Ag85B核酸疫苗的免疫原性和保护性研究

扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴度达到 1:10 2 4 0 0 ,(γ -干扰素测定表明 ,免疫动物的干扰素含量达到 116 0 3± 10 4 pg /ml。实验结果说明Ag85B核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答。三次免疫后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数比对照空载体组分别减少了 1 5和 15倍以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。     

结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定

目的　对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT - 6 4基因进行克隆 ,鉴定与表达 ,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法　以结核杆菌H3 7Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对基因MPT - 6 4进行扩增 ,产物与载体质粒pGEX - 4T - 1构建表达MPT - 6 4的重组质粒 ,将此重组质粒先转化到E coliDH5α内抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主E coliBL2 1(DE3)PLysS菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS -PAGE ,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫染色 ,一抗为结核分枝杆菌菌株H37Rv羊抗阳性血清。结果　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,所表达的蛋白质相对分子质量为 5 0 0 0 0 ,抗体检测有特异带大小为 5 0kDa。结论　目的基因克隆到菌株内 ,重组结核杆菌分泌蛋白MPT - 6 4的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础     

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果　 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论　成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法 通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果 重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。结论 成功地表达和纯化了结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白。该重组蛋白具有特异的免疫原性。     

汉坦病毒包膜糖蛋白G1、G2基因的DNA免疫

目的　将编码汉坦病毒浙 37(Z37)株包膜糖蛋白G1、G2的真核表达质粒免疫小鼠 ,观察其能否诱导体液免疫应答。方法　重组质粒 pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2以不同方式免疫BALB/C小鼠 ,用免疫荧光测定 (IFA)法检测血特异性抗体 ,用半微量直接免疫酶斑减少中和试验检测血中和抗体。经肌内注射途径免疫 15只BALB/C小鼠 ,3组小鼠分别注射 10 0 μgpcDNA3.1、pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2 ;每只小鼠免疫 3次 ,初次免疫后 4周 ,加强 2次 ,间隔 3周。经基因枪免疫 9只BALB/C小鼠 ,3组小鼠分别注射 1.5 μgpcDNA3.1、pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2 ;每只小鼠免疫 2次 ,初次免疫后 4周 ,加强 1次。结果　 1.经肌内注射免疫时 ,产生特异性抗体的小鼠个数分别是 :pcDNA3.1 G1组为 5只中 3只 ,pcDNA3.1 G2组为 5只中 2只 ;荧光抗体滴度 1∶2 0～ 1∶80 ;产生中和抗体的小鼠个数分别是 :pcDNA3.1 G1组为 5只中 1只 ,pcDNA3.1 G2组为 5只中 2只 ;中和抗体滴度 1∶10～ 1∶2 0。 2 .经基因枪免疫时 ,实验组小鼠都产生了特异性抗体和中和抗体。荧光抗体滴度 1∶2 0～ 1∶32 0 ,中和抗体滴度≥ 1∶10。结论　重组质粒 pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2能诱导小鼠产生有效的体液免疫应答     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的　构建结核分枝杆菌早期分泌蛋白Ag85B和MPT6 4融合基因 (AM )及其原核表达质粒并进行表达。方法　采用 geneSOEing法将ag85b和mpt6 4用疏水甘氨酸接头 (Gly4Ser) 3 融合 ,经限制性内切酶切后克隆入原核表达载体pET32a中 ,进行酶切、PCR鉴定和DNA序列测定。将重组质粒转染Ecoli BL2 1,经过IPTG诱导后其表达产物进行SDS -PAGE和免疫印迹分析。结果　AM融合基因定向克隆入 pET32a中 ,双向测序验证碱基突变率为 0 11% (2 / 170 7) ,均为无意义突变。SDS -PAGE和免疫印迹分析结果均显示在约 73kDa的位置可见明显的蛋白条带。结论　成功地构建了ag85b -mpt6 4融合基因及其原核表达质粒 ,重组质粒能够在大肠杆菌在中表达。     

