕蛋白酶体核心颗粒的组件之一,负责水解折叠错误或细胞不需要的蛋白质,在细胞发育和器官形成过程中发挥重要作用。利用RNAi干扰技术,在家蚕体腔翅原基附近注射体外合成的针对BmProsβ1基因的小RNA,qRT-PCR检测试验组翅原基中BmProsβ1的表达水平得到有效抑制;对干扰后翅表型的统计结果显示,试验组中小翅个体的比率占52.38%,而对照组中未出现小翅个体。表明在BmProsβ1表达受到抑制的情况下,会严重影响家蚕翅的发育。进一步利用CRISPR/Cas9技术对BmProsβ1进行基因敲除实验,结果显示注射sgRNA与Cas9 mRNA的蚕卵孵化率极低并在幼虫期死亡,而对照组孵化率达到37.92%。这表明BmProsβ1基因在家蚕的早期发育过程中也起到重要作用,其功能缺失会导致家蚕胚胎和幼蚕致死。     

家蚕抗血液型脓病新品种华康3号的育成

家蚕血液型脓病是养蚕生产最主要的病害之一,选育家蚕抗血液型脓病新品种对于稳定蚕桑生产具有重要的作用。选择优质高产家蚕品种菁松和皓月作为受体,用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)抗性基因载体品系N作供体,采用杂交、回交(受体作回交亲本连续回交4代)和显性基因纯合固定技术将抗性基因导入受体品种;通过系统选择提高、稳定后代的综合经济性状,育成对家蚕血液型脓病具有高度抵抗性的家蚕新品系并组配成优质、高产新品种菁松N×皓月N(华康3号)。新品种对血液型脓病的抵抗能力比原品种菁松×皓月高10 000倍以上,综合经济性状与原品种菁松×皓月相仿。该品种于2018年3月通过四川省蚕品种审定委员会审定,适合在长江、黄河流域及其他区域饲养。     

陕西省5个主栽桑树品种桑叶主要活性成分的含量及活性比较

为了解陕西省地理环境对桑叶主要活性成分的影响,利用液相色谱-质谱联用法对陕西省主栽的5个桑树品种桑叶中的5种主要活性成分进行定性及定量分析,同时通过DPPH、FRAP法和α-葡萄糖苷酶抑制率检测法测试其抗氧化性能和糖苷酶抑制活性。结果表明,不同桑品种桑叶中的活性成分含量及其生物活性均有显著差异。育711号中的荞麦碱和1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量均显著高于其他品种,质量分数分别达到1.84和0.78 mg/g;桐乡青桑叶中的绿原酸和异槲皮苷含量显著高于其他品种,而强桑1号桑叶中的芦丁含量显著高于其他品种,质量分数分别为6.08、1.78和1.46 mg/g。桐乡青桑叶提取物的FRAP抗氧化活性显著高于其他品种,荷叶白桑叶提取物的DPPH自由基清除能力显著高于其他品种,经主成分分析发现这2个桑品种桑叶提取物的抗氧化活性优于其他品种。农桑14号桑叶提取物的α-葡萄糖苷酶抑制率显著高于其他品种,达到了95.90%。桑叶中的绿原酸含量普遍较高,质量分数达到0.39%～0.61%,表明桑叶可以作为一种富含绿原酸的潜在植物资源加以利用。     

家蚕感染BmCPV相关未知功能蛋白LOC101742613的基因克隆及表征特征分析

在感染家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrovirus,BmCPV)的家蚕中肠组织中发现一个表达量明显下调的未知蛋白LOC101742613,与棉铃虫(Helicoverpa armigera)的未知蛋白LOC110378285的序列一致性为51%。利用PCR技术克隆获得了编码该蛋白质的cDNA,其序列全长为1 114 bp,最大开放阅读框(ORF)为993 bp,编码的蛋白质由330个氨基酸残基组成,预测蛋白质分子质量为36.6 kD,等电点为4.31。实时荧光定量PCR分析发现目的基因主要在家蚕的脂肪体、精巢、卵巢和头部组织中表达,且家蚕中肠感染BmCPV后48 h和72 h其mRNA的表达量显著下调,分别为对照组的7.3%和2.1%。通过构建重组表达载体pET28a/BGIBMGA014203对去掉信号肽的目的蛋白进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现重组蛋白主要在包涵体中,分子质量约为37 kD。研究结果为进一步阐明目的基因的生物学功能奠定了基础。     

