柱花草磷转运蛋白SgPT1的克隆和表达分析

磷是植物生长所必需的大量元素。高亲和磷转运子是控制植物对磷吸收和转运的主要蛋白。本研究以磷高效的柱花草基因型TPRC2001-1为对象,首先建立低磷胁迫下TPRC2001-1根系全长cDNA文库。通过同源克隆的方法,首次克隆到编码柱花草高亲和磷转运蛋白的基因,SgPT1。该基因全长cDNA为1 994 bp,编码538个氨基酸残基,蛋白分子量为59 kD。SgPT1蛋白具有高亲和磷转运子的结构特点,即含有“6+6”跨膜结构。而且,定量PCR分析结果表明低磷胁迫显著促进SgPT1在根部的表达,表明该基因可能参与低磷胁迫下磷的吸收和转运的过程。总之,以上结果表明SgPT1的加强表达可能是TPRC2001-1适应低磷胁迫的分子机制之一,为进一步研究柱花草适应低磷的分子机制提供候选基因。     

柱花草SgLPR1基因克隆与表达分析

植物的生长和发育受土壤磷有效性的影响。柱花草(Stylosanthes guianensis)是主要的热带豆科牧草，对低磷胁迫表现出优良的适应性。由LPR基因编码的多铜氧化酶被报道在调控植物根系生长和低磷响应方面发挥重要作用。本研究分析了低磷胁迫对两个柱花草基因型生长的影响，并对SgLPR1基因进行了克隆和表达分析。结果表明：相对柱花草基因型‘TF0285’，‘TF0277’具有较高的植株干重和磷吸收效率，且低磷处理促进了‘TF0277’根系的生长。基因克隆分析表明，SgLPR1基因全长为1 713 bp，编码570个氨基酸残基，蛋白分子量为64.1 kDa，属于Cupredoxin家族成员，亚细胞定位预测SgLPR1蛋白定位于内质网上。实时定量聚合酶链反应(PCR)结果表明，SgLPR1基因在柱花草茎中表达量高于其他组织中的表达量，且在根尖大于1 cm的根段中表达量最高。相比对照处理，缺氮、缺磷和缺钾处理均增加了SgLPR1基因在柱花草叶和根中的表达量。此外，低磷处理增加了SgLPR1基因在柱花草‘TF0277’根中的表达，但其在‘TF0285’根中的表达无显著变化。本研究结果揭示了...     

柱花草SgALMT1基因克隆与表达分析

为探索铝激活苹果酸转运蛋白(Aluminum-activated malate transporter, ALMT)在植物适应酸性土壤铝毒害中的重要作用,本研究以柱花草(Stylosanthes guianensis)为研究材料,克隆了柱花草SgALMT1基因,并进行了生物信息学、亚细胞定位及基因表达分析。结果表明：SgALMT1基因全长为1 350 bp,编码450个氨基酸残基,蛋白分子量为50.6 kDa,包含6个跨膜结构域;亚细胞定位分析表明,SgALMT1蛋白定位在拟南芥原生质体细胞膜上,为膜蛋白。定量PCR结果表明,SgALMT1基因在柱花草叶中的表达量高于根中的表达量;铝处理增强了SgALMT1基因在柱花草根中的表达,表明SgALMT1基因可能参与了柱花草应对铝胁迫;另外,缺氮处理增强了SgALMT1基因在柱花草叶中的表达,而缺磷处理增强了SgALMT1在根中的表达。本研究结果为解析柱花草响应铝毒害和养分缺乏的机理提供了候选基因资源。     

低温胁迫对细茎柱花草与TPRC2001-1柱花草抗寒生理指标的影响

为了探究柱花草的抗寒性,本研究以细茎柱花草(Stylosanthes guianensis var.intermedia)和TPRC2001-1柱花草(S.guianensis‘TPRC2001-1’)营养期叶片为材料,分别进行时长为0(对照)、24h和48h的低温处理,然后对其相对电导率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖以及可溶性蛋白的含量等指标进行测定与分析。结果表明,两种柱花草叶片的抗寒性生理指标随着低温处理时间的增加逐步上升。低温处理后,细茎柱花草的相对电导率和丙二醛含量显著低于TPRC2001-1柱花草(P0.05),而脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量显著高于TPRC2001-1柱花草(P0.05)。综合各项生理指标可得,两种柱花草的抗寒性强弱为细茎柱花草TPRC2001-1柱花草。     