结核分枝杆菌ESAT6、CFP10基因DNA疫苗对小鼠免疫原性的初步研究

目的 研究ESAT6、CFP10基因DNA疫苗分别与卡介苗联合免疫小鼠,以诱导免疫效果.方法 以构建的真核表达载体pEGFP-N1ESAT6、pEGFP-N1-CFP10与卡介苗共同免疫随机分成8组的80只小鼠,分别标记为：生理盐水组（SLYS）、卡介苗组（KJM）、pEGFP N1组（P-N1）、pEGFP-N1 ESAT6组（P-N1-E）、pEGFP N1-CFP10组（P-N1-C）、卡介苗加pEGFP-N1组（K＋P-N1）、卡介苗加pEGFP-N1-ESAT6组（K＋P-N1-E）和卡介苗加pEGFP-N1 CFP10组（K＋P-N1-C）.每只小鼠皮内注射100μL卡介苗,每只小鼠肌肉注射50μg质粒,每组共注射3次.以纯化的ESAT6、CFP10蛋白作为抗原,用DOT ELISA方法检测小鼠血清中的抗体;用ELISA方法检测小鼠血清中IFN-γ的变化.结果 免疫3次后的小鼠血清中检测到针对CFP10蛋白的抗体,未检测到针对ESAT6蛋白的抗体.但二者血清中IFNγ水平都有显著上升,K＋P N1-C和K＋P-N1-E免疫3次后,测得的IFN-γ平均含量为（107.591±7.3281）pg/mL和（95.7503±9.0184） pg/mL,显著高于免前、一免、二免（P＜0.01）.结论 结核分枝杆菌ESAT6,CFP10基因DNA疫苗和卡介苗联合应用后可诱导小鼠产生有效的细胞免疫应答,为DNA疫苗的研究奠定一定的基础.     

表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的基因疫苗的免疫学特性

目的测定表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的两种重组质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法50只BALB/c小鼠随机分为5组(每组10只),将表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的两种重组质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF分别免疫小鼠3次,每次间隔2周,同时设卡介苗(BCG)免疫组、空载体质粒免疫组和生理盐水对照组。最后一次免疫结束后,每组取5只小鼠血清,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测特异性抗体的滴度,并分离小鼠的脾淋巴细胞,并在体外用结核分枝杆菌(MTB)培养滤液蛋白(cu lture filtrate prote in,CFP)刺激,测定脾淋巴细胞增殖指数和γ干扰素(IFN-γ)水平。用1 m l含1×105克隆形成单位(CFU)的MTB毒株H37Rv经尾静脉感染其余每组5只BALB/c小鼠,4周后计数脾脏细菌负荷数。结果质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF免疫小鼠血清的特异性抗体滴度分别为1∶1 000和1∶1 500。其脾淋巴细胞刺激指数分别为2.2和2.4,而生理盐水对照组和空载体质粒免疫组的刺激指数只有0.9和1.1;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFN-γ分别为(5.48±0.38)ng/m l和(5.76±0.51)ng/m l,显著高于生理盐水对照组和空载体质粒免疫组(P<0.05),但与BCG免疫组的(5.55±0.31)ng/m l比较差异无统计学意义。结核毒株攻击后,与空载体质粒免疫组相比,质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF免疫的BALB/c小鼠其抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,3组脾脏细菌负荷对数值(lg,CFU/g)分别为6.08±0.25、4.63±0.11、4.50±0.32,但不及BCG免疫组的4.09±0.27。结论表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的基因疫苗在小鼠体内诱导的IFN-γ水平与BCG相当,其保护力有待进一步提高。     

