应用电化学基因芯片鉴别A型流感病毒亚型

为了验证电化学基因芯片技术检测A型流感亚型的可行性,应用建立的电化基因芯片方法分别检测了9株不同亚型的A型流感病毒抗原、1株新城疫病毒抗原和10份临床样品。结果为电化学基因芯片均能特异检出相应的A型流感病毒亚型,与新城疫病毒抗原无交叉反应;临床样品中,检出5份为H6N6亚型流感病毒核酸阳性、2份为H6H2亚型禽流感病毒核酸阳性、3份为H9H2亚型禽流感病毒核酸阳性。结果表明,电化学基因芯片方法适合A型流感病毒各亚型的鉴别,具有快速、特异的特点。     

猪流感病毒分型基因芯片的建立和初步应用

根据流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）亚型基因序列间的差异性,分别设计H1、H3、H9、N1和N2的特异分型引物,并根据M基因设计A型流感病毒的通用引物。RT-PCR扩增猪流感病毒各亚型HA、NA和M基因的特异片段,克隆至pMD18-T构建重组质粒,制备探针。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上,制成基因芯片。并对217份不同地区的样品进行检测。结果表明：该芯片可以同时检测待检样品中5种亚型A型流感病毒,并显示了较高的灵敏度和特异性,灵敏度比PCR高1个稀释度,比病毒分离高2个稀释度。该方法的建立为猪流感的检测及猪流感病毒各亚型在猪群中的流行病学调查提供了一种快速、灵敏和高通量的手段。     

H7和N9亚型及A型流感病毒多重荧光定量RT-RCR检测方法的建立

为同时检测H7亚型、N9亚型和A型流感病毒,本研究根据流感病毒H7 HA、N9 NA以及M基因序列分别合成3对引物和3种荧光素标记的探针,建立了多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法.特异性试验结果显示,仅H7亚型和N9亚型病毒分别在FAM和JOE通道监测到荧光信号,而所有A型参考流感病毒株均可获得Cy5荧光信号,此外其他相关的禽源病毒检测结果均为阴性.同时,以H7N9亚型病毒RNA为模板建立了标准曲线,检测H7 HA、N9 NA以及M基因的R2值均为0.999,最低检出量均为35.4 EID50/mL.批内和批间试验的变异系数均小于1.48％.利用该方法对1 072份临床样品(咽喉和泄殖腔拭子)检测,H7N9亚型和A型流感病毒分别检出7份和23份.该方法可以有助于H7N9亚型和A型流感病毒的快速检测及鉴定.     

双重RT-PCR快速检测H7N9流感病毒方法的建立

为建立简便快速检测H7N9亚型流感病毒的方法,根椐GenBank中H7亚型流感病毒的HA基因序列和N9亚型流感病毒的NA基因序列,设计2对特异性引物,在建立H7亚型和N9亚型单项RT-PCR的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立同时检测H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR。对H7N9亚型流感病毒核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增HA基因263bp、NA基因520 bp的特异性片段,而对其他常见亚型的流感病毒的RT-PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR方法的检测下限为3 pg的H7N9病毒模板。利用该双重RT-PCR方法对30份临床样品进行H7N9病毒进行检测,与病毒分离方法进行对比,结果显示,两者的符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7N9流感病毒的同时检测和鉴别诊断,为H7N9亚型流感的有效防控提供技术支撑。     

H9亚型流感病毒数字RT-PCR检测方法的建立与应用

通过数字RT-PCR和实时定量RT-PCR两种方法的比对试验,建立快速检测H9亚型流感的数字RT-PCR方法。利用同一对引物和探针,以梯度稀释的方法测定这两种方法针对H9亚型流感的灵敏性、特异性及重现性。结果显示:两种方法均能够检测出104倍稀释的H9亚型流感病毒,而数字RT-PCR可以检测出单个微滴中的H9亚型流感病毒,其灵敏度性高于实时定量RT-PCR;两种方法的特异性和重复性都较好,对H3N2、H4N2、H6N2等亚型流感病毒均未有扩增反应。数字RT-PCR方法比实时定量RT-PCR具有更高的灵敏度,在快速检测H9亚型流感病毒方面可发挥重要作用。     