地毯草铝响应基因AcABCG1的克隆与表达分析

铝毒抑制植物根系生长,是酸性土壤上限制作物产量的重要因素之一。ABC转运蛋白在金属离子转运和非生物胁迫应答等方面起作用。本研究以地毯草（Axonopus compressus）为材料,克隆了地毯草编码ABC转运蛋白AcABCG1基因,并对其进行了生物信息学和基因表达模式分析。结果表明,AcABCG1基因cDNA全长为2 434 bp,编码811个氨基酸残基,蛋白分子量为91.85 kD。亚细胞定位预测表明AcABCG1定位于细胞质膜上。定量PCR结果发现,金属铝（Al）、镉（Cd）和镧（La）处理均能显著增强AcABCG1基因在地毯草根系中的表达。不同铝浓度和时间处理进一步表明了AcABCG1基因在转录水平上响应铝胁迫。此外,AcABCG1基因在根中的表达量显著高于茎和叶中的表达量,且AcABCG1基因主要在0~1 cm根尖中表达。本研究结果为进一步挖掘AcABCG1基因参与地毯草耐铝毒的生物学功能奠定基础。     

低磷胁迫对太空诱变耐低磷柱花草酸性磷酸酶活性和磷效率的影响

低磷胁迫是酸性土壤限制牧草生产的主要障碍因子之一。本课题组前期的研究中,通过太空诱变获得了一个耐低磷柱花草突变体TPRC2001-84,但其适应低磷胁迫的机制仍不清楚。以TPRC2001-84及其亲本热研2号(RY2)为试验材料,通过水培方法,比较正常供磷(+P,250μmol·L-1 KH2PO4)和低磷(-P,5μmol·L-1KH2PO4)处理对TPRC2001-84和RY2生物量、磷吸收效率、磷利用效率、可溶性磷浓度、细胞壁磷含量和酸性磷酸酶(ACP)活性的影响。结果表明,相对于正常供磷处理,低磷处理显著降低了两份柱花草材料的植株干重和磷吸收效率(P0.05),但显著提高了两份柱花草材料的磷利用效率(P0.05)。并且,TPRC2001-84在低磷处理下的植株干重和磷利用效率分别是RY2的1.6和1.4倍。在低磷胁迫下,虽然TPRC2001-84叶片和根系的细胞壁磷含量只有RY2的70%左右,但是,TPRC2001-84叶片和根系的可溶性磷浓度分别比RY2高36.8%~42.6%,细胞壁ACP活性分别比RY2高46.6%~53.6%。以上结果说明,柱花草TPRC2001-84在低磷胁迫下具有较高的细胞壁ACP活性,有利于其对细胞壁中贮存磷的活化利用,从而获得较高的磷利用效率。这将为选育磷高效柱花草新品种提供理论依据和种质材料。     

镉胁迫对3种柱花草生长及植株镉积累和分配的影响

利用不同浓度镉离子(Cd²⁺)溶液对3个柱花草(Stylosanthes spp.)品种进行不同程度的胁迫处理,以研究Cd²⁺胁迫对柱花草生长、镉积累及其分配的影响。结果表明:随着Cd²⁺浓度的增加,3种柱花草生长均受到抑制,Cd²⁺胁迫对西卡柱花草(Stylosanthes scabra cv.Seca)株高、分枝数、地上部和地下部生物量影响最大,其次是TPRC2001-1柱花草(Stylosanthes guianensis.TPRC2001-1),而热研2号柱花草(Stylosanthes guianensis cv.Reyan2)影响最小;在Cd²⁺胁迫下3种柱花草地上部和地下部Cd²⁺含量均显著增加,TPRC2001-1柱花草体内含Cd²⁺量较热研2号柱花草和西卡柱花草大;地上部富集系数随Cd²⁺浓度增加呈下降趋势,且在低Cd²⁺浓度(≤1 mg·kg^-1)下更易富集Cd²⁺;Cd²⁺转运系数呈现先上升后下降。     