人激肽释放酶重组腺相关病毒对人脐静脉内皮细胞的影响

目的:构建携带人激肽释放酶(kallikrein,KK)基因的重组腺相关病毒载体,并导入体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),观察其对缓激肽(BK)、一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)水平和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达的影响。方法:(1)将KK基因定向克隆入腺相关病毒载体质粒pAAV-MCS中,构建成pAAV-KK;(2)分别将pAAV-KK及pAAV-LacZ与另外两种质粒pHelper、pAAV-RC通过脂质体共同转染AAV-293细胞,包装出rAAV-KK和rAAV-LacZ重组腺相关病毒。将rAAV-LacZ原液稀释成不同浓度梯度并感染HT-1080细胞,通过β-半乳糖苷酶染色测定病毒感染滴度,并观察LacZ传代HT-1080细胞的表达情况;(3)将rAAV-KK感染HUVEC,检测其对缓激肽、NO、ET-1水平和eNOS基因表达的影响。结果:(1)成功构建了带有KK目的基因的重组腺相关病毒载体和带有LacZ报告基因的重组腺相关病毒载体(对照载体);(2)rAAV-LacZ重组病毒以感染滴度6.2×107I U/ml感染HT-1080细胞后,LacZ基因能够在连续传代的HT-1080细胞内稳定持续表达;(3)与空白组、LacZ组(对照组)相比,KK感染组的HUVEC细胞培养液中BK[(2.864±1.36)pmol/ml∶(2.782±1.48)pmol/ml∶(6.576±2.08)pmol/ml]、NO[(16.42±1.02)μmol/L∶(16.46±1.25)μmol/L∶(21.28±1.46)μmol/L]水平明显增加,eNOS基因[(0.353±0.031)∶(0.364±0.049)∶(0.423±0.038)]表达明显增强,ET-1[(262.91±17.85)pg/ml∶(263.56±15.87)pg/ml∶(199.48±16.99)pg/ml]水平显著下降(P均0.01)。结论:(1)成功构建了携带有人激肽释放酶基因的重组腺相关病毒,rAAV-KK感染体外培养的人脐静脉内皮细胞;(2)可使细胞分泌BK、NO,以及表达eNOS基因增加,ET-1减少,改善内皮细胞功能。     

日本血吸虫裸露DNA疫苗pCDSj32免疫小鼠血清抗体的动态及免疫血清介导巨噬细胞杀伤童虫ADCC效应的体外观察

为了进一步探讨 p CDSj32诱发小鼠抗血吸虫感染的保护免疫机制 ,分别用 10 0 μg和 30 0 μg p CDSj32质粒免疫小鼠 ,观察血清 Ig G抗体滴度的动态变化。结果显示 ,单剂量免疫后 4wk,血清 Ig G滴度可达 1∶ 32 0以上 ,以后血清抗体滴度均维持在 1∶ 6 40～ 12 80 ,最少可持续 2 4wk。末次取血清后 ,用日本血吸虫尾蚴攻击感染后 7d,测定血清抗体滴度可骤升至 1∶ 2 5 6 0以上。抗体依赖细胞介导的细胞毒试验表明 ,10 0 μg p CDSj32质粒免疫后 4wk及 8wk血清可介导小鼠腹腔巨噬细胞产生很强的体外杀伤日本血吸虫童虫作用     

Antibody response to four secretory proteins from Mycobacterium tuberculosis and their complex antigen in TB patients.

OBJECTIVE: To evaluate antibody responses to a panel of four protein antigens secreted from Mycobacterium tuberculosis, CFP-21, ESAT-6, MPT-63 and MPT-64, and their complex antigen. DESIGN: Seventy-eight samples of serum and cerebral spinal fluid were tested by ELISA. RESULTS: Serum IgM antibody positive rates of protein antigens CFP-21, ESAT-6, MPT-63 and MPT-64 and their multi-antigen complex were respectively 34.6%, 60.3%, 52.6%, 78.2% and 96.2%; IgG antibody positive rates were respectively 46.2%, 64.1%, 93.6%, 57.7% and 84.6%. The specificity of the antibodies to the four proteins secreted from M. tuberculosis and its mixture antigen was 100%; sensitivity to the multi-antigen complex was higher than for the four single antigens. Among the IgM positive rates, the differences between the multi-antigen complex and CFP-21, ESAT-6, MPT-63 and MPT-64 were significant (P < 0.01); among the IgG positive rates, the differences between the multi-antigen complex and CFP-21, ESAT-6 and MPT-64 were significant (P < 0.01). Although the IgG positive rate for MPT-63 was higher than for the multi-antigen complex, the difference was not significantly different (P > 0.05). CONCLUSION: These findings indicate that the multi-antigen complex composed of CFP-21, ESAT-6, MPT-63 and MPT-64 may be useful in the diagnosis of TB.     

