补肾中药骨灵片对人成骨细胞功能和p38活化原蛋白激酶通路的影响

目的探讨含补肾中药骨灵片大鼠血清对人成骨细胞功能和对p38活化原蛋白激酶通路的影响。方法取人髂骨松质骨，采用改良胰酶一胶原酶消化法分离培养人成骨细胞；根据血清药理学的方法制备不同浓度（低、中、高剂量）的骨灵片血清，并以生理盐水处理的大鼠血清为阴性对照，将制备好的血清加入第二代的人成骨细胞培养液中培养。采用Western—blot及Real timeRT—PCR的方法观察各组成骨细胞护骨素和护骨素配体基因表达和磷酸化p38含量，用MTT法测定各组成骨细胞增殖率。利用茜素红染色法测定矿化结节形成的数量。结果含骨灵片（低、中、高剂量）药液血清处理的大鼠血清均能上调成骨细胞护骨素基因表达。下调护骨素配体基因表达，刺激成骨细胞的增殖，增加矿化结节形成的数量，刺激p38磷酸化。结论补肾中药骨灵片可能通过p38活化原蛋白激酶通路调控护骨素以及护骨素配体的表达，促进成骨细胞增殖以及矿化结节形成，抑制骨破坏。维持骨平衡。     

骨灵片对骨质疏松大鼠骨形态计量学的影响研究

目的观察补肾中药骨灵片对去卵巢大鼠腰椎的骨形态计量学及生物力学影响,进一步探讨骨灵片治疗骨质疏松症的机理。方法选择3月龄SD大鼠36只,分为空白对照组(即假手术组,A组)、去卵巢组(B组)、骨灵片低(C组)、中(D组)、高剂量组(E组)、雌激素组(F组),每组各6只。分别给予生理盐水、骨灵片高、中、低剂量、雌激素灌饲3个月。取第3腰椎包埋切片,检测骨形态计量学参数的改变。结果与去卵巢组,骨灵片各剂量组尤其是中、高剂量组在骨小梁面积百分数、厚度、数量上显著升高,骨小梁分离度、骨形成率、骨矿化沉积率、每毫米破骨细胞数显著下降。结论补肾中药骨灵片具有促进骨形成和抑制骨吸收的作用,使骨结构得到改善。     

陇中损伤散提取物对成骨细胞增殖影响的血清药理学方法的建立及验证

目的:建立并验证陇中损伤散提取物(extract of Longzhong sunshang powder,LSE)对成骨细胞增殖影响的血清药理学研究方法。方法:用LSE末次给药后颈总动脉采血制备含药血清,按照LSE不同给药剂量、给药时间、采血时间分组,分别用含不同浓度LSE的血清培养胎鼠成骨细胞(osteoblast,OB)。采用MTT法检测细胞增殖能力,倒置相差显微镜观察OB形态,Von kossa染色法观察OB的矿化结节,以碱性磷酸酶活性、矿化结节数、基质钙含量、Ⅰ型胶原免疫组化等指标与空白对照组进行对比分析。结果:等剂量组(给药剂量),5 d组(给药时间),1h组(采血时间)的OD值,与对照组比较有显著性差异(P<0.05);不同浓度含药血清组的OD值:10%组>15%组>5%组,组间比较有显著性差异(P<0.05);LSE可显著增加OB的碱性磷酸酶染色阳性细胞数、矿化结节数、基质钙含量(P<0.01)以及上调Ⅰ型胶原表达(P<0.05)。结论:LSE以等剂量(1 g/kg)灌胃给药5 d,末次给药1h后采血制备血清,以10%浓度与OB细胞共培养,是促进胎鼠成骨细胞增殖的优选方案。     

