EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建与表达(英文)

目的构建EB病毒基因LMP2A、BZLF1重组分泌性表达质粒Ag85B,然后将它成功转化成卡介苗。方法分别用PCR扩增Ag85B信号序列和LMP2A和BZLF1融合基因,将Ag85B信号序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒pMV261重组构建获得质粒pMVS。然后将LMP2A和BZLF1融合基因Z2A与质粒pMVS重组获得质粒pMVZ2A,将其电转化卡介苗,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其结果进行分析。结果信号序列与LMP2A和BZLF1融合基因被正确插入分泌表达载体pMV261。重组质粒经限制性内切酶双酶切、PCR扩增、基因测序等鉴定。蛋白纯化后可得到一条带。结论 pMVZ2A在BCG中能够分泌表达,本研究为获得抗结核杆菌和EB病毒的双价疫苗奠定了基础。     

钩吻素子对免疫磁珠分离纯化的小鼠CD4+T细胞体外增殖的影响

目的 探讨小鼠脾脏CD4⁺T细胞的分离方法,观察钩吻素子(Kou)对小鼠脾脏CD4⁺T细胞体外增殖的影响.方法 以免疫磁珠分选法从小鼠脾脏细胞中分离CD4⁺T细胞,流式细胞术检测所得细胞的纯度,台盼蓝法检测细胞活力.将10～20μg/ml Kou分别作用于经刀豆蛋白A或植物血凝素刺激的小鼠T淋巴细胞,四唑盐比色法检测细胞增殖情况,用酶联免疫法检测细胞上清中IL-2的含量.结果 经过流式细胞仪测定分离后的小鼠脾脏CD4⁺T细胞纯度达到90.%±5.8%:0.2%台盼兰染色细胞活力为94.9%±.6%;增殖试验表明分离后未加Kou的CD4⁺T细胞对刀豆蛋白A、植物血凝素的刺激保持了良好的增殖能力,当浓度范围为20～20μg/ml时,Kou均能抑制淋巴细胞的增殖(P<0.05),且表现出一定的剂量相关性;不同浓度的Kou(20、100、200μgm1)作用后,CD4⁺T细胞培养上清中的IL-2水平明显低于对照组(P<0.05).结论 免疫磁珠阴性分选法操作简单、快速,可获得较高纯化率、有活性的CD4⁺T细胞;Kou明显抑制小鼠CD4⁺T淋巴细胞增殖反应,此抑制作用可能与Kou抑制小鼠CD4⁺T细胞IL-2的分泌及免疫抑制作用相关.     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建与表达

目的 构建EB病毒基因LMP2A、BZLF1重组分泌性表达质粒Ag85B,然后将它成功转化成卡介苗.方法 分别用PCR扩增Ag85B信号序列和LMP2A和BZLF1融合基因,将Ag85B信号序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒pMV261重组构建获得质粒pMVS.然后将LMP2A和BZLF1融合基因Z2A与质粒pMVS重组获...     

HBV慢性感染者肝脏组织中CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs细胞的表达水平

?目的:计数慢性乙型肝炎病毒( HBV)感染者肝脏组织中CD4⁺T、CD8⁺T和FoxP3⁺Tregs细胞,观察不同免疫状态下的肝脏组织中CD4⁺T和CD8⁺T细胞表达水平之间的差异,探索其临床意义。方法: 选取慢性HBV感染者68例,健康对照组(非HBV感染组)30例,运用免疫组织化学的方法进行检测。结果:慢性HBV感染组的CD4⁺T、CD8⁺T和FoxP3⁺Tregs细胞表达水平明显升高,与非HBV感染组相比,P均<0.001;在HBV感染组中,CD4⁺T和CD8⁺T细胞在免疫耐受期患者肝脏组织中的表达水平最低,CD4⁺T、CD8⁺T细胞在免疫清除期、再活动期中的表达水平与二者在免疫耐受期相比,均有增高趋势,然而CD4⁺T、CD8⁺T细胞的表达水平在免疫耐受期、免疫清除期、低复制期及再活动期任意两期之间比较,P均>0.05。结论:CD4⁺T和CD8⁺T细胞在免疫耐受期、免疫清除期、低复制期及再活动期患者肝脏组织中表达水平的变化趋势在一定程度上反应了各期肝脏的免疫状态;FoxP3⁺ Tregs细胞可能与HBV感染慢性化有关。     

