基于ITS2序列的中药材桔梗种子DNA条形码鉴定

目的：桔梗为中国常用大宗药食兼用中药材,种植面积广,建立基于DNA 条形码技术的桔梗种子鉴定方法具有重要意义。方法：本研究共收集29份中药材桔梗基原植物和种子样品;利用体式显微镜、X射线影像工作站观察种子的形态特征及种子成熟度;优化DNA提取方法;基于中药材DNA条形码鉴定系统（http://www.tcmbarcode.cn）和《中国药典中药材DNA条形码标准序列》对种子物种进行鉴定。结果：不同群体来源或同一群体来源桔梗种子形态特征存在较大差异,识别困难;本实验可以实现单粒桔梗种子（约1mg）的DNA提取、PCR扩增和序列测定;5份样品同一群体内种子ITS2序列存在差异;中药材DNA条形码鉴定系统和《中国药典中药材DNA条形码标准序列》可以作为种子物种鉴定的依据。结论：DNA条形码分子鉴定法可以对中药材桔梗种子进行鉴定,同时为中药材种质资源鉴定提供了新方法,对中药材种子质量标准的建立提供依据。     

应用ITS2条形码及种子形态鉴定柴胡属种子

目的:采用传统形态鉴定方法结合DNA条形码分子检测技术准确鉴定柴胡属种子。方法:收集41份市售柴胡属种子和GenBank数据库中下载15个品种75条核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列。利用体视显微镜和游标卡尺进行种子外观形态特征的观察和记录,测定千粒重。提取种子的基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增,双向测序得ITS2序列。基于BLAST法,邻接(NJ)系统进化树法,Kimura双参数模型(K2P)遗传距离法和ITS2序列二级结构进行物种鉴定。结果:不同基原的柴胡属种子在长、宽、横切面及千粒重等方面存在细微的差别;柴胡种子的ITS2序列有2个种内变异位点,3种单倍型,种内最大遗传距离0.009小于种间最小遗传距离0.032;NJ系统进化树中柴胡和狭叶柴胡分别聚为独立一支,具有良好的单系性;ITS2序列二级结构可以弥补NJ树在变种鉴定方面的不足。41份柴胡属种子样品中有30份柴胡,3份狭叶柴胡,5份三岛柴胡,2份藏柴胡及1份小叶黑柴胡。结论:市售柴胡种子存在来源多样、基原混乱的问题。基于ITS2条形码和种子形态鉴定相结合的方法可以准确鉴定柴胡属种子,为制定柴胡种子质量标准,规范柴胡种植,从源头解决柴胡药材质量问题提供科学依据,并为其他药用植物种子或者种子类药材的准确鉴定提供参考。     

中药材北沙参种子DNA条形码鉴定研究

目的：本研究旨在建立鉴定北沙参种子的新方法,确保药材生产种植中种质基原准确。方法：对北沙参不同产地种子经初步形态特征鉴定后,取单粒种子为一份样品,提取基因组DNA、PCR扩增、双向测序拼接获得ITS2序列,结合序列比对、变异位点分析,基于中药材DNA条形码鉴定系统（http://www.tcmbarcode.cn）,系统地完成种子样品的分子鉴定。结果：研究表明66份种子样品中,64份与《中国药典中药材DNA条形码标准序列》中北沙参序列特征一致,2份样品序列中各有一处SNP位点,为北沙参暂未发现过的遗传多样性信息,鉴定结果显示为北沙参。结论：DNA条形码技术能准确鉴定北沙参种子,并为中药材种子鉴定提供新方法,同时SNP位点的发现为后续研究北沙参品种多样性问题提供参考。     