结核复合抗原疫苗不同抗原组合对小鼠免疫功能的影响

目的 探讨在辅以卡介苗非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列(CpG)佐剂和铝佐剂的情况下,结核病复合抗原疫苗中抗原85b(Ag85b)、融合蛋白早期滤液蛋白10(CFP-10)和相对分子质量为6000的早期分泌抗原靶蛋白(ESAT-6)及热休克蛋白X(HspX)不同组合对小鼠免疫功能的影响.方法 将48只BALB/c小鼠按抗原组合分为8组:(1)A组:Ag85b+CFP-10/ESAT-6+HspX+佐剂,(2)B组:CFP-10/ESAT-6+HspX+佐剂,(3)C组:Ag85b+HspX+佐剂,(4)D组:Ag85b+CFP-10/ESAT-6+佐剂,(5)E组:Ag85b+佐剂,(6)F组:CFP-10/ESAT-6+佐剂,(7)G组:HspX+佐剂,(8)对照组:生理盐水.每组6只,皮下免疫,共免疫3次,间隔2周,末次免疫后1周处死小鼠.酶联免疫斑点实验和淋巴细胞增殖实验检测小鼠脾淋巴细胞分泌γ-干扰素和白细胞介素-4及抗原特异性淋巴细胞增殖情况.酶联免疫吸附实验检测小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度.结果 E组γ-干扰素的斑点数[中位数(四分位间距),122.8个(78.4～184.4个)]明显高于C组和对照组[14.3个(6.5～14.6个)和0.5个(0.5～1.3个)],差异均有统计学意义(u值均为0.0,均P＜0.01);D组白细胞介素-4的斑点数[173.5个(7 8.8～233.4个)和132.8个(50.3～159.4个)]明显多于对照组[0.5个(0.5～1.3个)和5.3个(2.9～6.5个)],差异有统计学意义(u值均为0.0,均P＜0.01);A、C、D和E组的刺激指数(2.42±0.50、2.18±0.37、2.86±0.51和2.70±0.15)明显高于对照组(1.11±0.13),差异有统计学意义(F值为20.96,均P＜0.01);HspX激发的抗原特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体稀释倍数对数值(3.90～5.21)均明显高于Ag85b(3.30～4.51)和CFP-10/ESAT-6蛋白(3.10～4.05),差异均有统计学意义(F值为43.8～70.4,均P＜0.01).结论 在辅以佐剂的情况下,不同抗原组合对小鼠免疫功能的影响有差别,3种抗原同时免疫并未获得最好的免疫效果,提示抗原间的相互作用可能对免疫效果产生影响.