低磷胁迫对太空诱变耐低磷柱花草酸性磷酸酶活性和磷效率的影响

低磷胁迫是酸性土壤限制牧草生产的主要障碍因子之一。本课题组前期的研究中,通过太空诱变获得了一个耐低磷柱花草突变体TPRC2001-84,但其适应低磷胁迫的机制仍不清楚。以TPRC2001-84及其亲本热研2号(RY2)为试验材料,通过水培方法,比较正常供磷(+P,250 μmol·L^-1 KH₂PO₄)和低磷(-P,5 μmol·L^-1 KH₂PO₄)处理对TPRC2001-84和RY2生物量、磷吸收效率、磷利用效率、可溶性磷浓度、细胞壁磷含量和酸性磷酸酶(ACP)活性的影响。结果表明,相对于正常供磷处理,低磷处理显著降低了两份柱花草材料的植株干重和磷吸收效率(P<0.05),但显著提高了两份柱花草材料的磷利用效率(P<0.05)。并且,TPRC2001-84在低磷处理下的植株干重和磷利用效率分别是RY2的1.6和1.4倍。在低磷胁迫下,虽然TPRC2001-84叶片和根系的细胞壁磷含量只有RY2的70%左右,但是,TPRC2001-84叶片和根系的可溶性磷浓度分别比RY2高36.8%~42.6%,细胞壁ACP活性分别比RY2高46.6%~53.6%。以上结果说明,柱花草TPRC2001-84在低磷胁迫下具有较高的细胞壁ACP活性,有利于其对细胞壁中贮存磷的活化利用,从而获得较高的磷利用效率。这将为选育磷高效柱花草新品种提供理论依据和种质材料。     

13份柱花草品系生产性能比较

为筛选出性状优良的柱花草(Stylosanthes)品种,2011-2014年对13份柱花草品种(系)的株高、存活率、茎叶比、抗炭疽病能力、干草产量、种子千粒重和产量及养分进行测定分析,并采用隶属函数法对其综合生产性能进行评价。结果表明,13份柱花草品系初花期在9~(-1)1月;TPRC2001-84柱花草植株存活率最高(72.6%),TPRC 2001-81其次(56.6%);13份柱花草品系均较抗柱花草炭疽病;TPRC 2001-84柱花草年均干草产量最高(15 968kg·hm-2),TPRC2001-81和热研20号其次(12 206和12 724kg·hm-2);TPRC 2001-85柱花草种子产量最高(56.7kg·hm-2);热研21号柱花草粗蛋白含量最高(21.57%),热研20号和热研21号柱花草粗脂肪和磷含量较高,热研20号(CK)柱花草钙含量最高,TPRC 2001-85柱花草钾含量最高。TPRC 2001-84、热研21号、TPRC 2001-85和TPRC 2001~(-1)柱花草的综合生产性能较优,适于在热带亚热带地区推广种植。     

青海野生草地早熟禾响应干旱胁迫的代谢通路及转录调控分析

为探究青海野生草地早熟禾（Poa pratensis）响应干旱胁迫的分子机制,本研究以青海野生草地早熟禾抗旱材料‘10-202’和敏感材料‘09-61’为研究对象,采用高通量Illumina Hiseq测序技术对15% PEG-6000模拟的干旱胁迫和正常处理下的2份材料的叶片进行差异基因表达分析。结果表明：‘10-202’处理间存在3 166个差异表达基因（Different expression genes,DEGs）,上调和下调表达基因数目分别为1 979和1 187个;‘09-61’处理间共有314个DEGs,上调表达的有64个,下调表达的有250个。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析发现,2份材料的差异基因均显著富集在淀粉和蔗糖代谢通路。运用MapMan软件对‘10-202’干旱胁迫下与转录调控相关的差异基因进行了功能注释,发现bHLH,AP2/EREPB及C2H2锌指家族转录因子在响应干旱胁迫中发挥着重要作用。本研究为后续挖掘草地早熟禾耐旱相关候选基因的克隆和功能验证奠定了理论基础。     

柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆与表达分析

为了探究植物天然抗性相关巨噬蛋白（Nramp）在金属元素吸收、转运和分配等方面的重要作用，本研究以柱花草（Stylosanthes guianensis）为材料，采用PCR方法克隆了柱花草SgNramp1/2基因，并分析了该基因的表达模式。结果表明：SgNramp1和SgNramp2基因全长分别为1 654 bp和1 716 bp，且均含有12个跨膜结构域。基因表达分析发现，SgNramp1在柱花草根部的表达高于叶部，而SgNramp2则在叶中特异性表达；金属元素缺乏和过量胁迫对SgNramp1/2基因表达的影响有所差异，缺锰（-Mn）处理抑制了SgNramp1/2基因在根和叶中的表达，而缺铁（-Fe）处理则增强了SgNramp2基因在叶中的表达，但抑制了其在根中的表达，SgNramp1/2基因在根和叶中的表达至少受到一种元素过量胁迫的影响。此外，金属镉（Cd）处理均增强了SgNramp1/2基因在柱花草根中的表达，而铝（Al）和镧（La）处理抑制了SgNramp1基因的表达，但增强了SgNramp2基因的表达。本研究结果表明SgNramp1/2基因可能参金属离子的转运。     

柱花草响应炭疽菌侵染的差异磷酸化蛋白质组学分析

磷酸化是重要的蛋白翻译后修饰，在调节植物免疫方面起重要作用，但目前对柱花草与炭疽菌互作的磷酸化知之甚少。本文以太空诱变柱花草抗病株系‘2001-84’和感病株系‘2001-71’为试验材料，通过非标记定量磷酸化蛋白质组学，分析了两种株系接种炭疽菌前后的差异磷酸化蛋白。结果表明：在‘2001-84’和‘2001-71’中分别有138个和106个蛋白的磷酸化丰度特异性响应炭疽菌侵染。蛋白功能与代谢通路富集分析发现两者具有明显的差异：‘2001-84’特异性磷酸化蛋白主要定位在质膜附近，参与胞内信号传导，并显著富集在MAPK级联信号通路、植物激素信号传导、病原菌互作途径等代谢通路；‘2001-71’则更多的定位于细胞器膜上，参与细胞器的分解，代谢通路只在剪接体途径显著富集。通过对‘2001-84’特异性磷酸化蛋白进一步分析，发掘了跟抗病相关的蛋白。本文研究可为后续解析柱花草抗炭疽病的分子机制和培育柱花草抗病品种提供参考。     

紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的分离及遗传转化研究

WRKY转录因子是植物特有的转录因子,广泛参与植物对多种逆境胁迫的反应。但是对紫花苜蓿中WRKY转录因子的研究还较少。本研究从紫花苜蓿中克隆了一个WRKY I类转录因子MsWRKY33。该基因CDS全长1536 bp,编码512个氨基酸,结构分析显示MsWRKY33包括两个WRKY结构域和一个C2H2锌指结构(C-X4-C-X23-H-X-H),表明其属于WRKY I 族WRKY转录因子。亚细胞定位预测MsWRKY33蛋白定位在细胞核。MsWRKY33基因受盐、干旱和冷胁迫诱导,暗示基因可能参与了这些逆境胁迫的调控。构建原核表达载体pET-MsWRKY33, SDS-PAGE分析表明在大肠杆菌中表达了MsWRKY33蛋白。扩增MsWRKY33编码区cDNA,以pBI121为基础载体,构建植物超表达载体pBI121-MsWRKY33。采用农杆菌介导的愈伤组织培养法转化紫花苜蓿。利用nptⅡ基因引物和载体特异引物检测抗性苗呈阳性,表明目的基因已成功导入紫花苜蓿基因组中。qRT-PCR检测发现,MsWRKY33基因在转基因株系中得到增强表达。本研究为进一步探索WRKY转录因子基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。     

