一株识别CD40分子新位点的单克隆抗体研制及生物学特性鉴定

目的：研制识别CD40分子新位点的单克隆抗体（mAb）。方法：以转人CD40转基因细胞L929-CD40为免疫原，常规免疫6—8周龄的雌性BALB／c小鼠；采用B淋巴细胞融合技术，将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2／0融合，以L929-CD40转基因细胞为抗体筛选阳性细胞，经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养；采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析了该mAb的亚类及抗原识别位点；采用MTT法分析mAb在体外对肿瘤细胞的促增殖效应、ELISA法测定细胞因子分泌以及PI染色分析细胞周期。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人CIM0mAb的杂交瘤细胞株（命名为286），该mAb能特异性地识别人CD40分子并较好的识别肿瘤细胞株H08910表达的CD40分子并能够体外促进肿瘤细胞增殖。结论：成功地研制1株识别CD40新位点mAb，该mAb能够很好地识别肿瘤细胞表达的CD40分子并具有体外促进肿瘤细胞生长的作用。     

一株识别CD83单克隆抗体的研制及其生物学特性鉴定

目的:鼠抗人CD83功能性单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:以人CD83转基因细胞L929/CD83为免疫原,常规免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0融合,以L929/CD83、293/CD83转基因细胞为抗体筛选阳性细胞,经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养;采用Ig类和亚类快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法、Western blot对mAb的生物学特性进行鉴定.结果:获得1株稳定分泌鼠抗人CD83mAb的杂交瘤细胞株(命名为9D8),该mAb能特异性地识别成熟的DC、活化的T细胞及肿瘤细胞株Daudi、8226表达的CD83分子,该mAb识别的位点不同于商品化抗人CD83mAb(HB15e).结论:成功地研制1株鼠抗人CD83mAb,识别位点与HB15e不同,为更好地研究该分子的功能提供良好的物质基础.     

一株鼠抗人BTLA功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性鉴定

为了研制鼠抗人BTLA功能性单克隆抗体,以高表达人BTLA分子的基因转染细胞L929/BTLA为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以基因转染细胞293T/BTLA和293T/mock作为抗原,筛选阳性杂交瘤克隆,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复鉴定和多次克隆化培养,筛选获得分泌特异性鼠抗人BTLA分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、细胞核染色体计数、竞争结合抑制试验和T增殖抑制试验等对单抗进行生物学特性的鉴定。结果表明,成功获得一株持续、稳定分泌鼠抗人BTLA单克隆抗体的杂交瘤细胞株8H9,该单抗可特异性识别基因转染细胞以及静止与活化T淋巴细胞上表达的BTLA分子,单抗8H9和BTLA交联后能显著抑制鼠抗人CD3单抗对T细胞激发的增殖作用。     

两株新的鼠抗人OX40L单克隆抗体的研制及其生物学功能的初步研究

目的:鼠抗人OX40L分子功能性单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定。方法:以高表达人OX40L分子的基因转染细胞L929/OX40L为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,经流式细胞术(FCM)分析和多次克隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人OX40L分子mAb的杂交瘤细胞株;采用Westernblot、Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法和MTT增殖试验等对单抗的生物学特性进行鉴定。结果:获得2株持续、稳定分泌鼠抗人OX40LmAb的杂交瘤细胞株,分别命名为4D6和5C2。对mAb生物学功能的研究结果表明,2株mAb均能识别成熟DC细胞以及Jurkat、SHI-1、U937等白血病细胞株表面的OX40L分子。对其中SHI-1白血病细胞株增殖影响的实验显示,这2株抗体对SHI-1的增殖都具有一定的抑制作用。结论:成功地获得了2株鼠抗人OX40L功能性mAb杂交瘤,其所分泌的抗体能特异地识别人OX40L分子,并影响表达OX40白血病细胞株的体外增殖,为进一步研究OX40/OX40L的生物学功能奠定了基础。     

一株抗人BLys单克隆抗体的制备及其生物学功能研究

研究以稳定高表达BLys的基因转染细胞L-BLys为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,L-BLys细胞和天然表达BLys的HL60细胞为抗体筛选阳性细胞株,经免疫荧光标记分析反复筛选和以有限稀释法反复克隆化培养。将获得的克隆4F7培养细胞注射入经致敏的小鼠体内,-抽取的腹水经Protein G亲和层析柱纯化。将纯化所得的抗体作用于经BLys分子刺激的扁桃体B细胞,3H-TdR检测细胞的增殖效率。结果获得1株持续、稳定分泌鼠抗人BLys单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该细胞株所分泌的抗体能阻断膜型和可溶性BLys分子对扁桃体B细胞的促增殖作用。对这株单克隆抗体生物学功能的研究表明,这株单抗能特异性识别人BLys分子及阻断膜型和可溶性BLys发挥生物学活性。     