补肾强督方对骨髓间充质干细胞成骨过程Wnt通路中因子表达的影响

目的:研究补肾强督方含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨过程Wnt/β-catenin通路中因子表达的影响。方法:BMSCs细胞分为空白对照组、西药对照组、补肾强督方低中高剂量组,分别进行成骨诱导分化,茜素红染色法检测各组成骨程度,实时荧光定量PCR检测GSK3β、wnt5a和SOST基因mRNA表达,Western blot检测Wnt/β-catenin通路关键因子GSK3β、wnt5a和SOST蛋白表达。结果:空白组BMSCs成骨分化培养后可见明显矿化结节形成,补肾强督方干预组未见明显矿化结节。与空白对照组比较,补肾强督方含药血清组BMSCs中SOST、GSK3β蛋白表达显著升高,Wnt5a蛋白的表达显著降低(P<0.05)。与空白对照组比较,补肾强督方含药血清组BMSCs中SOST、GSK3βmRNA的表达显著升高,Wnt5a mRNA的表达显著降低(P<0.05)。结论:补肾强督方含药血清具有抑制强直性脊柱炎骨化的作用,其机制可能与抑制BMSCs成骨过程中的Wnt/β-catenin信号通路相关。     

骨灵片通过p38 MAPK信号通路影响成骨细胞功能的机制

目的 探讨骨灵片促进成骨细胞增殖、矿化以及基因表达的细胞信号通路.方法 用含有骨灵片的大鼠血清、p38MAPK抑制剂SB203580作用人成骨细胞MG-63,测定各组成骨细胞增殖率、矿化结节数量.采用Western-blotting及Real time RT-PCR方法观察各组成骨细胞护骨素(OPG)、护骨素配体(RANKL)以及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)基因表达和磷酸化p38含量.结果 经含骨灵片药液的大鼠血清作用后,MG-63细胞的增殖和矿化结节形成数明显增加,OPG基因表达增加,RANKL基因表达减少,OPG/RANKL比值显著增加,M-CSF有下降趋势,但没有显著性差异,同时刺激p38磷酸化.结论 骨灵片可能通过p38MAPK通路促进成骨细胞增殖以及矿化结节形成,调控OPG、RANKL以及M-CSF的表达,达到治疗骨质疏松症的作用.     

补肾安胎方对人绒毛膜外滋养层细胞HTR-8分泌功能及HLA-G基因表达的调控作用

目的?观察补肾安胎方对人绒毛膜外滋养层细胞HTR-8分泌功能及人类白细胞抗原G（HLA-G）基因表达的调控,探讨其免疫保胎机制。方法?雌性SD大鼠灌胃制备空白血清和补肾安胎方含药血清。将人绒毛膜外滋养层细胞HTR-8细胞分为4组:空白对照组、低剂量组（5%中药血清组）、中剂量组（10%中药血清组）、高剂量组（20%中药血清组）,培养24?h后,ELISA法测定培养上清液中雌二醇（E₂）、孕激素(P）、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及辅助性T细胞（Th）调控因子白介素-4(IL-4) 和干扰素 -γ（IFN-γ）水平,RT-PCR法测定HLA-G mRNA表达。结果?与空白对照组相比,低剂量组在促进E₂、P分泌方面无统计学意义（P>0.05）,中、高剂量组可有效提高细胞上清E₂、P含量,且高剂量组高于中剂量组（P<0.05）。3组含药血清均能明显提高滋养细胞HCG的分泌水平（P<0.05）,3组间差异无显著性意义（P>0.05）。低剂量组即可促进Th2型细胞因子IL-4分泌,但差异无统计学意义（P>0.05）,中、高剂量组可有效促进Th2型细胞因子IL-4含量,组间差异无统计学意义（P>0.05）。3组含药血清均能显著抑制Th1型细胞因子IFN-γ（P<0.05）,中、高剂量组均可增加HLA-G mRMA的表达,有显著差异（P<0.05）,且高剂量组高于中剂量组（P<0.05）。结论?补肾安胎方含药血清可以改善滋养细胞分泌功能,使母胎免疫向Th2型转化,并可能部分通过上调HLA-G基因表达实现。      