不同CD4+基线值艾滋病患者高效抗逆转录病毒治疗后免疫重建效果观察

目的 了解高效抗逆转录病毒疗法（highly active antiretroviral therapy,HAART）治疗艾滋病（acquired immune deficiency syndrome,AIDS）患者时,不同CD4⁺基线值艾滋病患者经过治疗后免疫重建效果的差异,为艾滋病患者临床治疗措施的改进提供理论依据。方法 2016 年1月—2017年3月期间,随机选取符合研究要求的艾滋病患者174例,根据CD4⁺T淋巴细胞基线值的不同分为两组,低值组（CD4⁺T淋巴细胞<200/mm³）和高值组（CD4⁺T淋巴细胞≥200/mm³）,每组均为87例患者,比较两组患者治疗前后（1个月、3个月、6个月、12个月）外周血T淋巴细胞各项指标（包括Treg、Th2、Th17、CD4⁺T、CD8⁺T）检测结果的统计学差异。结果 两组患者基本情况和治疗方式构成的差异均无统计学意义（P>0.05）;两组患者治疗3个月（Th17、CD4⁺T、Th17/Treg、CD4⁺T/CD8⁺T） 、治疗6个月（Treg、Th17、CD4⁺T、CD8⁺T、Th2/Treg、Th17/Treg、CD4⁺T/CD8⁺T）、治疗12个月（Treg、Th2、Th17、CD4⁺T、CD8⁺T、Th2/Treg、Th17/Treg、CD4⁺T/CD8⁺T）指标的差异具有统计学意义（P<0.05）;三组患者不同时点指标（Treg、Th2、Th17、CD4⁺T、CD8⁺T、Th2/Treg、Th17/Treg、CD4⁺T/CD8⁺T）的差异具有统计学意义（P<0.05）;两组患者T淋巴细胞具体检测结果差异有统计学意义（P<0.05）。结论 CD4⁺T淋巴细胞基线值低患者,经高效抗病毒治疗后免疫重建效果较差,因此艾滋病患者进行高效抗病毒治疗应尽早进行。     

脂多糖通过调节浸润性淋巴细胞抑制小鼠肺腺癌的进展

目的:观察脂多糖(LPS)对小鼠肺腺癌进展的影响,并探讨相关免疫学机制。方法:小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞分为3组,分别给予PBS或LPS(10、20 mg/L)处理0、24、48 h,采用CCK-8法检测细胞增殖,采用Annexin-V/PI双染法检测处理48 h后细胞凋亡率。取10只6～8周龄C57BL/6J雌性小鼠,皮下注射LLC细胞构建移植瘤小鼠模型,成瘤后将小鼠均分为两组,每组5只;分别腹腔注射PBS(对照组)或LPS(LPS组),每3 d注射1次,共注射4次。小鼠第1次腹腔注射PBS或LPS 6 h后,尾静脉取血,采用ELISA法检测小鼠血清白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。末次注射后第3天处死小鼠,测量肿瘤体积及质量。采用荧光抗体标记法检测小鼠肿瘤组织中CD45⁺淋巴细胞、CD3⁺T淋巴细胞、CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞比例及CD8⁺T淋巴细胞表面细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)、T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(TI...     

日本血吸虫感染小鼠外周血CD4+T细胞亚群动态变化的研究

目的 了解日本血吸虫感染小鼠外周血CD4⁺T细胞亚群水平的动态变化情况,探讨感染进程中CD4⁺T细胞亚群的免疫调控作用。方法 通过日本血吸虫尾蚴腹贴法建立日本血吸虫感染小鼠模型,将18只6周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分成正常对照组和日本血吸虫感染组,每组9只。 通过流式细胞染色计数的方法检测感染3周、5周及8周后小鼠外周血CD4⁺T细胞亚群中Th1、Th2、Th17、Treg细胞变化情况。结果 随着日本血吸虫感染进程,与正常对照小鼠相比,感染小鼠外周血CD4⁺T细胞亚群中Th1、Th2、Th17、Treg细胞比例均显著增加。不同细胞亚群比例增加的趋势不尽相同,其中Th1细胞在感染第3周占比较高但其增长较为缓慢,而感染前3周Th2、Treg细胞占比较低但其增加幅度较大,在第8周达到峰值;Th17细胞比例在感染前3周基本无变化,随后显著增加。结论 日本血吸虫感染引起宿主CD4⁺T细胞亚群比例发生变化,本研究发现感染显著增加小鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞比例,感染后3周内小鼠外周血CD4⁺T细胞亚群以Th1细胞为主,5周后Th2、Th17、Treg细胞逐渐占主导地位。本结果为研究日本血吸虫病免疫病理机制和特征提供基础。     