蒙农杂种冰草AcdMYB1基因克隆及表达分析

‘蒙农杂种’冰草(Agropyron cristatum×A.desertorum‘Hycrest-Mengnong’)具有干草产量高，适口性好，抗逆性强的特点，是中国北方干旱地区建立人工草地的适宜草种。本研究利用同源克隆方法从‘蒙农杂种’冰草中克隆得到的1个MYB类转录因子基因(命名为AcdMYB1),对其进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明：该基因cDNA序列长度为1 161 bp,包含完整开放阅读框(ORF)为969 bp,编码322个氨基酸，具有MYB转录因子的保守结构域。AcdMYB1与小麦族的山羊草、普通小麦、野生二粒小麦的同类基因亲缘关系最近，序列一致性均在90%以上。组织表达中AcdMYB1基因在穗中的表达量最高，其次为叶、根，茎中表达量最低；在模拟自然干旱胁迫下，能够显著降低AcdMYB1的表达水平。烟草亚细胞定位显示，该蛋白定位于细胞核。本研究为进一步探索‘蒙农杂种’冰草AcdMYB1基因及MYB转录因子家族提供了科学依据。     

转紫花苜蓿MsLEA2基因提高拟南芥耐铝毒性研究

MsLEA2基因是从紫花苜蓿中克隆到的胚胎晚期富集蛋白基因,属于LEA_2家族。以转基因拟南芥T_3代植株的3个株系为材料,从表型、生理和分子生物学三个方面研究铝胁迫下转MsLEA2基因拟南芥的耐铝毒性能。结果表明:铝胁迫下转基因株系的脯氨酸含量高于对照(野生型),丙二醛含量和电导率则低于对照且差异显著(P0.05),CAT、POD和SOD活性显著高于对照。初步证明转MsLEA2基因拟南芥的耐铝毒性能明显高于对照,紫花苜蓿的MsLEA2基因具有提高植物耐铝毒胁迫的能力。     

圭亚那柱花草苗期抗旱性评价及抗旱种质鉴定

本研究用水培试验方法，分别在15%聚乙二醇6000（Polyethylene glycol，PEG-6000）模拟干旱胁迫5 d和14 d后对93份圭亚那柱花草（Stylosanthes guianensis Sw.）的枯叶率、相对叶绿素含量、相对含水量、净光合速率、气孔导度及蒸腾速率进行测定，运用相关性分析、主成分分析、隶属函数法等方法对圭亚那柱花草种质进行抗旱性综合评价并筛选抗旱种质。隶属函数抗旱能力排序表明，在处理的第5 d，71（CIAT10598），73（CIAT10347），72[Wangtingbiao（Qi）]，74（Graham），32（TPRC2001-54），39（TPRC2001-26），33[GC1480（IRRI）]和37（TPRC2001-14）等8份材料抗旱性最差，表现为干旱敏感材料；在处理的第14 d，91（TPRC2001-83），82（Nan02145），19（CIAT11362），59（Endeavour），67（Reyan No.2），80（CIAT87830），55（TPRC90033），45（TPRC L2），27（TPRC2001-68），5（TPRC2001-85），23（TPRC2001-20）和50[TPRC90005（1）]等12份材料表现出较强抗旱能力。根据隶属函数排名选取部分材料进行土壤条件下抗旱性验证，结果表明59（Endeavour）和23（TPRC2001-20）的抗旱性明显优于其它材料。本试验可为柱花草抗旱育种提供理论依据。     

