PLIN2通过调控SREBP2促进RAW264.7巨噬细胞脂质蓄积

目的:探讨脂滴包被蛋白2(PLIN2)是否通过调控固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)影响小鼠RAW264.7巨噬细胞中脂质蓄积.方法:采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理RAW264.7巨噬细胞不同时间(0、6、12、24和48 h),Western blot检测PLIN2和SREBP2蛋白表达水平;过表达或敲...     

甲基莲心碱对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响

目的探讨甲基莲心碱(Nef)对巨噬泡沫细胞形成的作用及机制。方法采用体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,ox-LDL诱导建立泡沫细胞模型,用Nef进行干预。油红O染色观察细胞内脂质堆积情况,酶比色法定量细胞内总胆固醇和胆固醇酯的变化,免疫荧光和流式细胞术分析CD36受体蛋白表达,RT-PCR检测CD36受体mRNA表达。结果与ox-LDL诱导组相比,Nef保护组巨噬细胞的油红O染色阳性细胞数和细胞内脂质含量均显著减少;同时CD36受体蛋白和mRNA表达明显降低。结论Nef可抑制ox—LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化,该作用可能与Nef下调巨噬细胞CD36受体表达,从而减弱巨噬细胞对ox—LDL的摄取有关。     

脂肪分化相关蛋白通过蛋白激酶C和酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1促进THP-1巨噬细胞蓄积脂质

目的： 探讨脂肪分化相关蛋白促进THP-1巨噬细胞蓄积脂质的机制。方法： 使用高胆固醇饲料喂养新西兰兔12周，复制动脉粥样硬化动物模型。然后用Western blotting和免疫组织化学染色观察兔主动脉脂肪分化相关蛋白及蛋白激酶C的表达。THP-1巨噬细胞与氧化低密度脂蛋白孵育不同的时间，使细胞负荷胆固醇酯后，用RT-PCR的方法观察脂肪分化相关蛋白及酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1的表达，用PepTagassay琼脂糖凝胶电泳及分光光度法观察蛋白激酶C的活性。在负荷胆固醇酯的THP-1巨噬细胞中分别加入蛋白激酶C的激动剂佛波酯和抑制剂钙磷酸结合蛋白，观察脂肪分化相关蛋白的表达，同时使用油红O染色和高效液相色谱法测定细胞内脂质的变化。瞬时转染pcDNA3.1-HA-adi表达载体到THP-1巨噬细胞，复制高表达脂肪分化相关蛋白的细胞模型。在负荷、不负荷胆固醇酯或ACAT抑制剂存在的状态下，观察酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1表达及细胞内胆固醇酯的改变。结果： 与对照组相比，兔主动脉病变处脂肪分化相关蛋白及蛋白激酶C表达均显著增加。负荷胆固醇酯的THP-1巨噬细胞中脂肪分化相关蛋白及酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1表达上调，蛋白激酶C的活性升高。荷脂细胞与蛋白激酶C激动剂共孵育后，可以协同增强上调脂肪分化相关蛋白的效应，细胞内脂质增多；如果荷脂细胞同时与蛋白激酶C抑制剂共孵育，可以有效抑制荷脂所致的脂肪分化相关蛋白高表达，细胞内脂质减少。高表达脂肪分化相关蛋白的THP-1巨噬细胞能够使酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1表达增加，促进细胞内胆固醇酯蓄积。加入酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶抑制剂后，这些作用被减弱。结论： 脂肪分化相关蛋白可能是通过蛋白激酶C活性的改变影响酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1的活性，从而影响细胞内脂质的蓄积。     