两株鼠抗人VSIG4单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究

目的:制备鼠抗人vSIG4分子单克隆抗体(mAb)及对其生物学特性进行鉴定.方法:以高表达膜型VSIG4分子的基因转染细胞L929/VSIC4L为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经流式细胞术检测和多次;隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人VSIG4分子的杂交瘤细胞株;采用间接免疫荧光法、western blot、竞争抑制试验及MTT增殖试验等单对抗的生物学特征进行鉴定.结果:获得2株持续、稳定分泌鼠抗人VSIG4 mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为9A7和9D5.对mAb生物学特性的研究结果表明,2株mAb均能识别巨噬细胞以及jurkat、THP-1、H446等肿瘤细胞株表面的VSIG4分子.对T细胞增殖抑制的阻断实验显示,这2株抗体对VSIG4分子抑制T细胞增殖均有阻断作用.结论:成功地获得了2株鼠抗人VSIG4功能性mAb,为进一步研究VSIG4及其未知受体的生物学功能奠定了基础.     

鼠抗人CD28分子单克隆抗体的研制及生物学特性研究

目的 制备鼠抗人CD28分子的单克隆抗体（mAb),研究其在T细胞的活化、增殖及信号传导中的作用。方法 以小鼠淋巴瘤细胞转染人CD28基因的细胞株（CD28-T）为免疫原,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,获取分泌特异性mAb的杂交瘤细胞株,以体内诱生法生产腹水,并以免疫亲和层析法对其纯化,以快速定性试纸法鉴定mAb的Ig亚类,竞争抑制法分析mAb识别的抗原表位,3H-TdR掺入法研究mAb对T细胞的刺激效应,结果 成功地获得了5株分泌特异性抗入CD28mAb的杂交瘤细胞株,鉴定的1株（克隆18G8）属IgG2a,腹水效价（流式细胞仪分析）达1：2400以上,该mAb能60%阻断标准鼠抗入CD28抗体与相应抗原的结合,提示其识别的抗原表位与标准mAb不完全相同,mAb18G8可取代B7-1分子介导的协同刺激信号,促进人外周血T细胞增殖（ST=7）。结论 18G8是12株功能性mAb,具有重要的研究和应用价值。     

5株鼠抗人CD28单克隆抗体的研制及生物学特性的研究

目的：制备鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体，研究其对T细胞活化、增殖及信号转导等方面的生物学效应。方法：以天然高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞株U266和小鼠淋巴瘤细胞转人CD28基因细胞株CD28-T分别作为免疫原和检测细胞株，采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行单抗的研制；以快速定性试纸法鉴定单抗亚类；腹水诱生法和免疫亲和层析法进行单抗的制备和纯化；经间接免疫荧光法分析单抗对不同细胞膜表面CD28分子的识别；采用竞争抑制法分析单抗识别的抗原位点；利用^3H-TdR掺入法分析单抗对PBTC的刺激效应和免疫荧光法分析PBTC活化前后的表型变化。结果：成功获得5株鼠抗人CD28功能性单克隆抗体，分别命名为2D5、2F5、3136、3F8和8G8，其中2D5为IgG2a亚类，其余均为IgG1亚类；流式细胞仪分析结果显示，5株单抗均能良好识别CD28-T、U266、XGI和Jurkat细胞表面的CD28分子；竞争抑制试验表明，2D5和8G8能完全阻断标准抗人CD28单抗与U266膜CD28分子的结合，其余3株为部分阻断；^3H-TdR掺入法实验结果表明，单抗8G8联合激发型CD3单抗能明显促进PBTC的增殖，刺激指数为7．4，活化细胞CD4、CD25、ICOS、4IBB及OX40分子的表达上调。结论：5株单抗均为抗人CD28单克隆抗体，具有重要的基础研究及潜在的临床应用价值。     

鼠抗人OX40功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的：研制功能性鼠抗人OX40单克隆抗体。方法：以转人OX40的转基因细胞L929-OX40为免疫原，常规免疫6—8周龄的雌性BALB／c小鼠；采用B淋巴细胞融合技术，将免疫小鼠脾脏细胞与SP2／0融合，以L929-OX40转基因细胞及PHA活化的T细胞为抗体筛选阳性细胞，经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养；采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析了该单抗的亚类及抗原识别位点；采用MTT法分析单抗在体外对T细胞的促增殖效应以及ELISA分析活化T细胞分泌的细胞因子。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为7E11)，该单抗能特异性地识别人OX40分子和介导有效的共刺激信号，体外促进活化的T细胞增殖和细胞因子的分泌。结论：成功研制成一株能分泌功能性鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤，该抗体特异性地识别人OX40分子并具有在体外协同刺激T细胞的作用。     