Abstract：

Objective To study the immune function of mice immunized by different combinations of antigen 85b ( Ag85b), fusion protein culture filtered protein 10 ( CFP-10), early secreted antigenic target 6 kDa protein (ESAT-6) and heat shock protein X (Hsp X) with combined adjuvants of Bacille CalmetteGuerin (BCG) CpG and aluminum.Methods According to antigen combinations, 48 BALB/c mice were divided into 8 groups: ( 1 ) group A: Ag85b + CFP-10/ESAT-6 + HspX + adjuvant; (2) group B: CFP-10/ESAT-6 + HspX + adjuvant; ( 3 ) group C: Ag85b + HspX + adjuvant; (4) group D: Ag85b + CFP-10/ESAT-6 + adjuvant; (5) group E: Ag85b + adjuvant; (6) group F: CFP-10/ESAT-6 +adjuvant; (7)group G: HspX + adjuvants; (8) control group: saline (6 mice per group).The mice were subcutaneously immunized 3 times.One week after the third subcutaneous immunization, spleens were collected for enzymelinked immunospot (ELISPOT) assay to detect IFN-γ and IL-4 secretion, and for the lymphocyte proliferation assay to observe antigen-specific lymphocyte proliferation.Serum samples were separated for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect the titers of antigen-specific IgG, IgG1 and IgG2a antibodies.Results The amount of IFN-γ spots in Group E [median ( quartile), 122.8 (78.4 - 184.4 )]was significantly more than that in group C [14.3 (6.5 - 14.6)] and the control group [0.5 (0.5 - 1.3)](u =0.0, P ＜ 0.01 ).The amount of IL-4 spots in Group D stimulated with Ag85b and CFP-10/ESAT-6 [173.5 (78.8 -233.4), 132.8 ( 50.3 - 159.4)] were significantly more than those in the control group [0.5 (0.5 - 1.3 ), 5.3 ( 2.9 - 6.5 )] ( u = 0.0, P ＜ 0.01 ).The level of stimulation index of lymphocyte proliferation in Group A, C, D, E(2.42 ±0.50, 2.18 ±0.37, 2.86 ±0.51, 2.70 ±0.15) was significantly higher than that of the control group ( 1.11 ± 0.13 ) ( F= 20.96, P ＜ 0.01 ).The level of antigen-specific IgG, IgG1 , IgG2a antibody titers induced by Hsp X [lg( antibody dilution degree), 3.90 -5.21] was significantly higher than those induced by Ag85b (3.30-4.51 ) and CFP-10/ESAT-6 (3.10 -4.05) ( F = 63.8 - 70.4, P ＜ 0.01 ) .Conclusions With the use of adjuvants, different antigen combinations showed different influences on the immune function in mice.A combination of 3 antigens did not elicit the best immune effect, suggesting that the interaction among antigens may affect their immunity.     