HIV/AIDS 患者骨髓抑制与CD4+T细胞计数及HIV病毒载量相关性分析

目的 了解HIV/AIDS患者骨髓抑制与CD4⁺T细胞计数及病毒载量的关系。方法 入组53例北京佑安医院2015年1月—2017年12月收治住院的HIV/AIDS患者,观察外周血象特征、骨髓造血情况、CD4⁺T淋巴细胞计数及HIV病毒载量情况,比较不同骨髓抑制程度与CD4⁺T细胞计数、病毒载量的差异。结果 按CD4⁺T细胞计数,将53例患者分为CD4⁺T细胞>200个/μL组和CD4⁺T细胞≤200个/μL组,CD4⁺T细胞>200个/μL组16例,CD4⁺T细胞≤200个/μL组37例。CD4⁺T细胞≤200个/μL组患者外周血中红细胞计数、白细胞计数、淋巴细胞计数均明显低于CD4⁺T细胞>200个/μL组,差异有统计学意义（P<0.05）。CD4⁺T细胞≤200个/μL组中,三系减少8例,两系减少12例,一系减少9例;但在CD4⁺T细胞>200个/μL组,三系减少1例,两系减少2例,一系减少5例,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。按骨髓分级分0、I~Ⅱ、Ⅲ~Ⅳ级三组,HIV病毒载量中位数分别为1.60 、4.08、4.67 Log（copies/mL）,三组比较差异有统计学意义（P<0.05）。三组的CD4⁺T细胞分别为156、131、28个/μL,三组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论 HIV/AIDS 患者病毒载量越高,骨髓抑制现象越明显,导致血细胞减少为主的外周血血象异常。     

多种受体酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼减轻流行性乙型脑炎病毒感染的研究

目的 评价多种受体酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼（sunitinib）在体内和体外治疗流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）感染的效果。方法 4周龄BALB/c小鼠腹腔注射JEV。感染小鼠以两种给药策略进行治疗,分别为连续5 d和连续10 d给与舒尼替尼治疗,后观测其体重变化和生存率;通过qRT-PCR技术检测小鼠脑内病毒RNA载量的变化;利用免疫组织化学染色技术检测小鼠脑内CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞的数量及分布;利用免疫荧光染色技术观察药物治疗前后小鼠脑内JEV病毒E蛋白的表达。此外,通过JEV体外感染Vero细胞并给与一定浓度舒尼替尼进行干预,观察细胞存活状态;采用间接免疫荧光染色观察治疗前后细胞内JEV病毒E蛋白的表达。 结果 小鼠感染JEV后连续给与舒尼替尼可显著提高其生存率,并且连续给药5 d的生存率和体重变化结果优于连续给药10 d。舒尼替尼治疗后减少了脑内CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞浸润,小鼠脑内血管套袖样改变减轻;但治疗前后小鼠脑内的JEV病毒载量和脑内E蛋白的表达变化不太明显;感染JEV的Vero细胞在给与舒尼替尼后细胞病变效应稍有减轻,E蛋白表达少量变化。结论 舒尼替尼治疗能够显著降低JEV感染小鼠死亡率,并且连续给与舒尼替尼5 d的治疗效果更好,JEV感染小鼠接受舒尼替尼治疗后可减少脑内CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞浸润,改善脑内血管袖套样炎性炎症状,延长小鼠生命。     

