CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的序列分析与原核表达

目的对肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶（EsBk）进行基因克隆和重组表达，探讨其特性。方法以产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌49号菌总基因组DNA为模板，PCR扩增CTX-M-3，将其克隆入pGEM-T载体后测定该核苷酸序列，再将CTX-M-3基因克隆到pBV220／DH5α系统进行重组，重组菌经42℃热诱导，SDS-PAGE电泳鉴定酶蛋白的表达。结果PCR扩增出大小为876bp的基因片段，与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100％。大肠杆菌DH5α转化pBV220／CTX-M-3重组质粒后，ESBLs试验为阳性，药敏试验结果与原菌株相比耐药性下降。此基因能在大肠埃希菌中大量表达，SDS-PAGE电泳显示，蛋白分子质量大约为31KD。结论成功表达重组的CTX-M-3型酶，为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定基础。     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶原核表达条件的研究

目的 探讨重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3分别在大肠埃希菌ER2566和BL21(DE3)中进行原核表达的最佳条件.方法 分别在不同的宿主菌、诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度中诱导pET-28a(+)/CTX-M-3融合表达载体,目的 产物经SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件分析,以获得最佳表达条件.结果 表达载体的最佳诱导条件是重组质粒在BL21(DE3)中18℃诱导24 h,IPTG终浓度为0.8 mmol/L:表达载体在最佳条件下表达时,目的 蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的33%.结论 获得pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌中表达CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)蛋白的最佳条件,为此酶的大量纯化奠定了基础.     

大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌连续分离株β-内酰胺酶基因研究

目的了解大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌连续分离株β-内酰胺酶基因存在状况。方法采用PCR检测浙江地区二家医院大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌连续分离株21种β-内酰胺酶基因。结果检出TEM、SHV、LEN、CTX-M-1 cluster、CTX-M-9 cluster、OXA-1 cluster、OXA-10 cluster、LAP、DHA、ACT-1等β-内酰胺酶基因，并在国内外首次从大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌中发现LAPβ-内酰胺酶基因。结论浙江地区二家医院大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌连续分离株β-内酰胺酶基因携带率高。存在新的β-内酰胺酶基因（LAP）。     

下呼吸道产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌的耐药性基因型分析

目的:观察下呼吸道产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases,ESBLs)肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌耐药菌株耐药基因分型,并探讨耐药菌株的流行状况及发生耐药的机制。方法:按常规方法进行细菌分离、培养和菌种鉴定。采用微量液体稀释与K-B法,分别对常用抗生素和头孢哌酮/舒巴坦的耐药性进行检测。采用纸片法确证产超广谱β-内酰胺酶菌株,并应用PCR技术进一步扩增TEM型、SHV型β-内酰胺酶的基因型。结果:产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对AMP、AMP/SB、PIP、CF、CFZ、CRM、CPD、CAX、CAZ、CTX、CPE和AZT的耐药率高达90%以上。产ESBLs肺炎克雷伯菌中产TEM型、SHV型、TEM和SHV型β-内酰胺酶基因的百分率分别为26.92%、30.76%、7.69%,大肠埃希菌百分率分别为46.15%、5.12%、10.25%。结论:产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对多种不同种类抗生素耐药,且具有多重耐药的特点。产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌携带TEM或SHV型β-内酰胺酶基因,其中肺炎克雷伯菌以产SHV型β-内酰胺酶为主,大肠埃希菌则以产TEM型β-内酰胺酶为主。     

产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌基因型分析

目的 了解我院临床分离大肠埃希茼产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的发生率和基因型分布情况.方法 确证试验鉴别临床分离大肠埃希菌中产ESBLs株,PCR扩增CTX-M耐药基因,PCR.RFLP和DNA测序确定CTX-M基因型.结果 确证实验证明,88株大肠埃希菌中有57株ESBLs阳性,其中54株CTX-M基因扩增阳性.PCR-RFLP分析发现,10株携带CTX-M-1组基因,39株携带CTX-M-9组基因,另外5株同时携带CTX-M-1和CTX-M-9组基因.测序证实7株CTX-M-9组扩增产物均为CTX-M-14型,3株CTX-M-1组扩增产物均为CTX-M-3型.结论 大肠埃希菌中产CTX-M型ESBLs的检出率较高,其基因型以CTX-M-14和CTX-M-3型为主.     