不同剂量结核病DNA疫苗的电转染免疫原性研究

目的 研究不同剂量结核病DNA疫苗电转染后的免疫原性.方法 40只BALB/c小鼠通过随机数字表法分为8组,每组5只.其中4组分别用100 μl生理盐水和10 μg、50 μg、100 μg结核分枝杆菌Ag85A DNA肌内注射免疫小鼠;另4组用100 μl生理盐水和10 μg、50 μg、100 μgAg85ADNA肌内注射加电转染免疫小鼠.每2周免疫1次,共3次.最后1次免疫后2周杀死小鼠.用ELISA方法检测小鼠脾细胞培养上清液中γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（interleukin 4,IL-4）水平;用流式细胞术检测小鼠外周血单个核细胞（PBMC）分泌IFN-γ的辅助性T细胞（helper T cell,Th）1细胞百分比、分泌IL-4的Th2细胞百分比,以及Th1与Th2的细胞比值.用SAS 9.2软件处理数据,实验数据以“-x±s”表示,对有关数据进行两因素析因设计的方差分析,两两比较采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 免疫结束后2周,小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平,50 μg[（646.05±342.53） pg/ml]和100 μgAg85ADNA肌内注射组[（738.61±372.68） pg/ml]显著高于生理盐水组[（1.73±3.88）pg/ml]（f值分别为4.065、4.647,P值均＜0.05）和10 μg Ag85A DNA组[（87.83±120.82）pg/ml]（t值分别为3.513、4.094,P值均＜0.05）;10 μg Ag85A DNA电转染组[（357.06±105.18） pg/ml]显著高于生理盐水组（t=2.247,P＜0.05）,高于100 μg Ag85ADNA电转染组[（86.08±135.73） pg/ml],但差异无统计学意义（t=1.706,P＞0.05）;50 μg Ag85ADNA电转染组[（648.60±439.41）pg/ml]显著高于生理盐水组（t=4.081,P＜0.05）和100 μg Ag85A DNA电转染组（t=3.539,P＜0.05）.与直接肌内注射组IFN-γ水平[（87.83±120.82） pg/ml]比较,10 μg Ag85A DNA电转染组增高3倍[（357.06 pg/ml）/（87.83 pg/ml）]; 50 μg Ag85A DNA肌内注射组[（646.05±342.53） pg/ml]与电转染组[（648.60±439.41）pg/ml]比较,差异无统计学意义（t=-0.016,P＞0.05）;100 μg Ag85A DNA电转染组[（86.08±135.73）pg/ml]较肌内注射组[（738.61±372.68） pg/ml]降低88.35％（t=4.105,P＜0.05）.小鼠PBMC分泌IFN-γ的Th1细胞百分比,不同剂量Ag85A DNA肌内注射组[10 μg Ag85A DNA：（1.39±0.84）％;50 μg Ag85A DNA：（1.55±0.33）％;100 μg Ag85A DNA：（2.13±0.47）％]和DNA电转染组[10 μg Ag85A DNA：（1.42±0.47）％; 50 μg Ag85A DNA：（1.88±0.51）％; 100 μg Ag85ADNA：（1.43±0.68）％]均高于生理盐水组[（0.65±0.31）％]（t值分别为2.002、2.431、4.015、2.084、3.332和2.105,P值均＜0.05）,但不同剂量Ag85A DNA电转染组与肌内注射组之间差异均无统计学意义（t值分别为0.081、0.901和-1.91,P值均＞0.05）.小鼠PBMC分泌IL-4的Th2细胞百分比,不同剂量Ag85A DNA肌内注射组[10 μg Ag85A DNA：（1.42±1.18）％; 50 μg Ag85A DNA：（1.14±0.78）％; 100 μg Ag85A DNA：（1.24±0.76）％]和DNA电转染组[10 μg Ag85A DNA：（1.19±1.09）％; 50 μg Ag85A DNA：（2.06±0.96）％;100 μgAg85A DNA：（1.47±0.65）％]均显著低于生理盐水电转染组[（4.14±2.55）％]（t值分别为-3.392、-3.738、-3.616、-3.676、-2.599和-3.325,P值均＜0.05）,但不同剂量DNA肌内注射组与DNA电转染组之间差异无统计学意义（t值分别为0.284、-1.139和-0.292,P值均＞0.05）.结论 DNA电转染免疫可以增强低剂量DNA疫苗的免疫应答,使用少量的DNA疫苗就可以产生较好的免疫效果.     

中试生产的结核DNA疫苗免疫效能研究

目的 以300 L发酵罐中试规模生产的冻干Mtb Ag85A质粒DNA疫苗为基础免疫小鼠,对该疫苗的免疫效能进行研究。 方法 将4~6周龄的BALB/c小鼠20只通过数字表法随机分为2组,一组免疫Mtb Ag85A质粒DNA疫苗（结核DNA疫苗免疫组）,另一组免疫PBS作为阴性对照（PBS对照组）;于免疫前采血,肌内注射免疫3次。在第3次免疫后3周摘眼球处死小鼠,收集血清,进行血清特异性抗体检测和细胞因子(IFN-γ、IL-4)检测;同时对每只小鼠取脾细胞进行特异性γ干扰素 (IFN-γ) 分泌检测和脾细胞CD4⁺、CD8⁺百分率检测。 结果 （1）免疫前后免疫组与对照组抗体水平吸光度A值均小于0.2。（2）结核DNA疫苗免疫组血清细胞因子IL-4水平［（146.2±34.3）pg/ml］低于PBS对照组［（177.7±28.1）pg/ml］,差异有统计学意义（t=2.244,P=0.038）,而IFN-γ水平［（129.6±159.0）pg/ml］虽然高于PBS对照组［（76.5±21.5）pg/ml］,但差异无统计学意义（t=－1.047,P=0.309）。（3）酶联免疫斑点检测结果表明结核DNA疫苗免疫组脾细胞特异性IFN-γ分泌水平（分泌IFN-γ细胞个数）（103.60±112.14）高于PBS对照组（5.78±5.83）,差异有统计学意义（t=36.538,P=0.018）。（4）结核DNA疫苗免疫组CD4⁺细胞百分率均值（21.57%）高于PBS对照组（12.17%）,差异有统计学意义（t=3.043,P=0.038）;CD8⁺细胞百分率均值（13.70%）与PBS对照组（10.57%）相比,差异无统计学意义（t=0.847,P=0.445）。 结论 Mtb Ag85A质粒DNA疫苗主要刺激机体Th1型细胞免疫,而对诱导机体产生Th2型细胞免疫应答没有显著的促进作用。     

DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病的研究

目的研究结核分枝杆菌DNA 疫苗治疗小鼠耐多药结核病的效果。方法用结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼临床分离株HB361尾静脉注射60只雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为6组,感染后第3d开始,分别用生理盐水（A组）、pVAX1载体（B组）、利福平（C组）、HSP65 DNA疫苗（D组）、Ag85A DNA 疫苗（E组）、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗（F组）治疗60d,DNA疫苗每隔15d肌肉注射1次,共5次。治疗结束后3周,分别取肺和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数。结果治疗结束后3周,与对照组比较,D组、E组和F组肺脏病变有不同程度减轻,病变局限,2/3区域可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰,细胞分布均匀。与A组相比,D组、E组和F组肺脏菌落数分别减少了0.34、0.50 和0.26 logs;脾脏菌落数依次减少了0.37、0.46 和0.28 logs（P<0.05,P<0.01）。结论Ag85A DNA 疫苗治疗小鼠耐多药结核病效果优于HSP65 DNA和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗。     

Cellular responses to MPT-51, GlcB and ESAT-6 among MDR-TB and active tuberculosis patients in Brazil

Multi-drug resistant pulmonary tuberculosis (MDR-TB) may result from either insufficiency of the host cellular immune response or mycobacterial mechanisms of resistance. Mycobacterium tuberculosis-specific CD8+ and CD4+ T lymphocytes from MDR-TB patients are poorly studied. The aim of this study was to evaluate CD4+IFN-gamma+, CD4+IL-10+, CD8(+)IFN-gamma+ and CD8+IL-10+ cell populations by flow cytometry in non-resistant TB and multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB) patients from mid-central Brazil after stimulation with MPT-51, GlcB and ESAT-6 recombinant antigens from M. tuberculosis in comparison to tuberculin skin test negative (TST) healthy individuals. Non-resistant TB patients present specific cellular responses (CD4 and CD8, both IFN-gamma and IL-10) to GlcB, MPT-51 and ESAT-6; while MDR-TB patients present only CD8+IFN-gamma+ responses to ESAT-6 and CD8+IL-10+ responses to GlcB and ESAT-6. The results show that MDR-TB patients present impaired specific CD4 IFN-gamma and IL-10 responses and increased/normal specific CD8 IFN-gamma and IL-10 responses. This suggests an important role for CD8 function in these patients.     

结核分支杆菌Ag85 B分泌蛋白基因疫苗的构建和免疫原性的研究

目的：构建编码结核分支杆菌（MTB）Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,并研究其免疫原性。方法：采用聚合酶链反应（PCR）方法从结构分支杆菌H37Ra基因组DNA中扩增出Ag85B分泌蛋白基因,用HindⅢ和EcoRⅠ消化后,与同样酶消化的pcDNA3连接,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆用酶切鉴定;重组表达质粒肌注免疫小鼠4周后,分别用dot blotting和ELISA方法检测抗体的产生和滴度,结果：酶切监定重组表达质粒pTB30s构建成功,dot blotting检测免疫小鼠血清抗Ag85B特异性抗体阳性,ELISA检测抗体几何平均滴度为1：120。结论：应进一步研究pTB30s刺激机体的细胞免疫应答,以用于结核病（TB）的防治研究。