卡介苗诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化与上调CD36表达有关

目的探讨卡介苗(BCG)感染对小鼠RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响以及引起RAW264.7巨噬细胞泡沫化形成的相关机制。方法培养RAW264.7巨噬细胞, 40μg/mL氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)预处理30 min,按BCG∶RAW264.7巨噬细胞=1∶1、 5∶1、 10∶1、 20∶1比例感染RAW264.7巨噬细胞24 h,油红O染色法检测不同感染比例的BCG感染对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响,以确定BCG感染诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化形成的最适感染比例。接着分别用热灭活和未灭活的BCG以最适感染比例感染RAW264.7巨噬细胞,感染24h后分别对各组细胞进行油红O染色和提取RNA,探讨不同活力的BCG感染对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响和对RAW264.7巨噬细胞脂质摄入相关受体清道夫受体A1(SR-A1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、 CD36的mRNA表达水平的影响。结果不同感染比例的BCG均可诱导RAW264.7巨噬细胞发生泡沫样改变,其中以10∶1的感染比例最为明显。灭活BCG与未灭活BCG均引起RAW264.7巨噬细胞泡沫化,其中未灭活的BCG感染组RAW264.7巨噬细胞泡沫化更为显著。与未感染组相比, BCG感染24 h后, CD36 mRNA的表达显著上调,且上调程度与RAW264.7巨噬细胞泡沫化程度相关。结论 BCG诱导巨噬细胞泡沫化形成可能与CD36的表达上调有关。     

阿魏酸钠对高脂血症致动脉粥样硬化过程中胆固醇和甘油三酯代谢的影响

目的：观察阿魏酸钠(SF)对高脂血症引起的动脉粥样硬化(AS)过程中胆固醇和甘油三酯代谢的影响，进一步探讨其抗动脉粥样硬化的作用机制。方法: 高胆固醇喂养复制AS动物模型；以氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）与小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞体外共培养，诱导建立泡沫细胞模型，与人肝母细胞瘤细胞株HepG2细胞体外共培养，建立损伤细胞模型；分别给予SF进行干预。检测实验动物AS斑块面积和血脂水平，油红O染色观察RAW264.7细胞内脂质堆积情况，高效液相色谱定量分析RAW264.7细胞内胆固醇的含量，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定HepG2细胞肝脂酶（HL）mRNA的表达水平。结果: (1)与高脂组相比，高脂+SF组动物主动脉粥样斑块面积明显减小（P<0.01），血浆甘油三酯水平显著降低（P<0.01），但血浆胆固醇水平无明显改变（P>0.05）；(2) 与ox-LDL组相比，ox-LDL+SF处理组中HepG2细胞HL mRNA表达水平显著增加（P<0.01），但RAW264.7细胞内胆固醇含量无明显改变（P>0.05）。结论: SF能降低高胆固醇导致的AS斑块面积，具有抗动脉粥样硬化的作用，其作用机制可能与上调HL mRNA表达水平从而降低血浆甘油三酯水平有关，而与血浆胆固醇水平和ox-LDL诱导的巨噬泡沫细胞形成无关。提示血浆甘油三酯升高是AS的独立危险因素，HL介导的甘油三酯代谢途径可能是AS治疗的潜在靶点。     

载脂蛋白E在ABCA1和ABCG1介导的胆固醇流出中的作用

目的:探讨载脂蛋白E(ApoE)在ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)和ATP结合盒转运蛋白G1(ABCG1)介导的胆固醇流出中的作用及可能机制。方法:将RAW264.7细胞随机分为3组:空白对照组:用单纯培养基培养;低密度脂蛋白受体基因敲除(LDLr^-/-)组:用20mg/LLDLr^-/-小鼠脂蛋白处理细胞;ApoE基因敲除(ApoE^-/-)组:用20mg/LApoE^-/-小鼠脂蛋白处理细胞。采用透射电镜和酶法检测细胞内脂质含量,用液闪仪技术检测胆固醇流出变化,用免疫印迹技术和实时定量PCR技术检测ABCA1和ABCG1的表达水平。结果:与对照组相比,LDLr^-/-小鼠脂蛋白处理后细胞内脂质含量并未明显改变,而ApoE^-/-小鼠脂蛋白处理48h后,细胞内胆固醇酯增加了60%;同时,与LDLr^-/-小鼠脂蛋白处理组相比,用ApoE^-/-小鼠脂蛋白处理后,巨噬细胞胆固醇流出至载脂蛋白A-I(ApoA-I)和高密度脂蛋白(HDL)的量均明显降低。与对照组相比,LDLr^-/-小鼠脂蛋白和ApoE^-/-小鼠脂蛋白处理显著增加ABCA1和ABCG1的蛋白和mRNA水平,但是ApoE^-/-小鼠脂蛋白对ABCA1和ABCG1蛋白和mRNA水平的诱导程度明显低于LDLr^-/-小鼠脂蛋白。结论:ApoE在介导巨噬细胞胆固醇流出中发挥重要作用,该作用与其调节ABCA1和ABCG1的表达水平有关。     