基于中药材DNA条形码系统的泽泻种子鉴别研究

目的：以泽泻种子为研究对象,利用中药材DNA条形码鉴定系统区分不同产地泽泻的基原物种。方法：采用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA,扩增核内部转录间隔区ITS2序列并进行测序。利用软件CodonCode Aligner 6.0.2和MEGA 5.1对序列进行拼接,并用体式显微镜观察记录种子外观形态特征。结果：泽泻Alisma plantago-aquatica和东方泽泻Alisma orientale种子外观形态相似;两个物种的ITS2序列长度均为311 bp,GC含量为56.9%,ITS2序列在165 bp处存在T-A变异。该鉴定结果显示,20份四川产泽泻种子样本序列为泽泻A. plantago-aquatica,其他产区36份样本均为东方泽泻A. orientale。结论：中药材DNA条形码鉴定系统可为选择正确基原的泽泻种质提供指导,该系统在泽泻人工栽培生产中具有重要应用价值,可为其他中药材种子鉴定提供示范。     

濒危兰科药用植物DNA条形码鉴定

兰科药用植物形态分类困难,此研究采用DNA条形码分子鉴定法从分子水平验证兰科药用植物的传统形态分类。以matK,psbA-trnH和ITS2序列作为DNA条形码对已进行了形态鉴定的49属135种163份兰科药用植物样品进行分子鉴定,经DNA提取,PCR扩增、双向测序及校对拼接后,将得到的序列在GenBank中进行BLAST比对,然后运用MEGA 7.0软件中的Neighbor-joining(NJ)法构建物种系统进化树。结果表明,163份样品均能成功提取DNA;matK,psbA-trnH和ITS2序列的PCR扩增效率分别为100%,100%,98.77%;共获得487条序列,其中345条序列在GenBank数据库中比对到了相应物种的序列,142条为新增序列;运用NJ法构建的兰科药用植物系统进化树中,基于matK序列所构建的物种系统进化树要优于基于psbA-trnH和ITS2序列所构建的系统进化树。matK,psbA-trnH和ITS2序列在鉴定兰科药用植物过程中互为补充,DNA条形码分子鉴定法可用于辅助兰科药用植物的分类鉴定。     

基于DNA条形码技术的知母种子基原鉴定

目的:建立基于中药材DNA条形码技术的知母种子基原鉴定方法,保障知母种子基原的真实性。方法:收集知母的30份基原植物样品和9份生药材样品,获取其参考DNA条形码序列,采用克隆测序方法验证参考序列的准确性。收集51份待检测知母种子样品,获取其DNA条形码序列,基于BLAST法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定。结果:对于基原植物和生药材样品,由于基因组内存在异质性,核糖体DNA第2内部转录间隔区(ITS2)序列无法稳定获得,但可成功获得psbA-trnH序列。知母psbA-trnH序列分为6个单倍型,有3个变异位点,2处插入/缺失,种内变异最大值0.003 5,种间变异最小值0.1,在NJ系统发育树上聚为独立的支。共获得153条知母种子的psbA-trnH序列,经BLAST法、遗传距离法和NJ系统发育树法鉴定均为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides。结论:psbA-trnH是知母种子鉴定的适合条形码序列,可用于知母种子的真实性鉴定。所收集51份知母种子样品的基原均符合2015年版《中国药典》(一部)相关项下规定,未发现伪品。     

黄芩ITS2条形码数据库构建及其种子的DNA条形码鉴定方法建立

目的:通过构建黄芩核糖体DNA内转录间隔区2(ITS2)条形码数据库,建立黄芩种子DNA条形码鉴定新方法,保障黄芩种子基原准确。方法:收集黄芩对照药材、基原植物、生药材、公共数据库及其常见代用品的ITS2序列,构建黄芩DNA条形码数据库;收集62份市售黄芩种子样品,每份种子获取3~4条ITS2序列,基于BLAST方法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定。结果:共获得101条黄芩及其代用品的ITS2序列。黄芩的种内序列变异小于种间序列变异,黄芩、甘肃黄芩和粘毛黄芩在NJ系统发育树上分别聚为独立的支,可相互区分。共获得195条黄芩种子的ITS2序列,DNA条形码鉴定结果表明193条为黄芩序列,2条为真菌序列。结论:黄芩ITS2条形码数据库稳定可靠,可满足黄芩种子DNA条形码鉴定的需求。DNA条形码技术可用于黄芩种子的物种鉴定。     