肺癌模型小鼠肿瘤和主要免疫器官组织中调节性T细胞和NK细胞的数量变化及其意义

目的：探讨肺癌小鼠CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）和自然杀伤细胞（NK）在外周免疫器官和肿瘤组织中数量的变化,阐明其对肿瘤发展的影响。方法：C57BL/6小鼠分为Lewis肺癌细胞系（LLC）注射组和正常对照组,LLC注射组小鼠采用LLC腋窝注射制备皮下肿瘤模型,正常对照组小鼠采用生理盐水等量注射。采用细胞表面和细胞内特异荧光抗体染色和流式细胞术检测肺癌小鼠脾脏、淋巴结和肿瘤组织中CD4⁺CD25⁺T细胞、Treg细胞及脾脏组织中NK细胞数量。结果：与正常对照组比较,LLC注射组小鼠脾脏和淋巴结中CD4⁺CD25⁺ T细胞占CD4⁺T细胞比例及Foxp3⁺在CD4⁺CD25⁺T细胞中的表达比例明显升高（P < 0.05）,CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg细胞数量也明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。LLC接种组小鼠肿瘤组织中CD4⁺CD25⁺ T细胞占CD4⁺T细胞比例及Foxp3⁺在CD4⁺CD25⁺T细胞中的表达比例明显高于脾脏和淋巴结（P < 0.05）。与正常对照组比较,LLC注射组小鼠脾脏组织中NK细胞比例明显降低（P < 0.05）。结论：肺癌小鼠主要免疫脏器官组织中Treg细胞比例和数量升高,NK细胞比例降低,其可促进肿瘤发展,抑制机体对肿瘤细胞的免疫应答。     

融合基因EBNA1-LMP1重组腺病毒的构建及其免疫学研究

目的 构建EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)EBNA1和LMP1融合基因的重组腺病毒,探究重组腺病毒的免疫学作用.方法 以质粒pCXWB-EBNA1和pMV261-LMP1为模板,通过PCR扩增EBNA1和LMP1基因,并通过linker以重叠延伸PCR的方式构建融合基因EBNA1-LMP1,将其...     

血管内皮抑素协同肿瘤特异性DC-T细胞的抗肿瘤效应

目的 探讨血管内皮抑素联合肿瘤特异性DC-T细胞对Lewis肺癌小鼠的抗肿瘤效应。方法 建立Lewis肺癌C57BL/6鼠移植瘤模型, 培养小鼠来源肿瘤特异性DC-T细胞, 随机分为A组(PBS对照组)、B组(DC-T组)及C组(DC-T+血管内皮抑素组)。测量小鼠的体质量及肿瘤组织质量和体积, Western blotting检测各组肿瘤组织内血管内皮生长因子(VEGF)和乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白的表达, 流式细胞术检测肿瘤组织细胞悬液内髓源抑制性细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM, M1/M2)、成熟的树突状细胞(mDC)和CD8⁺T细胞的比例。结果 与A组比较,B组(P<0.05)、C组(P<0.01)肿瘤生长明显受到抑制;相较于A组, B组VEGF表达下降, 且HIF-1α表达增加(P<0.05), C组VEGF表达明显下降, 且HIF-1α表达明显增加(P<0.01);与A组比较, B组(P<0.05)、C组(P<0.01)的MDSC和M2型TAM比例下降, M1型TAM升高, 肿瘤组织内mDC和CD8⁺T细胞比例增加。结论 血管内皮抑素联合肿瘤特异性DC-T细胞治疗明显减缓肿瘤生长, 有效逆转了肿瘤微环境的免疫抑制, 从而发挥了协同抗肿瘤效应。     

重组hIFN-α-2b-BCG抗肿瘤效应的体外研究

目的:了解重组hIFN-α-2b-BCG (rBCG) 体外抗肿瘤的作用效果和作用机制。方法:体外共培养后,透射电镜观察不同时间点rBCG对人膀胱肿瘤EJ细胞的影响。吖啶橙染色观察各组肿瘤细胞形态。MTT法检测rBCG对肿瘤细胞生长抑制率。ELISA检测rBCG作用后淋巴细胞分泌Th1型细胞因子水平。LDH释放试验检测rBCG激活的淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤效应。结果:BCG和rBCG作用后的肿瘤细胞在透射电镜下和吖啶橙染色后均有显著变化。MTT显示rBCG的生长抑制率显著高于BCG和BCG+IFN组。rBCG对淋巴细胞分泌Th1型细胞因子有影响,同时rBCG激活的淋巴细胞对膀胱肿瘤细胞的杀伤作用。结论:重组BCG在体外有优于BCG的免疫调节特性、抗肿瘤作用和直接细胞毒作用。     