Api6在高脂高胆固醇饮食引起肺部炎症中所发挥作用的研究*

 目的：研究凋亡抑制因子6（Api6）在高脂高胆固醇饮食所致C57BL/6J小鼠肺部炎症反应中的作用。方法：6～8周龄的C57BL/6J雄性小鼠喂养于SPF环境中,随机分成2组,分别给予普通饮食和高脂高胆固醇饮食喂养。喂养16周后收集肺组织并采用免疫组织化学和ELISA法鉴定肺组织的炎症状态。实时定量PCR和Western blotting鉴定Api6 mRNA与蛋白的表达水平,流式细胞术检测小鼠支气管肺泡灌洗液细胞凋亡情况。体外培养巨噬细胞RAW264.7,流式细胞术检测Api6对氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）引起的细胞凋亡的影响。结果：高脂高胆固醇饮食喂养小鼠16周后,C57BL/6J小鼠肺组织出现以巨噬细胞蓄积以及肿瘤坏死因子α和单核细胞趋化蛋白1升高为主的炎症反应。与普通饮食组相比,高脂高胆固醇饮食喂养小鼠肺组织的Api6 mRNA和蛋白表达水平都显著上调（P<0.01）,同时支气管肺泡灌洗液中的巨噬细胞凋亡水平明显下降（P<0.01）。体外实验证实500 μg/L的重组Api6处理RAW264.7细胞可显著抑制oxLDL引起的细胞凋亡（P<0.05）。结论：高脂高胆固醇饮食可致C57BL/6J小鼠肺组织巨噬细胞蓄积,其机制可能与Api6抑制巨噬细胞的凋亡有关。     

IL-17A通过上调ABCA1的表达减少RAW264.7巨噬细胞脂质的积聚

目的:探讨白细胞介素17A(IL-17A)对RAW264. 7巨噬细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)表达的影响。方法:用不同浓度及的IL-17A处理小鼠RAW264. 7细胞6 h或24 h,或用同一浓度IL-17A处理RAW264. 7细胞不同时间;采用RT-qPCR及Western blot法检测细胞ABCA1的mRNA和蛋白表达情况;采用NBD-胆固醇法检测细胞胆固醇流出情况;采用油红O染色法测定细胞脂质蓄积情况。结果:与对照组相比,IL-17A可以增加RAW264. 7巨噬细胞ABCA1蛋白的表达水平,但不影响ABCA1 mRNA的表达。经IL-17A干预,RAW264. 7巨噬细胞内胆固醇向Apo A-1流出增多,同时细胞脂质蓄积显著减少(P 0. 01)。结论:IL-17A可以增加RAW264. 7巨噬细胞ABCA1的表达水平,其机制并不是通过转录水平实现的,这种影响可能与其抗动脉粥样硬化作用有关。     