野生大豆盐胁迫响应基因GsPIP的克隆及其序列分析

盐胁迫是影响植物生长、发育以至产量的重要因素,野生大豆是优良的非生物胁迫抗性材料,是天然的优质抗性基因库.本研究以耐盐东北野生大豆为试材.利用东北农业大学植物生物工程研究室已获得的基因芯片杂交结果,对植物生物工程研究室构建的野生大豆盐胁迫EST数据库中各EST在胁迫下的表达情况进行了分析,从中选出了1个在高盐、低温、干旱胁迫早期均上调表达的3'-EST,序列分析表明该EST编码质膜结合蛋白(plasma membrane intrinsic protein,PIP),属于主嵌入蛋白(major intrinsic protein,MIP)家族;通过电子克隆和改进的5‘-RACE获得了基因完整的编码区;其翻译产物与含羞草质膜结合蛋白的相似性为90%,将该基因命名为GsPIP.GsPIP基因的翻译产物具有主嵌入蛋白家族特征性的跨膜结构域,无信号肽,与已发现的植物PIP蛋白一致.本研究获得的基因具有自主知识产权,通过进一步的功能分析,可为耐渗透胁迫基因工程研究提供基因资源,并为植物耐渗透胁迫机理研究提供依据.     

香蕉MaUFGT1基因克隆及表达分析

从香蕉果肉中克隆得到了一个类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因UFGT1基因全长,利用生物信息学方法分析了该基因的基本理化性质、蛋白二级结构、亚细胞定位、亲疏水性、信号肽、跨膜区、磷酸化位点、基因结构、保守结构域、系统进化关系,并对该基因的时空表达模式及香蕉果实不同发育阶段进行了表达分析。结果表明：UFGT1基因长1380bp,编码459个氨基酸的蛋白质；该蛋白为疏水性蛋白,亚细胞定位在叶绿体,蛋白无跨膜结构,不存在信号肽；MaUFGT1在不同组织中均有表达,但表达丰度存在差异；MaUFGT1在‘巴西’和‘香粉1号’两个不同品种中,随着果实成熟,其表达量逐渐上升,后期‘香粉1号’明显高于‘巴西’。这些结果表明,MaUFGT1可能参与了香蕉果肉黄酮类物质的合成,为进一步研究MaUFGT基因的功能奠定了基础。     

柱花草磷高效种质筛选及根系形态对低磷胁迫的响应分析

为筛选磷高效柱花草（Stylosanthes guianensis）种质并解析其根系适应低磷胁迫的机理,本试验水培了31份柱花草,开展了磷效率评价,分析了低磷胁迫对柱花草根系的影响,并检测了6个扩展蛋白基因（Expansins,EXP）响应低磷胁迫的表达模式。结果表明,低磷胁迫显著降低柱花草的干重和全磷含量。磷效率分析结合根系表型显示,TF291为磷高效高响应型,且低磷胁迫显著促进其根系生长,TF343为磷低效低响应型,且低磷条件下其根系生长显著受抑制。荧光定量PCR表明,低磷处理（-P）使SgEXPB2在TF291和TF343根系中的表达分别增加3.73倍和1.52倍（P<0.05）,SgEXLB1在TF291根系中表达增加1.61倍（P<0.05）。综上所述,本研究筛选到磷高效高响应型柱花草种质为TF291,且根系中SgEXPB2和SgEXLB1基因上调表达,可能参与柱花草适应低磷胁迫。     

紫花苜蓿atpA基因的克隆及表达模式分析

叶绿体atpA基因位于ATP合酶的CF₁上，编码α亚基，是光合作用不可缺少的关键基因。本研究利用RT-PCR技术，从‘新疆大叶’苜蓿（Medicago sativa L.‘Xinjiang Daye’）中克隆出atpA基因，并进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR技术进行基因表达模式检测。结果显示，MsatpA基因编码510个氨基酸，相对分子质量为55.71 KD，等电点为5.22。MsAtpA蛋白含有多个磷酸化位点且无跨膜结构和信号肽，二级结构中α-螺旋占比最高；亚细胞定位预测该基因编码的蛋白位于叶绿体中，与同为豆科苜蓿属的黄花苜蓿（Medicago falcata）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的AtpA氨基酸序列同源性较高。表达模式检测结果显示，MsatpA基因在叶中的表达量最高，根中最少；结荚期的基因表达量显著高于其他发育时期；MsatpA基因响应低温、高温、盐和渗透胁迫应答，且呈现出不同的表达特点。研究结果为紫花苜蓿atpA基因功能研究奠定基础。