补肾中药对人成骨细胞钙离子摄取和钙化能力的影响

目的研究补肾中药对人成骨细胞增殖、分化、钙摄取和矿化能力的影响。方法用酶消化法从成人髂骨松质骨,分离人成骨细胞,以细胞形态学、碱性磷酸酶染色和体外成骨能力的检测鉴定成骨细胞。在成骨细胞培养液内分别加入含有高、中、低不同浓度的补肾中药鼠血清,以正常鼠血清作为对照。培养30min后,进行成骨细胞胞内钙离子变化的检测;培养3d后,用流式细胞仪检测成骨细胞增殖、分化情况;培养28d后,进行Von-Kossa染色,观察成骨细胞钙化结节的形成情况。结果与对照组相比,培养30min后,高、中、低3种浓度的补肾中药血清均能提高成骨细胞钙离子摄取能力;培养3d后,中药组处于增殖期的成骨细胞明显升高,和对照组相比具有明显的统计学差异。培养28d后,中药组成骨细胞钙化结节形成的数量也相对增多,其中,高浓度补肾中药血清处理组的钙化结节的数量与对照组相比有明显增加(P<0.05)。结论补肾中药血清能提高成骨细胞钙离子摄取能力,刺激成骨细胞增殖分化,增加成骨细胞钙化结节的形成。     

Smad3介导补肾中药对增龄成骨细胞VDR mRNA表达的影响

目的：探讨smad3是否介导了补肾中药对增龄成骨细胞VDR mRNA表达的影响,从而阐明补肾中药具有促进骨形成的机制。方法：分离6月龄和16月龄SD大鼠成骨细胞,采用组织块翻转方法培养,通过倒置显微镜观察细胞形态,并以矿化结节染色对成骨细胞加以鉴定。将SD大鼠随机分为正常组、生理盐水组、单味补阳组（固本壮骨粉）、复方补阳组（金匮肾气丸）、复方平补组（补肾益精方）、复方补阴组（知柏地黄丸）和西药对照组（阿法骨化醇片）,制备药物血清;当成骨细胞汇合达60％,换无血清培养液培养细胞24h后,加入含药血清（浓度为10％）再继续培养3d。采用RT-PCR方法检测含药血清干预后成骨细胞smad3和VDR mRNA的表达。结果：在增龄成骨细胞smad3 mRNA表达是下降的,这与增龄所致VDR mRNA表达下降相一致;单味补阳组、复方补阳组和西药对照组上调smad3 mRNA的趋势与它们上调VDR mRNA的趋势相一致。结论：补阳中药可能通过启动Smad3 mRNA表达而上调VDR mRNA表达,从而促进骨形成。     

喂饲补肾中药大鼠的血清对成骨细胞的生物学作用

目的 探讨喂饲补肾中药大鼠的血清对体外培养的成骨细胞的生物学作用。方法 在新生SD大鼠头颅骨第2代成骨细胞培养液中加入不同浓度(低、中、高)的中药血清，并与空白组对照，分别观察成骨细胞的增殖、分化和矿化功能。结果 补肾中药血清具有刺激成骨细胞增殖的作用，可提高碱性磷酸酶活性并增加矿化结节形成的数量。结论 补肾中药血清具有刺激体外培养的成骨细胞增殖及分化成熟的功能。     

滋肾丸抗去势雌鼠骨质疏松症的实验研究

目的探讨补肾中药滋肾丸对去卵巢骨质疏松模型大鼠股骨的密度、骨矿含量的影响及机制。方法将66只15周龄SD大鼠随机分为6组,空白组做假手术,其余5组做卵巢切除术,术后用药12周后处死,测定右侧股骨骨密度及骨矿含量,血清雌二醇、碱性磷酸酶含量,子宫湿重。结果滋肾丸大、中、小剂量组、尼尔雌醇组能对抗骨密度、骨矿含量的下降,血清碱性磷酸酶的升高,血清雌二醇的下降(与模型组相比p<0.05),滋肾丸中剂量组、尼尔雌醇组能对抗子宫指数的减轻(与模型组相比p<0.05)。结论补肾中药滋肾丸对去卵巢骨质疏松模型大鼠股骨的密度、骨矿含量有正向影响其机制与其雌激素效应,抑制过高的骨转换以及促进骨形成有关。     