miRNA-33对Hcy干预RAW264.7巨噬细胞衍生的泡沫细胞表达ABCA1/ABCG1的影响

目的:研究同型半胱氨酸(Hcy)是否通过微小RNA-33 (miRNA-33)抑制三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)和三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ABCG1)的表达,从而降低胆固醇逆转运(RCT)效率。方法:复制RAW264.7巨噬细胞经氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导为泡沫细胞的模型,油红O染色确定模型是否复制成功,用LipofectamineTM2000将miRNA-33 mimics和miRNA-33 inhibitor分别转染入细胞内,再给予5 mmol/L的Hcy干预24 h后进行实验;用油红O染色观察细胞内脂滴情况;real-time PCR和Western blot检测ABCA1和ABCG1的mRNA和蛋白表达水平;液体闪烁计数法检测细胞内胆固醇流出率;高效液相色谱分析细胞内胆固醇含量。结果:(1)与空白对照组相比,miRNA-33 mimics组细胞内脂滴含量增加,ABCA1和ABCG1的mRNA和蛋白表达量降低(P 0.05),细胞内胆固醇含量逐渐增加(P 0.05),细胞内胆固醇流出率逐渐减少(P 0.05);(2)与空白对照组相比,miRNA-33 inhibitor组检测结果与miRNA-33 mimics组的结果相反,差异具有统计学意义(P 0.05);(3)空白对照组、miRNA-33 mimics-NC组和miRNA-33 inhibitor-NC组3组间相比,所有检测结果的差异均无统计学显著性。结论:Hcy可间接通过诱导miRNA-33表达而抑制ABCA1和ABCG1的蛋白表达,降低RCT效率。     

Sortilin调控ABCA1蛋白水平影响荷脂巨噬细胞内脂质流出

目的　探讨Sortilin对荷脂THP-1巨噬细胞ABCA1蛋白表达及胞内脂质流出的影响。 方法　采用Western blot和qRT-PCR检测细胞内ABCA1蛋白和mRNA表达水平；Co-IP实验检测Sortilin和ABCA1的结合情况；高效液相色谱法检测细胞内总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯含量变化；油红O染色观察细胞内脂滴情况。 结果　Sortilin下调细胞内ABCA1蛋白水平，但对其mRNA水平无显著影响；Co-IP结果表明Sortilin能与ABCA1结合；与对照组相比，Sortilin过表达后荷脂巨噬细胞内胆固醇流出减少，胞内脂质含量增加且脂滴肥大，数量明显增多，Sortilin沉默后荷脂巨噬细胞胆固醇流出增加，胞内脂质含量减少，脂滴瘦小，数量减少；溶酶体抑制剂氯喹共处理可部分逆转Sortilin过表达对巨噬细胞ABCA1蛋白和胆固醇流出的抑制作用。 结论　Sortilin下调巨噬细胞ABCA1蛋白水平，抑制胆固醇流出，促进胞内脂质蓄积。     

Sortilin调控ABCA1蛋白水平影响荷脂巨噬细胞内脂质流出

目的　探讨Sortilin对荷脂THP-1巨噬细胞ABCA1蛋白表达及胞内脂质流出的影响。 方法　采用Western blot和qRT-PCR检测细胞内ABCA1蛋白和mRNA表达水平;Co-IP实验检测Sortilin和ABCA1的结合情况;高效液相色谱法检测细胞内总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯含量变化;油红O染色观察细胞内脂滴情况。 结果　Sortilin下调细胞内ABCA1蛋白水平,但对其mRNA水平无显著影响;Co-IP结果表明Sortilin能与ABCA1结合;与对照组相比,Sortilin过表达后荷脂巨噬细胞内胆固醇流出减少,胞内脂质含量增加且脂滴肥大,数量明显增多,Sortilin沉默后荷脂巨噬细胞胆固醇流出增加,胞内脂质含量减少,脂滴瘦小,数量减少;溶酶体抑制剂氯喹共处理可部分逆转Sortilin过表达对巨噬细胞ABCA1蛋白和胆固醇流出的抑制作用。 结论　Sortilin下调巨噬细胞ABCA1蛋白水平,抑制胆固醇流出,促进胞内脂质蓄积。     

重组nesfatin-1蛋白对ox-LDL诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7泡沫化的抑制作用和机制研究