多重RT-PCR方法检测新型甲型H_1N_1流感病毒的研究

为了建立快速检测新型甲型H1N1流感病毒的多重PCR技术,根据GenBank中公布甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)的HA和NA基因序列,设计并合成两套特异性引物。使用TaKaRa公司的一步法RT-PCR试剂盒和自行设计合成的引物建立多重RT-PCR反应,按照预期的PCR产物序列合成的DNA作为阳性对照。结果表明,该方法具有良好的特异性,可以将甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)与传统甲型H1N1、H3N2、H5N1、H6N2和H9N2亚型流感病毒区分。该方法同时具有较高的灵敏度,最低可以检测到100个拷贝的阳性克隆质粒。在对183份发热病人临床咽拭子样品检测中发现了10份阳性样品,对350份猪鼻腔拭子样品检测全部呈阴性,结果与中国检验检疫科学研究院试剂盒检测结果一致,说明了该多重RT-PCR方法在临床检测新型甲型H1N1流感病毒方面具有广阔的应用前景。     

4株不同亚型流感病毒NP基因的原核表达

为了进一步研究A型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用,采用RT-PCR技术分别扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等4株不同亚型流感病毒的NP基因,分别将其克隆到原核表达载体pET30(a)上,在大肠埃希菌中进行诱导表达.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,H1N1亚型流感病毒NP蛋白得到表达,并且能分别与H1N1和H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应,具有良好的反应活性;而H3N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒的重组NP蛋白未获得表述.本研究结果表明,不同毒株的NP蛋白在大肠埃希菌中的表达具有一定差异性,为把NP蛋白作为诊断抗原的开发、ELISA诊断方法的建立以及蛋白功能的研究奠定了基础.     

A型流感病毒聚合酶研究进展

A型流感病毒(Influenza A virus,IV)基因组为单负链线状分节段RNA,总长约13 600个核苷酸(nt).根据襄膜上血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同,可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9).A型流感病毒可突破种问障碍适应新的宿主,从而导致新的血清型毒株流行.1918年、1957年和1968年3次大规模流感疫病的暴发,给人们敲响了警钟.在此背景下,疫苗不断更新、预防流感病毒的药物相继问世,但目前的疫苗和治疗药物并不能完全阻止流感病毒对人类的感染,新疫苗的研制和新药物靶点的发现具有明显的滞后性.     

供港猪群流感病毒的分离鉴定及流行病学调查

为了对供港猪群中的猪流感流行情况进行分析,从华南地区供港猪群中用无菌棉拭子采集鼻腔粘液样品,采用鸡胚接种方法,从供港猪群中分离出了2株不同亚型的猪流感病毒株,经国家流感中心鉴定分别为H1N1和H3N2亚型。本研究设计了猪流感常见亚型的HA和NA分型特异性引物,建立了猪流感型特异性RT-PCR检测方法;对分离鉴定的2株猪流感病毒和禽流感H5N1 HI检测抗原进行了RT-PCR检测,并对其部分HA和NA基因进行克隆测序分析。对供港猪群的血清检测结果表明:供港猪群中H1N1和H3N2亚型抗体阳性率分别为26.87%、38.26%,禽流感H5N1和H9N2亚型抗体阳性率均为0%。     

禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR检测技术的建立

研究建立了禽流感病毒（AIV）A型、H5、N1、H9、N2亚型特异性RT-PCR及HS／N1、H9／N2、A／H5／Nl多重RT-PCR检测技术，用于检测或同时检测和鉴别A型及H5N1、H9N2亚型AIV。所建立的RT-PCR和多重RT-PCR从核酸提取、基因扩增到产物分析在3～4h内即可完成，经对36株AIV及相关病毒分离物检测，与病毒分离鉴定的结果完全一致，且与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用多重RT-PCR检测80份棉拭子样品，并与病毒分离鉴定方法比较，二者H5N1、H9N2亚型的鉴定结果完全吻合。结果表明，该方法具有快速、敏感、特异等优点，为临诊样品中AIV型及H5N1、H9N2亚型鉴定和诊断的有效方法。     

D型流感病毒概述

文章对近年来新发现的D型流感病毒的病原学特征、流行病学、致病机理、检测方法及预防进行概述,为相关研究的深入开展和防控提供参考。     

禽流感病毒的理化消毒

禽流感是影响世界养禽业的重要疫病之一，此外还对人类公共卫生造成重要威胁：禽流感的一种可能传播途径是通过人类相关的活动，如人员的流动，运载工具如车辆及其它污染物和未进行彻底消毒的感染动物等。因此，假如人员、衣服、鞋、车辆，农具及其它材料不能够彻底消毒，则禽流感的感染就会持续存在，同时对养禽业及公共卫生的威胁就不会根除。为此，清除并消毒被认为是控制禽流感过程中必不可少的步骤：本文重点阐述当前禽流感病毒的物理、化学消毒剂的研究现状及每类消毒剂的适用范围和注意事项。     

禽流感病毒研究进展

依据禽流感病毒的致病特性、抗原蛋白特性和宿主细胞受体特点,笔者从分子水平上就禽流感病毒基因组、宿主特异性和致病性等方面进行了综述.     