基于ITS2序列的羌活及其混伪品的DNA条形码鉴定

目的对羌活及其混伪品进行分子鉴定,以确保该药材的质量以及临床疗效。方法利用PCR测序法,对样品进行核基因ITS2片段扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建邻接(NJ)树。利用已建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构。结果羌活与宽叶羌活ITS2序列长度均为228 bp,二者种内平均K2P(Kimura-2-parameter)遗传距离均远远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离;由所构建的系统聚类树图可以看出,羌活与宽叶羌活均表现出了单系性,而同时又与其他混伪品明显分开;比较ITS2二级结构发现,羌活基原植物与其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别羌活及其混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。     

基于ITS2序列的中药材苍术种苗DNA条形码鉴定

目的:建立基于DNA条形码技术的中药材苍术种苗鉴定方法。方法:收集中药材苍术及其易混品原植物样品28份,构建苍术种苗鉴定参考核糖体内部转录间隔区2(ITS2)条形码数据库。从河北、山东、山西、内蒙古、辽宁及湖北等苍术主产地收集苍术种苗52份。通过提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增,双向测序获得其ITS2条形码序列。应用PUAP 4.0软件计算种内、种间遗传距离,利用MEGA 7.0软件构建邻接树,对中药材苍术种苗进行DNA条形码鉴定。结果:中药材苍术及其易混品原植物ITS2条形码序列具有稳定的序列差异,邻接树呈现单系性,可以明显区分苍术及其易混品;基于标准参考数据库,42份苍术种苗为朝鲜苍术(80.8%),7份苍术种苗为苍术(13.5%),3份苍术种苗为白术(5.7%)。结论:基于ITS2序列可以准确区分中药材苍术及其混伪品种苗。苍术种苗基原物种鉴定结果以朝鲜苍术为主,提示苍术临床用药存在潜在安全风险。     

基于ITS2条形码的中药材天南星及其混伪品DNA分子鉴定

该研究收集天南星及其混伪品7种,共58份样品,通过DNA提取和PCR扩增,经注释后获得其ITS2条形码,然后进行序列变异分析和NJ树聚类分析。结果表明天南星3种基原天南星、异叶天南星和东北天南星的种内K2P距离均小于其种间K2P距离,在NJ聚类树上天南星3种基原分别聚为独立的支。天南星3种基原与天南星混伪品聚为不同的支。因此,ITS2作为DNA条形码可以鉴定天南星3种基原及其混伪品,DNA条形码技术可为天南星及其混伪品的鉴定提供新的方法。     

羌活属植物在不同海拔引种的生态适宜性研究

采用人工引种栽培方式研究不同海拔梯度下羌活与宽叶羌活的生长状况、地下生物量和有效成分含量的变化规律,筛选羌活属植物的最佳种植区域。结果表明:(1)从栽培植株成活率和生物量等指标来看,羌活的生态适应范围是2 600~4 100 m;宽叶羌活生态适应海拔高度是1 700~3 600 m。(2)从药用部位有效成分含量与总量来看,羌活有效成分含量与总量较高的海拔范围是2 600~3 600 m,而宽叶羌活有效成分含量与总量较高的海拔则是1 700~3 600 m。综上所述,羌活生态和品质亚最适宜范围为2 600~3 600 m;宽叶羌活对应区域较宽,为1 700~3 600 m。该结果将为羌活属植株的野生驯化与人工栽培提供科学依据。     

基于ITS2序列的人参及同属易混品西洋参种子的分子鉴定

目的基于DNA条形码技术建立人参与西洋参种子的分子鉴别方法。方法采用生药鉴定方法研究其性状、显微特征,并结合DNA条形码技术,基于中药材DNA条形码数据库,通过ITS2序列比对、遗传距离比较和构建临接(NJ)系统发育树,对人参与西洋参的种子进行鉴别研究。结果人参与西洋参种子的种内遗传距离分别小于种间遗传距离,系统发育树图中各物种均聚为一支,来自9个产地的42份人参及西洋参的种子均为正品,且容易区分。结论基于ITS2序列DNA条形码技术可以快速、准确、有效地鉴别人参与西洋参种质资源。     