目的探究nesfatin-1对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的巨噬细胞泡沫化的作用和分子机制。方法将小鼠RAW264.7巨噬细胞分成3组:对照组(不进行任何处理)、模型组(加入80 mg/L ox-LDL诱导泡沫细胞形成)、nesfatin-1组(加入80 mg/L ox-LDL前2 h加入1×10~(-8)mol/L重组小鼠nesfatin-1蛋白)。油红O染色观察泡沫细胞的形成;试剂盒检测细胞内胆固醇水平[总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)、胆固醇酯(CE)和胆固醇酯化率(CER)];Western blot检测nesfatin-1蛋白、脂质摄取相关蛋白(CD36和LOX-1)与胆固醇排出调节蛋白(ABCA1和ABCG1)和AMPK通路蛋白[AMPK和磷酸化AMPK(p-AMPK)]表达。结果与对照组相比,模型组中nesfatin-1蛋白表达显著降低,细胞质中出现大量被染成红色的脂质颗粒,TC、FC、CE和CER水平升高,CD36和LOX-1表达上调,ABCA1、ABCG1和p-AMPK/AMPK水平下调,差异均有统计学意义(P0.05)。与模型组相比,nesfatin-1组中红色的脂质颗粒减少,TC、CE和CER水平降低,LOX-1表达下调,ABCG1和p-AMPK/AMPK水平上调,差异均有统计学意义(P0.05);而CD36和ABCA1表达变化不大,差异无统计学意义(P0.05)。结论在ox-LDL诱导的泡沫细胞中nesfatin-1表达下调,nesfatin-1重组蛋白可抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化,这极可能是通过激活AMPK通路,进而下调LOX-1表达,上调ABCG1表达发挥作用的。     

小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达

目的: 构建小鼠胞内病原体抗性基因1(Ipr1)基因与EGFP基因融合表达载体, 观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达.方法: 从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA, 以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列, 克隆至pEGFP-C1载体中, 筛选阳性克隆作PCR、酶切及测序鉴定后得到pEGFP-Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7, 以空质粒pEGFP-C1转染组作为对照.采用RT-PCR法检测Ipr1的RNA水平表达及用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位.结果: 扩增出小鼠Ipr1基因编码序列, 经PCR、酶切及测序鉴定证明得到正确的重组质粒pEGFP-Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达, Ipr1基因表达产物定位于细胞核内.结论: 成功地调取小鼠Ipr1基因, 构建了小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体并在小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达.Ipr1编码蛋白定位于细胞核内, 提示其是一种调节蛋白.     

槲皮素对ox-LDL所致的小鼠巨噬细胞脂质蓄积和过氧化的影响

 目的：研究槲皮素(quercetin,QUE)预处理对氧化低密度脂蛋白 (oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)所致小鼠巨噬细胞脂质蓄积和过氧化的影响,并探讨可能的分子机制。方法：体外培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,给予20、40和80 μmol/L QUE预处理30 min,再加入ox-LDL (100 mg/L)继续培养24 h。采用油红O染色检测细胞内脂质蓄积,测定培养液乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,以评价细胞膜完整性和脂质过氧化程度。分别采用real-time PCR和免疫印迹技术检测清道夫受体CD36 mRNA和蛋白表达变化。结果：QUE (20,40和80 μmol/L)预处理显著抑制ox-LDL所诱导的巨噬细胞内脂质蓄积和泡沫细胞形成,且呈浓度依赖性。ox-LDL组细胞LDH释放增加,而QUE预处理则显著抑制ox-LDL的上述细胞毒性。与ox-LDL组比较,QUE预处理组细胞内ROS含量和培养液中MDA水平明显降低。另外QUE预处理在mRNA和蛋白水平均明显抑制ox-LDL所诱导的CD36表达上调。结论: QUE可减轻ox-LDL所诱导的小鼠巨噬细胞脂质蓄积和过氧化,其机制可能部分是通过下调CD36表达实现的。     