益气解毒片对鼻咽癌细胞端粒酶和端粒酶RNA抑制作用的实验研究

为研究益气解毒片对鼻咽癌细胞端粒酶和端粒酶RNA的影响,先用MTT法检测其杀伤鼻咽癌细胞(HNE1)的半抑制浓度(IC50),再用10×IC50、1×IC50、0.5×IC50作用HNE1 12 h、24 h、48 h、72 h、96 h,然后检测HNE1端粒酶(Telomerase)活性和端粒酶RNA的表达.结果:10×IC50作用HNE1 24 h,端粒酶活性下降为阴性,同时端粒酶RNA的表达受到抑制;1×IC50作用后,端粒酶活性稍有下调,但端粒酶RNA表达无明显改变;0.1×IC50作用后,端粒酶活性没有明显变化,但低于白空对照组.这提示较高浓度益气解毒片在体外能抑制端粒酶的活性和端粒酶RNA表达,可能通过对鼻咽癌细胞及其端粒酶的活性抑制而发挥抑瘤效应.     

Osteopontin特异性siRNA真核表达载体的构建及其在GC9811胃癌细胞中沉默效应的鉴定

目的：构建骨桥蛋白(OPN)特异性siRNA(small interfere RNA)真核表达载体,体外观察对OPN基因的沉默作用．方法：采用基因克隆技术,将合成的特异性OPNRNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体mU6pro,构建OPN siRNA真核表达载体．以脂质体法将mU6pro空载体和2个(mU6pro／OPN—siRNA1和mU6pro／OPN—siRNA2)重组质粒分别导入具有高转移特性的GC9811胃癌细胞系．72h后用RT—PCR和Western blotting技术检测各实验组胃癌细胞内OPN mRNA及蛋白水平的表达情况．结果：成功构建OPN siRNA真核表达载体．转染OPN—siRNA的胃癌细胞,72h后OPN mRNA及蛋白表达下调,而以mU6pro／OPN-siRNA1的抑制效果更为明显．结论：构建的RNA干扰真核表达载体能明显干扰OPN mRNA及蛋白的表达,为将其进一步应用于胃癌的治疗研究奠定了基础。     

补肾活血中药介导Wnt/β-catenin信号通路延缓椎间盘终板压力退变的机制研究

背景　椎间盘退行性变是导致脊柱退行性疾病发生的根本因素,终板是椎间盘力学传导与营养传输的主要结构,终板退变会加速椎间盘退变的发生,中药复方对延缓椎间盘退变具有独特的疗效,但具体作用机制尚不完全明确。目的　观察补肾活血中药对压力下离体兔脊柱运动节段椎体终板的影响,阐明其调控终板软骨细胞、延缓椎间盘退行性变的效应特点及作用机制。方法　2019年将40只健康新西兰兔采用随机数字表法分为对照组、中药组、中药抑制剂组、中药激动剂组,每组10只。采用具有自主知识产权的脊柱运动节段离体加载和培养装置进行造模,并通过HE染色病理形态学方法、免疫组化法、荧光定量聚合酶链式反应法（RT-PCR）和Western blot检测方法检测相关指标,包括蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Wnt-3α、β-catenin mRNA和蛋白的表达水平。结果　（1）药物对椎间盘退变的影响：①HE染色显示,培养第7天时中药组软骨细胞分散程度、数目及软骨层排列均较对照组完整;培养第14天时对照组、中药组终板软骨组织退变程度均加重,对照组退变程度较中药组更加明显。②免疫组化法检测结果显示,中药组培养第1、3天时细胞外基质蛋白多糖、Ⅱ型胶原表达量均较对照组升高（P<0.05）;中药组及对照组培养第7、14天细胞外基质蛋白多糖、Ⅱ型胶原表达量均较培养前降低（P<0.05）;中药组细胞外基质蛋白多糖表达量与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）,而对照组Ⅱ型胶原表达量较中药组升高（P<0.05）。③RT-PCR检测结果显示,中药组及对照组培养第1、3、7、14天时Wnt-3α和β-catenin mRNA表达水平均较培养前降低（P<0.05）,中药组培养第1、3、7、14天时Wnt-3α、β-catenin mRNA表达水平均较对照组降低（P<0.05）。④Western blot检测结果显示,中药组及对照组培养第1、3、7、14天时Wnt-3α、β-catenin蛋白表达水平与培养前比较,差异有统计学意义（P<0.05）;中药组培养第1、3、7、14天时Wnt-3α蛋白表达水平较对照组升高（P<0.05）,但β-catenin蛋白表达水平较对照组降低（P<0.05）。（2）药物延缓椎间盘退变机制：①HE染色显示,中药激动剂组较中药抑制剂组培养第3天时终板软骨组织结构的完整性、软骨层排列较好。②免疫组化法检测结果显示,中药激动剂组、中药抑制剂组蛋白多糖、Ⅱ型胶原表达量分别与中药组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。③RT-PCR检测结果显示,中药激动剂组、中药抑制剂组第3天时Wnt-3α mRNA表达水平分别与中药组比较,差异均无统计学意义（P>0.05）;中药激动剂组β-catenin mRNA表达水平较中药组降低（P<0.05）,中药抑制剂组β-catenin mRNA表达水平较中药组升高（P<0.05）。④Western blot检测结果显示,中药激动剂组第3天时Wnt-3α和β-catenin蛋白表达水平以及中药抑制剂组Wnt-3α蛋白表达水平分别与中药组比较,差异均无统计学意义（P>0.05）;而中药抑制剂组β-catenin蛋白表达水平较中药组升高（P<0.05）。结论　补肾活血中药可以通过介导Wnt/β-catenin信号通路调控终板软骨细胞延缓椎间盘退变进程。     