一株鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究

目的：鼠抗人4—1BBL功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定。方法：以高表达人4—1BBL分子的基因转染细胞L929／4—1BBL为免疫原，常规免疫BALB／c小鼠，采用B淋巴瘤杂交瘤技术进行细胞融合，经流式细胞术分析和多次克隆化培养，筛选特异性杂交瘤细胞株；采用Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法对单抗的生物学特性进行鉴定，并采用体外细胞计数和ELISA检测分析单抗对单核细胞的作用。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人4-1BBL单抗的杂交瘤细胞株，命名为3E7。该单抗能识别人白血病细胞株和单核细胞表面的4-1BBL分子。对单抗生物学功能的研究结果表明，该单抗能有效地促进外周血单核细胞体外生长，并促进IL-6和TNF-α的分泌。结论：成功地获得了一株鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体3E7，该单抗能特异地识别人4-1BBL分子，并有效地通过激发4-1BBL逆向信号通路促进单核细胞的体外生长及细胞因子的分泌。     

鼠抗人OX40L功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的　鼠抗人OX4 0L分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定。方法以高表达人OX4 0L分子的转基因细胞L92 9/OX4 0L为免疫原 ,常规免疫BALB/c小鼠 ,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合 ,并以L92 9/OX4 0L为阳性抗体筛选细胞 ,L92 9/mock为阴性抗体筛选细胞 ,经免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养 ,筛选出特异分泌鼠抗人OX4 0L分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ;采用Westernblot、Ig亚型快速定性试纸法、间接免疫荧光法、竞争结合抑制试验和3 H TdR增殖试验等对单抗进行生物学特性的鉴定。结果　成功获得 3株持续、稳定分泌鼠抗人OX4 0L单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,命名为 9H10、4C12和 1G1。对单抗的生物学功能的研究结果表明 ,3株单抗均能识别活化B细胞和成熟DC表达的OX4 0L分子 ,且能抑制成熟DC对T细胞的促增殖作用 ,并与阻断型抗人B7 1单抗具有协同作用。结论　获得的 3株分泌鼠抗人OX4 0L功能性单克隆抗体的杂交瘤 ,所分泌的抗体具有特异性地识别人OX4 0L分子并能阻断OX4 0 /OX4 0L共刺激信号及抑制DC对T细胞的激发作用。     

A novel blocking monoclonal antibody recognizing a distinct epitope of human CD40 molecule

CD40, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, is an important costimulatory molecule during the immune response. Here, we report a blocking mouse antihuman CD40 monoclonal antibody, mAb 3G3, of which the specificity was verified by flow cytometry and Western blot. It was shown by competition test that 3G3 bound to a different site (epitope) of CD40 from the reported CD40 mAbs, including clone mAb89, 3B2, and 5C11. It was also found that mAb 3G3 could inhibit homotypic aggregation of Daudi cells induced by the agonistic anti-CD40 mAb 5C11. Furthermore, mAb 3G3 effectively inhibited the proliferation of peripheral blood mononuclear cells in mixed lymphocyte reaction assay. Finally, a sensitive and specific soluble CD40 (sCD40) ELISA kit was established by matching mAb 3G3 with 5C11, and it was found that the levels of sCD40 in sera from patients with immune disorders such as hyperthyroidism, chronic nephritis, and rheumatoid arthritis were obviously higher than those from normal individuals. Thus, this blocking anti-CD40 mAb provides a novel tool for the study of CD40.     

Properties of mouse CD40: Cellular distribution of CD40 and B cell activation by monoclonal anti-mouse CD40 antibodies

We describe here the derivation of a rat monoclonal antibody (mAb) against mouse CD40 (designated 3/23), which stains 45–50% of spleen cells of adult mice, approximately 90% of which are B cells. Interestingly, some 5–10% of both CD4⁺ and CD8⁺ T cells in the spleens of (some, but not all) adult, unimmunized mice are also CD40⁺, whereas CD40⁺ cells were not detectable in the thymus, even following collagenase digestion. Some 35–40% of lymphoid cells in the bone marrow of adult mice are CD40⁺ and virtually all of these are B220⁺, and hence of the B cell lineage: triple-color flow cytometry showed that CD40 is expressed at low levels on some 30% of pre-B cells, at intermediate levels on 80% of immature B cells and on essentially all mature B cells in the bone marrow. These results, therefore, suggest that in the mouse CD40 is expressed relatively late during the process of B cell differentiation. The mAb induced marked up-regulation of major histocompatibility complex class II molecules, CD23 and B7.2 antigens on mature B cells. It also stimulated modest levels of DNA synthesis in mature B cells by itself: this was markedly enhanced by suboptimal concentrations of mitogenic (but not non-mitogenic) anti-μ and anti-δ mAb, and moderately enhanced by co-stimulation with interleukin-4. Hyper-cross-linking of CD40 (using biotinylated mAb and avidin) also enhanced the proliferative response to anti-CD40.     