葛根素对RAW264.7源性泡沫细胞胆固醇摄取及外排功能的影响

目的:探讨葛根素(puerarin,Pur)对RAW264.7源性泡沫细胞胆固醇摄取及外排功能的影响。方法:以氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导RAW264.7源性泡沫细胞。细胞经处理后,利用荧光探针Di I-ox-LDL检测泡沫细胞摄取ox-LDL的能力,NBD标记胆固醇外排实验检测泡沫细胞的胆固醇外排功能,Western blot法检测LC3II、P62、CD36、ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、溶酶体酸性脂肪酶(lysosomal acid lipase,LAL)以及p-AMPK的蛋白水平。结果:RAW264.7源性泡沫细胞经Pur处理后胆固醇摄取减少、胞内胆固醇外排增加并且自噬相关蛋白LC3II表达增加,P62表达减少,脂质吸收相关蛋白CD36表达减少,胆固醇外排相关蛋白ABCA1和LAL表达增加,其变化与自噬激动剂雷帕霉素处理后改变类似。Pur与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤共处理后,胆固醇摄取增加、胆固醇外排功能减弱,并且ABCA1、LAL和p-AMPK的蛋白水平减少,但CD36表达未有明显改变。结论:Pur可使得泡沫细胞LAL和ABCA1介导的胆固醇外排能力有所增强,其机制可能是通过AMPK通路增强自噬对胆固醇外排的调控;又可通过对CD36负向调节而使得泡沫细胞对脂质的摄取减少。     

小鼠ACADL对巨噬细胞表达炎症因子的影响

目的探讨长链酰基辅酶A脱氢酶(Acyl-CoA dehydrogenase,long chain,ACADL)对巨噬细胞分泌炎症因子的影响。方法在体外诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞中加入脂多糖(LPS)以及白细胞介素4(IL-4)分别诱导M1和M2极化,在极化0、12、24、36、48 h时用Western blot检测ACADL在M1和M2极化中的蛋白表达量。构建ACADL-pEGFP-N1质粒,使用G418筛选和鉴定过表达ACADL的RAW264.7细胞稳定株。LPS刺激过表达ACADL稳定株和对照组细胞4 h后,通过ELISA和qRTPCR检测TNF-α、IL-6、IL-10的表达情况。在RAW264.7细胞中加入beta氧化抑制因子etomoxir预处理,ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-10的表达情况。结果在巨噬细胞极化过程中ACADL蛋白量先减少再增加;过表达ACADL的细胞中,IL-6和IL-10分泌量及mRNA水平均显著高于对照组(P0.001):beta氧化抑制因子etomoxir能够减少RAW264.7细胞分泌炎症因子。结论 ACADL能增强巨噬细胞IL-6和IL-10的分泌,其作用机制可能是通过beta氧化影响炎性细胞因子的表达。     

微弧氧化镁合金对巨噬细胞肿瘤坏死因子和白细胞介素6的影响

背景：微弧氧化处理可提高镁合金的抗腐蚀性能,延缓其降解速率。 目的：观察微弧氧化处理镁合金对小鼠巨噬细胞肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的影响。 方法：在小鼠RAW264.7细胞中分别加入镁合金浸提液(对照组)、微弧氧化处理镁合金浸提液(实验组)及RPMI-1640(空白对照组),1 h后加入脂多糖,作用24 h后,收集细胞上清液,检测肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平,MTT法测定脂多糖刺激前后的RAW264.7细胞活性。 结果与结论：①脂多糖刺激前的RAW264.7细胞活性：对照组>实验组>空白对照组(P均< 0.05)。②脂多糖刺激后的RAW264.7细胞活性：实验组与对照组高于刺激前,但差异无显著性意义;空白对照组明显高于刺激前(P < 0.01)。3组间RAW264.7细胞活性差异无显著性意义(P > 0.05)。③脂多糖刺激后RAW264.7细胞白细胞介素6与肿瘤坏死因子α的表达量：对照组白细胞介素6表达量明显高于实验组和空白对照组(P < 0.05);3组肿瘤坏死因子α表达量两两之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。表明微弧氧化处理镁合金对小鼠巨噬细胞活性无明显影响,同时降低了炎性反应。     