市售中药材冬葵子和苘麻子ITS2条形码鉴定

目的利用ITS2条形码序列对市售中药材冬葵子、苘麻子进行分子鉴定,以保证药材使用的正确性和临床药效。方法收集冬葵子、苘麻子及其3种混伪品样品共87份。对实验样品进行ITS2基因片段扩增并双向测序,利用HMMer注释方法获得ITS2序列,再经Codon Code Aligner 6.0.2拼接,使用MEGA6.0进行种内、种间变异分析,遗传距离计算并构建NJ系统发育树;将所得序列转换成二维码图片,扫描识读后通过中药材DNA条形码数据库进行验证。结果冬葵子和苘麻子外观形态相似;冬葵子ITS2序列长度232 bp;GC量为67.6%;苘麻子ITS2序列长度231 bp,GC量为54.1%,二者均无种内变异。冬葵子和苘麻子ITS2序列比对后长度为233 bp,共存在50个变异位点。鉴定结果显示,收集的56份冬葵子药材中26份均为苘麻子,剩余30份为正品。冬葵子和苘麻子与其他3个混伪品的K2P遗传距离为0.224~0.868,平均距离为0.630,种间遗传距离远大于种内遗传距离。基于ITS2序列构建系统发育树可见冬葵子、苘麻子及其3个混伪品各自单独聚成一支,ITS2序列能够明显将其区分;此外,使用二维DNA条形码扫描可准确验证5个物种。结论 ITS2序列能够成功鉴定冬葵子、苘麻子及其常见混伪品,为种子类药材鉴别提供了新工具;二维码技术与DNA条形码技术的结合可以为药材的基原物种提供准确唯一的二维DNA条形码信息,可更好实现药材市场的信息化监管。     

应用种子形态及DNA条形码技术鉴定黄芪及混伪品种子

目的 采用传统形态鉴定方法结合DNA条形码分子检测技术对黄芪及混伪品种子进行鉴定。方法 收集黄芪及混伪品种子、市售黄芪种子样品共58份,利用体视显微镜和游标卡尺进行种子外观形态特征的观察和记录,测定千粒重;提取单粒种子的基因组DNA,PCR扩增、双向测序获得ITS2及psbA-trnH序列。使用邻接法（neighbor joining,NJ）构建系统发育树,kimura二参数（kimura two-parameter,K2P）模型计算遗传距离,进行物种鉴定分析。结果 黄芪及混伪品种子在颜色、形状、长、宽、厚度及千粒重等方面存在细微差别;ITS2的测序成功率为100%,黄芪种间最小遗传距离均大于种内最大遗传距离;ITS2序列构建的NJ系统进化树将蒙古黄芪A.mongholicus var. mongholicus聚为独立一支,并将蒙古黄芪Astragalus membranaceus、紫花苜蓿Medicago sativa、锦鸡儿Caragana sinica、蜀葵Althaea rosea及黄芪属其他物种分开,可进行黄芪及其混伪品种子的鉴定。基于外观形态和ITS2条形码序列鉴定发现12份市售黄芪种子中有1份为斜茎黄芪。结论 基于种子形态鉴定和ITS2条形码相结合的方法可以准确鉴定黄芪及混伪品种子,为规范黄芪种源及种植生产,进而保障黄芪药材质量提供科学依据。     

地龙及其混淆品原动物的形态及DNA双重条形码鉴定

目的基于线粒体cytochrome coxidase I(CO I)和16 S rRNA基因开发DNA双重条形码鉴定方法,由此验证并补充形态鉴定,以期建立一种准确、有效地鉴定地龙及混淆品原动物的方法。方法对收集到的66份样品依据形态特征进行初步鉴定,使用优化后的引物同时扩增CO I和16 S rRNA序列。优化一步法双重PCR实验条件。用MEGA 5.1计算地龙及其混淆品的种内、种间遗传距离,基于K2P模型构建NJ树。结果 CO I和16 S rRNA双重DNA条形码鉴定与形态鉴定结合,可准确鉴别地龙及混淆品原动物。结论形态鉴定是分子鉴定的基础,分子鉴定是形态鉴定的有力补充。二者结合可最大程度地实现地龙及其混淆品原动物的准确鉴定。DNA双重条形码鉴定方法也可为地龙药材鉴定以及其他动物药材的分子鉴定提供参考。     