产ESBLs与AmpC大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型分析

目的 了解产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)与AmoC酶大肠埃希菌(escherichia coli,ECO)和肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae,KPN)的基因型特征.方法 用表型确证试验从临床分离的74株ECO和KPN中筛选出16株产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)、4株产AmpC酶及25株产ESBLs AmpC菌株.应用多重聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),扩增菌株的TEM,SHV和CTX-M-G1型超广谱β-内酰胺酶基因和DHA-1,ACT-1型AmpC酶基因,并对PCR产物经凝胶电泳后进行初步的分析.结果 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌携带TEM,SHV,CTX-M-G1,DHA-1和ACT-1基因的检出率分别为54.2%,50.0%,62.5%,57.1%,35.7%;29.4%,52.9%,41.2%,66.7%,46.7%.相当一部分菌株同时携带2种或2种以上的基因型.结论 产ESBLs与AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为多重耐药菌株,存在多种耐药基因.应采取积极的措施防止产酶菌株的流行.     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶基因型研究

目的：分析临床大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中超广谱β-内酰胺酶的基因型分布以及产ESBLs细菌中头孢菌素酶的存在情况。方法：质粒接合实验分析耐药性转移，根据超广谱β-内酰胺酶和头孢菌素酶各种已知基因序列设计引物，进行聚合酶链反应分析，确定超广谱β-内酰胺酶的基因型分布以及头孢菌素酶基因。结果：80.4％的菌株质粒接合实验成功，66％的菌株为TEM基因型，14％的菌株为SHV基因型，10％的菌株为CTX-M型。2株菌同时存在AmpC酶。TEM阳性的大肠埃希菌RAPD带型呈多样性。结论：临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性可以发生转移，ESBLs以TEM基因型为主，部分菌株为SHV、CTX-M型。同一菌株内可以产生2种不同基因型的超广谱β-内酰胺酶。产ESBL菌株不是以细菌克隆播散为主。     

院内产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌感染临床用药分析

目的:调查分析院内产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌感染临床用药情况。方法:我院在2008年1月～2009年1月收治的126例医院内感染产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌病例,分析其耐药情况、感染情况及用药情况。结果:467株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌细菌中,产超广谱β-内酰阳性率为37.0%;其中大肠埃希菌阳性率为33.4%;肺炎克雷伯菌阳性率为45.1%。产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对大多青霉素类和头孢菌素类都有不同程度的耐药,但是对亚胺培南不耐药。涉及患者126例患者使用l～6种抗菌药物和(或)联合用药,联合用药最多为3联。使用频率最高为头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮等3代头孢菌素。结论:为了减少产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的出现,要合理应用抗生素,特别是第三代头孢菌素类,同时尽量减少院内易感因素,最大限度地减少产超广谱β-内酰胺酶耐药菌株的出现和传播。     

肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶的耐药表型和基因型研究

目的 检测临床分离的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的情况，了解产超广谱β-内酰胺酶临床分离菌的耐药特性，并探讨耐药性产生的基因背景。方法 通过对近两年（2004～2005）北京地区医院收集到的共295株大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌，进行产ESBEs菌株表型鉴定、PCR检测基因型、等电聚焦电泳鉴定等电点，并对这些菌株耐药的特性和基因型进行了探讨。结果 ESBLs的检出率为18．6％，其中大肠埃希菌的检出率为27．7％，肺炎克雷伯杆菌的检出率为8．57％。引起耐药的基因型主要为TEN型81．8％（45／55），其次CTX—M型74．5％（41／55），然后是SHV型20％（11／55）。大肠埃希菌以TEN型为主（88．4％），肺炎克雷伯杆菌以CTX—M为主（91．7％）。经等电聚焦电泳验证，少数菌株的耐药由TEN、SHV、CTX型酶之外的ESBLs引起。结论 产ESBLs菌在临床上较为普遍，大肠埃希菌以TEN型为主，肺炎克雷伯菌以CTX—M型为主，CTX—M型酶对肺炎克雷伯杆菌的头孢噻肟耐药性起重要作用。     

产ESBLs分离株耐药基因初步分型

目的了解产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌和克雷伯菌的主要基因型分布特点。方法用表型确证试验筛选出临床标本中产ESBLs的大肠埃希菌和克雷伯菌114株。应用PCR方法扩增产酶株的TEM、SHV和CTX-M基因。结果PCR结果显示TEM、SHV和CTX-M基因的总阳性率分别为40.4%、20.7%和83.3%,其中大肠埃希菌分别为48.1%、1.3%和93.5%,肺炎克雷伯菌分别为24.3%、81.1%和62.2%。46.8%的大肠埃希菌和51.4%的肺炎克雷伯菌同时携带多个基因。结论产ESBLs大肠埃希菌的主要基因型为CTX-M,肺炎克雷伯菌主要基因型为SHV。大多数菌株同时携带多个基因。     