siRNA沉默mfn2表达对睾酮抑制大鼠血管平滑肌源性泡沫细胞形成的影响

目的研究线粒体融合素2基因(mfn2)在睾酮抑制大鼠血管平滑肌源性泡沫细胞形成过程中的作用。方法设计并化学合成靶向mfn2基因的小分子干扰RNA(siRNA),脂质体法将mfn2-siRNA转染大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs),实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测mfn2 mRNA及蛋白的表达。培养大鼠VSMCs,利用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导形成泡沫细胞。实验分组:1)对照组;2)睾酮组;3)睾酮+阴性对照siRNA组;4)睾酮+mfn2-siRNA组。后3组预先加入睾酮和(或)siRNA预处理12 h,再与ox-LDL共培养48 h。油红O染色及酶荧光法检测细胞内脂质含量,免疫印迹法检测细胞内Mfn2、清道夫受体CD36和ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)的表达。结果转染mfn2-siRNA后12、24、36和48 h均能有效沉默mfn2 mRNA和蛋白的表达(P0.05)。与对照组比较,睾酮组及睾酮+阴性对照siRNA组脂质蓄积减少,总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯的含量均降低(P0.05),Mfn2和ABCA1表达增加(P0.05),CD36表达降低(P0.05),细胞泡沫化受到抑制。与睾酮+阴性对照siRNA组比较,睾酮+mfn2-siRNA组脂质蓄积增加,总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯的含量均增加(P0.05),Mfn2和ABCA1表达降低(P0.05),CD36表达增加(P0.05)。结论睾酮通过调节mfn2及其下游CD36和ABCA1表达,抑制ox-LDL诱导下VSMCs转变为泡沫细胞。     

Adipophilin通过PI3K/Akt通路促进细胞内脂质蓄积

目的:探讨adipophilin促进细胞内脂质蓄积的可能机制,为动脉粥样硬化的防治提供参考。方法:分别通过q PCR、Western blot和油红O染色观察氧化型低密度脂蛋白(ox LDL)处理RAW264.7细胞不同时间后,细胞内Akt、p-Akt和adipophilin的蛋白水平及脂质蓄积情况;并检测PI3K/Akt抑制剂LY294002处理后,上述指标的变化;HEK293细胞过表达adipophilin后,检测Akt的活性;并用免疫共沉淀实验检测adipophilin与Akt之间的相互作用。结果:ox LDL处理细胞后,随着时间的延长,脂滴增多,Akt被活化,adipophilin表达增加,而LY294002处理则可抑制上述变化;过表达adipophilin后,p-Akt水平增高,但adipophilin与Akt之间未见直接相互作用。结论:Adipophilin可通过PI3K/Akt途径促进细胞内脂质蓄积,但可能不是通过直接相互关系发挥作用的。     

稳定敲除Mcart-1下调RAW264.7巨噬细胞增殖能力和氧化磷酸化水平

目的 基于CRISPR/Cas9原理构建Mcart-1稳定敲除的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株RAW264.7,检测其细胞增殖能力和能量代谢水平。方法 用Cas9慢病毒和sgRNA慢病毒分两步感染RAW264.7巨噬细胞，并挑选单克隆细胞：qPCR和Western blot检测Cas9表达水平和Mcart-1敲除效果；单细胞测序分析突变位点；细胞能量代谢分析仪Seahorse检测细胞耗氧速率(OCR)和能量代谢表型；试剂盒测定细胞内总ATP含量；细胞计数仪计数和羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色检测细胞增殖。结果 成功构建Mcart-1稳定敲除的RAW264.7细胞株(记为Mcart-1^-/--RAW264.7);该细胞株中Mcart-1发生移码突变；与野生型RAW264.7细胞系(记为RAW264.7)相比，Mcart-1^-/--RAW264.7细胞氧气消耗速率(OCR)下降，胞外酸化速率(ECAR)升高；与RAW264.7细胞相比，Mcart-1^-/--RAW264.7细胞内总ATP含量下降(P<0....