三七总皂苷对再生障碍性贫血小鼠T淋巴细胞亚群的影响及其促造血作用

目的：探讨三七总皂苷（PNS）对再生障碍性贫血模型小鼠T淋巴细胞亚群和造血功能的影响,阐明PNS对再生障碍性贫血小鼠的治疗机制。方法：50只小鼠随机分为对照组、模型组、低剂量PNS组、中剂量PNS组和高剂量PNS组,低、中和高剂量PNS组小鼠分别腹腔注射100、200和400 mg·kg^-1PNS,对照组和模型组小鼠给予等体积生理盐水,连续给药14 d。测量小鼠体质量并计算脾脏及胸腺指数,采用流式细胞术检测小鼠外周血CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞百分率并计算CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞的比值,ELISA法测定小鼠血清γ干扰素（INF-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平,采用血细胞分析仪检测小鼠红细胞（RBC）、骨髓单个核细胞（BMCs）、白细胞（WBC）、血小板（Plt）数量及血红蛋白（Hb）水平。结果：与对照组比较,模型组小鼠体质量、脾脏指数和胸腺指数、外周血CD4⁺T淋巴细胞百分率及CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞比值明显降低（P<0.05）,外周血RBC、BMCs、WBC、Plt数量和Hb水平明显降低（P<0.05）,外周血CD8⁺T淋巴细胞百分率和血清中INF-γ、TNF-α水平明显升高（P<0.05）。与模型组比较,低、中和高剂量PNS组小鼠体质量、脾脏指数和胸腺指数、CD4⁺T淋巴细胞百分率和CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞比值明显升高（P<0.05）,外周血RBC、BMCs、WBC、Plt数量和Hb水平明显升高（P<0.05）,CD8⁺T淋巴细胞百分率和血清中INF-γ、TNF-α水平明显降低（P<0.05）。结论：PNS呈剂量依赖性调节T淋巴细胞亚群的平衡,抑制INF-γ和TNF-α释放,提高造血相关因子水平,从而改善再生障碍性贫血小鼠的造血功能。     

脂肪干细胞局部注射改善淋巴水肿的实验研究

目的 研究脂肪干细胞 (adipose derived stem cells, ADSCs)体内减轻炎性反应治疗淋巴水肿的可行性及作用机制,为淋巴水肿疾病的干细胞治疗探索新的思路。方法 提取小鼠皮下脂肪干细胞,体外培养、扩张至3~5代。建立淋巴水肿鼠尾模型,手术阻断鼠尾深、浅淋巴回流,造模当天,于皮下注射ADSCs或磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS),ADSCs组共20只小鼠,PBS对照组共30只小鼠。术后3周,分别用HE染色、Whole mount-BODIPY染色、Masson染色、免疫荧光染色检测鼠尾皮下组织/脂肪厚度、纤维化程度、淋巴管形态,干预后8周,FITC-Dextran检测淋巴回流。结果 ADSCs组淋巴水肿缓解,鼠尾体积在术后4周内较对照组减小;皮下脂肪厚度降低约40%;皮下组织的纤维化缓解,Masson染色结果显示胶原纤维所占面积比例下降约20%;高倍镜视野下的淋巴管数量未发生变化,但是横截面积减小约60%;FITC-Dextran检测淋巴回流发现,ADSCs组荧光染料通过手术切口明显多于PBS对照组。结论 ADSCs局部注射后,可缓解淋巴水肿。     

云南省玉溪市未抗病毒治疗HIV/AIDS患者T淋巴细胞计数自然变化

目的 探讨玉溪市未抗病毒治疗HIV感染者/艾滋病患者（HIV/AIDS）T淋巴细胞计数（CD3、CD4和CD8）自然变化,了解其艾滋病自然病程。方法 收集2006—2014年间玉溪市新报告HIV/AIDS未抗病毒治疗资料,获取首次与末次CD3、CD4和CD8数据,描述并比较CD3、CD4和CD8自然变化速率。结果 CD3、CD4和CD8月均自然变化速率分别为4.14个/μL、-2.13个/μL和7.57个/μL。其中886例（62.66%）CD4末次较首次低,表现为自然下降。首次CD4越高,其月均下降越快,而首次CD4较低,其月均下降较慢甚至出现上升,差异有统计学意义（P<0.05）。男性、汉族、≥50岁者、传播途径为注射吸毒者月均CD4自然变化下降速率较快,而女性、少数民族、50岁以下者、传播途径为性传播者CD3、CD8上升速率较快,差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论 玉溪市HIV/AIDS CD3、CD4和CD8自然变化总体平缓,但仍然有部分HIV/AIDS的CD4下降较快,或是CD3 、CD8上升较快,需对该类人群加强随访,及时介入抗病毒治疗。