流感病毒抗原表位的研究进展

流感病毒抗原表位的研究,不仅是对流感病毒致病机理和机体免疫系统反应的探究,还能很好地指导对流感的防治。作者从抗原表位的特点,流感病毒抗原表位的特点、研究进展及流感病毒抗原表位疫苗的应用几个方面进行了综述。     

猪流感病毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从我国东北地区猪群中分离出 3株H3 N2 猪流感病毒 (SIV) ,分别命名为A/Swine/Heilongjiang/ 1/ 2 0 0 0、A/Swine/Heilogjiang/ 2 / 2 0 0 0和A/Swine/Heilogjiang/ 3/ 2 0 0 0。SIV分离株第 8代病毒液对 0 .5 %豚鼠红血球的血凝价分别为2 0 48log2 、2 0 48log2 、40 96log2 ;将其制成琼扩 (AGP)抗原与禽流感标准阳性血清均出现清晰白色沉淀线 ;与流感病毒H3 亚型标准阳性血清的血凝抑制 (HI)价分别为 8log2 、7log2 、7log2 ,但不能被鸡新城疫阳性血清抑制。这 3株SIV都为热不稳定型 ;均能凝集驴、绵羊、鸡、兔、豚鼠、小鼠、大鼠、人O型血红血球 ,对马、牛红血球均不凝集 ;感染一个病毒最小致死量的鸡胚平均死亡时间分别为 86 .4、12 9.6和 91.2小时 ;每 0 .2ml病毒液鸡胚半数感染量分别为 4.75lg、4.5lg、和 6 .0lg ;对鸡的静脉内接种致病指数和脑内接种致病指数各为 0 .5 6、0 .32、0 .5 2和 0 .77、0 .38、0 .5 2 ;对小鼠的半数致死量分别为 2 .6lg、2 .0lg和 2 .5lg ;试验感染小鼠、豚鼠和猪均可发病并出现死亡。存活动物接种后第 6天和第 14天的血清 ,其HI价均在 8log2 以上 ,而AGP均为阴性。     

禽流感病原学研究进展简

禽流感（avianinfluenza,AI）是由A型禽流感病毒（avianinfluenzavirus,AIV）引起的一种禽类的感染疾病综合征。本文通过对禽流感病毒的结构和分子生物学特征等的描述,为H5N1禽流感病毒致病机理的认识及临床诊断提供帮助。     

自噬与A型流感病毒感染

自噬是广泛存在于真核细胞内的新陈代谢过程,对于维持细胞自稳具有关键作用。在病毒感染过程中,自噬表现出两面性,既可被利用来促进病毒复制,又在宿主抗感染免疫应答中发挥重要作用。论文以严重危害畜禽生产和人类健康的A型流感病毒为例,论述了细胞自噬与病毒感染及在宿主免疫应答过程中的相互关系,旨在进一步深入理解A型流感病毒的致病分子机制,为抗流感病毒感染的相关研究提供参考。     

禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达

为克服禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)仅诱导机体产生亚型特异性免疫应答的不足,本研究拟将病毒核蛋白(NP)基因与HA基因在重组禽痘病毒中实现共表达。首先构建转移载体,从测序质粒pUCNP中切下目的基因克隆到载体pSY538早晚期启动子LP2EP2的下游,再将含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2的NP基因片段亚克隆到已有的AIVHA基因重组禽痘病毒转移载体中,即得到同时含有HA和NP两种基因的重组转移载体pSY(HA NP)。将转移载体脂质体转染已感染禽痘病毒亲本株S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞。根据报告基因β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达,蓝白斑法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及West-ern-blot分析,结果表明所获得的重组病毒能高效表达AIVHA及NP两种蛋白。此研究为进一步研制更为有效的禽流感基因工程活病毒载体疫苗奠定了基础。