抗癌药莪棱舌草Ⅰ号诱导人肝癌细胞凋亡的研究

用流式细胞光度术检测细胞凋亡 ,运用细胞化学方法检测凋亡相关基因蛋白的表达 ,以及用Westernblot ting分析研究抗癌药莪棱舌草Ⅰ号对人肝癌细胞 (772 1细胞 )凋亡的诱导作用。结果表明药物能够诱导 772 1细胞发生凋亡 ,凋亡率可达 4 0 % ;药物作用可以使细胞中凋亡抑制基因bc1 2表达减少 ,凋亡促进基因Bax表达增加。提示诱导肿瘤细胞凋亡可能是莪棱舌草Ⅰ号抑制肝癌细胞的机制之一     

益气化瘀中药对糖尿病大鼠皮肤溃疡组织中P物质表达的影响

目的：探讨益气化瘀中药对糖尿病溃疡大鼠创面组织P物质表达的影响。方法：将100只清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为正常创面组、模型组、益气组、化瘀组和益气化瘀组。制备糖尿病大鼠背部全层皮肤缺损开放性创面模型。各组分别给予生理盐水、益气中药、化瘀中药及益气化瘀中药灌胃处理,疗程为15d。用药第8及第15天,观察各组大鼠创面愈合率;用药15d后,取大鼠背部创周0.5cm以内组织,应用免疫组织化学技术检测P物质的表达水平,并计算免疫组织化学指数。结果：用药后第8及第15天,正常组创面愈合率明显高于模型组（P〈0.01）,各用药组创面愈合率明显高于模型组（P〈0.05）,且益气化瘀组明显高于各拆方组（P〈0.05）;模型组创面组织P物质的表达水平明显低于正常创面组（P〈0.05）,益气化瘀组和化瘀组P物质的表达水平明显高于模型组（P〈0.05）。结论：糖尿病创面难愈合可能与P物质的低表达有关。益气化瘀中药能明显促进糖尿病溃疡大鼠的创面愈合,上调P物质的表达水平可能是其作用机制之一。     

治疗脑卒中患者恢复期的用药规律分析

目的探讨补肾法为主治疗脑卒中恢复期的用药规律。方法应用计算机检索CNKI等医学数据库中以补肾法治疗脑卒中恢复期的临床研究报道,以EXCEL 2003软件建立数据库,收录数据进行药的频率,归经和功效的统计分析;并分析方剂中药对的应用规律。结果在62首方剂中,出现了104味中药,出现频次共为622次,在药物核心系数的统计中,黄芪、地龙、水蛭、川芎、当归、牛膝等药物的核心系数较高;在归经的统计中,归肝经、肾经、心经、脾经的药味和积分比较高;在功效的统计中,补益、活血化瘀和平肝熄风类药物的使用次数较高;在药对的统计分析中,黄芪、地龙、川芎、水蛭等药对的使用频率较高。结论利用Internet和计算机技术对中药在组方中的核心系数、归经、功效和药配对的频率进行统计,能发现补肾法为主治疗脑卒中恢复期的用药规律,这能为临床提供有力的理论指导。     