昆虫眠性调控相关基因的研究进展

入眠是昆虫幼虫生长发育过程中非常重要的一种生理现象,其入眠蜕皮过程主要包括促前胸腺激素(PTTH)介导的蜕皮激素合成、蜕皮激素介导的信号转导和最终皮层溶离及色素沉积3个阶段,是一个复杂的生理过程,受到许多因素的影响,其中蜕皮激素和保幼激素等因素的影响较为显著。基于此,本文论述了蜕皮激素信号通路相关基因、保幼激素合成与代谢相关基因、相关神经肽基因及其他相关基因对昆虫眠性的影响。通过对这些基因进行综述,可以为系统研究家蚕等昆虫入眠蜕皮过程中的生理生化反应提供理论依据,对昆虫生长发育和生殖的研究以及农林害虫防控都有十分重要的意义。     

家蚕品种秋丰×白玉耐氟性状的遗传分析及耐氟主效基因的初步定位

家蚕品种秋丰×白玉是一对耐氟性较强的夏秋用蚕品种,其中以亲本白玉A的耐氟性最强。以白玉A与耐氟性较弱的皓月B为亲本组配各种杂交世代进行耐氟性的遗传分析,结果表明在一定浓度的氟化物添食范围内,其耐氟性遗传呈显性遗传,受主效基因控制,并且具有部分伴性遗传效应和明显的杂种优势。利用SSR分子标记对耐氟性状进行连锁分析,初步确定耐氟主效基因与第12连锁群中的2个标记(chr12-2990-1和chr12-2990-2)紧密连锁。     

6个种源地不同桑树品种叶柄解剖结构与水分运输能力初探

叶柄是水分和营养物质在茎和叶间运输的重要组织。采用石蜡切片技术和木材离析技术,分析6个种源地不同的桑树品种一年生扦插苗叶柄的显微结构特征,对叶柄的水分运输能力和抗蒸腾能力进行评价,并对桑树的抗旱性进行探讨。结果显示在6个桑品种中,吴堡桑的叶柄角质层和厚角组织厚度较小,但维管束最为发达,具有较高的维管束面积占比、中等水平的导管直径和最大的导管长度,水分运输能力最强,同时还能保持对栓塞较强的抵抗性,推测其抗旱能力可能较强,适宜种植在较为干旱的地区;育711号的叶柄角质层较薄,云果桑1号叶柄的厚角组织最薄,这2个品种的叶柄具有较多的维管束,但其维管束面积占比、导管孔腔面积以及导管直径在6个品种中较小,故抗蒸腾能力与水分运输能力均较低,其抗旱能力可能相对较弱,更加适合在水分充足的环境中生长。研究结果为阐释桑树叶柄结构、水分运输能力与桑树抗旱能力之间的关系提供了一定的实验依据。     

9个基因在桑树硬枝扦插生根过程中的表达特性分析

桑树扦插生根涉及复杂的生物学过程,受多种内源激素和环境因素的调节。为发掘桑树扦插生根相关基因,为桑树扦插不定根的形成和调节提供分子理论依据,采用桑品种育711号1年生硬枝为插穗,分别以传统愈伤组织生根技术和新的可诱导皮部生根的技术进行处理,以清水处理为对照,利用qRT-PCR技术检测PPO1、PPO2、PPO3、HSP83A、ILL5、GH3.1、SAUR2、Cacybp、ANT1 9个基因在愈伤组织生根和皮部生根2种生根形式生根过程中的表达变化。结果显示在扦插生根的不同发育阶段,9个基因在皮部生根处理组的表达量均明显高于愈伤组织生根处理组和对照组,且各个基因表达量在不同形式的生根过程中表现出不同的变化趋势,初步推测这些基因在不定根的形成中均发挥了重要作用。研究结果将丰富桑树甚至其他林木扦插生根机制的内容,并可为进一步开发高效实用的桑树扦插技术奠定良好的理论基础。