川芎种质鉴定标记开发和系统发育研究

目的基于藁本属Ligusticum叶绿体基因组高频插入缺失区域开发InDel标记,同时结合通用条形码对道地川芎及其常用混伪品进行种质鉴定和系统发育研究。方法通过8个DNA通用条形码ycf1、matK、ITS2、rpoC1、rbcL、rpoB、trnK、psbA-trnH序列片段对采集的26个川芎样品及其常用混伪品进行了扩增和测序,采用了遗传距离统计法、barcoding gap分析法和构建系统发育树法进行亲缘关系和系统发育研究。同时利用InDel分子标记,采用构建进化树法对道地川芎及其混伪品物种进行分子鉴定。结果 rbcL片段保守位点最多(97.32%),且GC含量最高(44.9%)。rbcL+rpoB片段具有最小的平均种内遗传距离(0.002 5),psbA-trnH片段具有最大的平均种间遗传距离(0.429 2)。trnK片段和rbcL+rpoB片段具有最高的种间变异,psbA-trnH片段的"barcodinggap"区重叠度最小。采用的8对DNA通用条形码无法准确地鉴定道地川芎药材与其他混伪品物种。InDel分子标记的聚类分析中,24对InDel引物中的4对引物组合能准确地鉴定出道地川芎,并将道地川芎及其混伪品物种聚类为4个分支,其中一个分支为采集的道地川产川芎药材。结论 InDel标记对道地川芎及其常用混伪品的鉴定能力高于通用条形码。对于传统的通用DNA条形码,由于遗传成分差异大,无法区分川芎及其常用混伪品。新开发出的InDel分子标记可以有效地鉴定道地川芎及其常用混伪品,从分子水平上为川芎道地性研究提供有效手段。     

羌活药材的化学成分和药理活性研究进展

羌活为伞形科植物羌活Notopterygium incisum或宽叶羌活Notopterygium franchetii干燥后的根茎和根,从其中分离得到的主要化学成分包括挥发油及萜类、香豆素类、糖及糖苷类、酚酸类、聚烯炔、生物碱类等。药理研究表明,羌活具有抗炎抗菌、抗氧化、抗病毒、抗癌细胞增殖、解热镇痛等活性,且对心脑血管系统、消化系统、呼吸系统和中枢神经系统有显著影响。主要介绍中药羌活的化学成分及药理活性研究进展,并对其研究方向进行展望,为进一步研究其药效物质基础、作用机制及合理开发利用提供理论依据。     

石斛资源分子水平研究进展

石斛作为我国传统中药材,具有养阴生津、润肺明目、抗癌防老等显著功效,有着广泛的分布和悠久的应用历史。随着分子生物学技术的发展,石斛属药用资源的研究进展迅速,分子标记技术具有微量、快速、特异性强、准确可靠等特点,为石斛资源的研究提供了新的方法。通过选用RAPD,ISSR,AFLP,SRAP等不同分子标记的结合使用,对石斛不同种类之间的遗传多样性及亲缘关系进行分析,获得的遗传信息,可以为濒危的石斛资源的保护及开发利用提供理论依据。核基因、线粒体基因、叶绿体基因的结合应用,可以有效便捷地鉴定石斛正品,为进一步发展中药材特异性分子鉴定提供科学依据。同时不同基因片段序列的联合运用,可以作为石斛鉴别DNA条形码的分子标记,将为石斛类药材的鉴定提供新的思路和方法,有效提高石斛属植物的鉴定速度和效率。该文从分子鉴定,DNA序列,石斛功能基因等方面进行论述,为石斛属药用植物的进一步开发应用提供理论基础,同时也为石斛属植物的有效保护和可持续开发提供科学依据。