骨桥蛋白及其mRNA在肺癌组织中的表达及临床意义

目的分析骨桥蛋白（OPN）在肺癌组织中的表达,探讨其在肺癌发生发展中的作用。方法采用免疫组织化学（SP）和原位杂交技术检测骨桥蛋白和骨桥蛋白mRNA在57例肺癌组织、30例肺部炎性假瘤和20例肺大疱组织（作为正常肺组织）中的表达。结果骨桥蛋白在肺癌组织、肺部炎性假瘤中的表达率分别为57．9％（33／57）和16．7％（5／30）（X^2=13．581,P=0.000）。骨桥蛋白mRNA在肺癌组织、肺部炎性假瘤中表达分别为71．9％（41／57）和30,0％（9／30）（X^2=14．138,P=0.000）。肺大疱组织中骨桥蛋白及骨桥蛋白mRNA的表达均为阴性。骨桥蛋白和骨桥蛋白mRNA在38例有淋巴结转移的肺癌组织中分别为71．1％（27／38）和86．8％（33／38）,在19例无淋巴结转移的肺癌组织中分别为31．6％（6／19）和42．1％（6／19）,两组比较差异有统计学意义（X^2=6．558,P=0．010及X^2=10．438,P=0．001）。骨桥蛋白和骨桥蛋白mRNA在10例小细胞肺癌组织中表达率分别为10％（1／10）和25％（4／10）,在47例非小细胞肺癌组织中表达率分别为68．1％（32／47）和78．72％（37／47）,两者比较差异有统计学意义（X^2=11．412,P=0．001及x。=6．124,P=0．013）。在肺癌组织中骨桥蛋白与骨桥蛋白mRNA的表达呈正相关（r=0．623,P=0．001）。57例肺癌患者术后随访24-40个月,中位随访28个月。骨桥蛋白及其骨桥蛋白mRNA均表达阳性组32例中8例复发,13例出现远处转移;均表达阴性组15例中仅复发1例（X^2=14．258,P=0．000）;骨桥蛋白和骨桥蛋白mRNA均表达阳性组中死亡12例,均表达阴性组无一例死亡（X^2=7．554,P=0．006）。结论骨桥蛋白及骨桥蛋白mRNA在肺癌组织中的表达增高,这与肿瘤转移及预后有关。     

骨关节炎软骨细胞中骨桥蛋白的表达调控研究

目的检测骨关节炎（0A）患者骨桥蛋白（0PN）的表达,探讨Wnt／β-catenin信号通路对OPN的表达调控作用。方法分离OA患者（骨关节炎组12例）的软骨细胞,并取非OA患者软骨细胞作为正常对照（8例）,荧光定量PCR检测OPN基因的表达;基因转染双链siRNA干扰β-catenin基因的表达;Western blot实验检测β-catenin和OPN蛋白的表达改变。结果骨关节炎组和正常对照组软骨细胞OPN的mRNA表达量分别为（0．642±0．155）和（0．226±0．077）,两组比较差异有统计学意义（t=6．74,P〈0．01）。特异性靶向双链siRNA可以下调伊catenin的表达,Western blot检测显示下调β-catenin蛋白的表达后软骨细胞OPN蛋白的表达也出现了相应的下调。结论骨关节炎患者中存在骨桥蛋白的表达上调,骨桥蛋白的上调受到Wnt/β-catcnin通路的调控。     

"中药"不可更名为"天然药物"

提出：一,“天然药物”与“中药”是两个不同的概念。“中药”是在中医药理论指导下用于防病治病的药物,有着“天然药物”有自然属性,但有特定的内涵,独特的理论体系和应用方法。二,中医药早在古代即与世界各传统医药进行着广泛的交流,并为世界许多国家的人民所接受。中药学在不断引进外国药物的同时,也早就走向了世界,不断输出到世界各国。许多药物被各传统医学吸收,并成为常用药品。三,从中药品种的混用、中药的生产环境