一株鼠抗人TLT-2单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

为了制备鼠抗人TLT-2单克隆抗体(mAb)并对其生物学特性进行初步的研究。以TLT-2基因转染细胞株免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠抗人TLT-2 mAb,收集腹水,并用ProteinG亲和层析法纯化。以流式细胞术、IP和Western blot等方法鉴定该单抗的特异性。并通过流式细胞术、CCK8和ELISA等方法对单抗的生物学特性进行了初步分析。结果:获得一株持续稳定分泌鼠抗人TLT-2 mAb的杂交瘤细胞株,命名为8C10。杂交瘤细胞分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ)。IP和Western blot分析证明,8C10能特异性识别人TLT-2分子。经8C10荧光染色后流式细胞术的结果表明:TLT-2在T细胞表面呈弱阳性表达,在单核细胞和B细胞表面呈强阳性表达。细胞增殖实验结果显示,该mAb对T细胞的增殖有抑制作用。提示,成功获得了一株特异性鼠抗人TLT-2 mAb,该mAb对T细胞体外增殖及其细胞因子IFN-γ、IL-2、和IL-10的分泌均有明显的抑制作用。     

抗人CD134单抗对植物血凝素诱导的外周血单个核细胞穿孔素表达的影响

目的 观察不同浓度抗人CD134单抗对外周血单个核细胞（PBMC）穿孔素表达的影响及时间效应，旨在探讨抗人CD134单抗治疗自身免疫性疾病的可能机制。方法 在植物血凝素诱导下，分别以1μg／ml、5μg／ml和10μg／ml的抗人CD134单抗作用于人PBMC，于6h、12h、24h、48h用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测穿孔素mRNA表达，流式细胞仪检测穿孔素蛋白表达。结果 不同浓度的CD134单抗作用不同时间后，健康成人PBMC穿孔素mRNA和蛋白的表达均有不同程度的下调，且在24h达最低值。当CD134单抗≤5μg／ml时，随着单抗浓度的增加，穿孔素mRNA明显下调，其差异有统计学意义，当CD134单抗浓度〉5μg／ml时，穿孔素mRNA不再下调（P〉0．05）；穿孔素蛋白表达也有类似的变化。结论 抗人CD134单抗可以在转录水平和翻译水平上抑制穿孔素的表达，这种作用在24h达到高峰且会饱和，这可能被用于治疗某些自身免疫性疾病。     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体的构建及其表达

目的:通过基因工程抗体改造技术构建并表达抗人CD40人-鼠嵌合抗体。方法:从分泌鼠抗人CD40单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株(5C11)中提取总RNA,用一对特异性引物通过RT-PCR扩增mAbVH和VL的DNA编码区基因。根据序列分析的结果,设计引物扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。利用基因重组技术,将mAb5C11的VH、VL基因及其相应信号肽序列与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/h5C11。用脂质体法将其导入293T细胞株中进行瞬时表达。利用流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI基因数据库Blast的结果显示,克隆的基因序列符合小鼠VH、VL基因及其信号肽序列的特征。表达质粒pIRES/h5C11的构建正确,并在293T细胞株中获得瞬时表达。表达的抗人CD40的人-鼠嵌合抗体和mAb5C11具有相同的抗原结合位点。结论:成功地克隆了鼠抗人CD40mAbV区编码基因,并实现了可溶性抗人CD40的人-鼠嵌合抗体在293T细胞中的瞬时表达。     

两株抗人CD40配体单克隆抗体的制备及生物学特性的研究

目的 :研制功能性抗CD4 0L单克隆抗体 ,探讨其生物学特性及其运用价值。方法 :采用B淋巴细胞融合、免疫荧光、免疫印迹和竞争抑制等方法获得鼠抗人CD4 0LmAb ,通过Daudi细胞生长抑制试验、混合淋巴细胞反应观察抗CD4 0LmAb的生物学功能。结果 :经表型分析、Westernblot和竞争抑制试验 ,证实mAbB1、mAb4F1是识别人CD4 0L分子的特异性单抗 ,且识别的位点不同 ;mAbB1、mAb4F1均能不同程度地拮抗CD4 0L TC介导的Daudi细胞生长抑制和抑制混合淋巴细胞反应。结论 :成功地获得两株能稳定分泌特异性抗人CD4 0L单克隆抗体的杂交瘤 (1B1、4F1) ,这两株单抗对CD4 0L的生物学功能具有明显的阻断作用 ,为阻断型单抗