深圳市大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶的基因分型

目的分析深圳市大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的主要基因型。方法对50株产ESBLs大肠埃希菌分别用TEM、SHV、CTX-M和OXA-1群基因引物进行PCR扩增,并对PCR产物进行序列分析。结果 92%菌株检出CTX-M型ESBLs,测序结果显示,以CTX-M-14型ESBLs为主,其次为CTX-M-55型。结论 CTX-M-14型和CTX-M-55型是深圳地区大肠埃希菌ESBLs的主要基因型。     

澳门地区产超广谱内酰胺酶大肠埃希菌基因型分析

 【目的】 了解澳门地区医院感染产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)大肠埃希菌的临床分布特点和基因型特征。【方法】 收集2007年12月至2008年2月期间从澳门地区两家医院的临床患者中分离到的大肠埃希菌158株,用表型确定试验确定产ESBL大肠埃希菌。应用PCR方法分别扩增产酶菌株的CTX-M-3、CTX-M-9、TEM和SHV等常见的β-内酰胺酶基因,并结合临床分离菌株的分布特点对PCR扩增结果作进一步的分析。【结果】 澳门地区临床分离的158株大肠埃希菌中,有54株产ESBL,产酶率为34.2%。PCR 扩增结果显示,所有产酶菌株均携带TEM基因;其中有47株(87%)同时携带CTX-M-9、TEM两个基因;没有菌株携带CTX-M-3和SHV 基因。产ESBL大肠埃希菌广泛分布于临床各科室,其中普外科占40.7%,内科占27.8%,心脏科占16.7%。标本分布较为集中,尿液占55.6%,分泌物或脓液标本占22.2%,血液和呼吸道标本各占11.1%。【结论】 澳门地区医院感染中,产ESBL大肠埃希菌在临床各科室分布广泛,主要分离自尿液、分泌物或脓液标本;所有菌株均携带TEM基因,并有87%的菌株同时携带CTX-M-9基因。     

大肠埃希菌和克雷伯菌的qnr基因流行情况调查

目的 了解上海部分医院大肠埃希菌和克雷伯菌qnr基因流行情况.方法 采用聚合酶链反应(PCR)对267株大肠埃希菌和59株克雷伯菌(其中产酸克雷伯菌4株)的qnr基因进行筛选,全自动细菌鉴定仪VITEK系统进行鉴定和最低抑菌浓度测定,并采用PCR检测qnr基因阳性菌株Ⅰ型和Ⅱ型整合酶基因.结果 在267株大肠埃希菌和59株克雷伯菌中检出3株细菌携带qnr基因,其中1株为大肠埃希菌,2株为肺炎克雷伯菌.3株qnr基因阳性菌株均产超广谱内酰胺酶(ESBLs),呈多重耐药性,且Ⅰ型整合酶均阳性、Ⅱ型整合酶均阴性.结论 在所收集的大肠埃希菌和克雷伯菌中检出3株细菌携带qnr基因,其阳性率并不高.3株qnr基因阳性菌株均产ESBLs,且呈多重耐药性,qnr基因存在于Ⅰ类整合子上.     

大肠埃希菌和克雷伯菌的qnr基因流行情况调查

目的了解上海部分医院大肠埃希菌和克雷伯菌qnr基因流行情况。方法采用聚合酶链反应(PCR)对267株大肠埃希菌和59株克雷伯菌(其中产酸克雷伯菌4株)的qnr基因进行筛选,全自动细菌鉴定仪VITEK系统进行鉴定和最低抑菌浓度测定,并采用PCR检测qnr基因阳性菌株Ⅰ型和Ⅱ型整合酶基因。结果在267株大肠埃希菌和59株克雷伯菌中检出3株细菌携带qnr基因,其中1株为大肠埃希菌,2株为肺炎克雷伯菌。3株qnr基因阳性菌株均产超广谱内酰胺酶(ESBLs),呈多重耐药性,且Ⅰ型整合酶均阳性、Ⅱ型整合酶均阴性。结论在所收集的大肠埃希菌和克雷伯菌中检出3株细菌携带qnr基因,其阳性率并不高。3株qnr基因阳性菌株均产ESBLs,且呈多重耐药性,qnr基因存在于Ⅰ类整合子上。     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒AmpC酶基因型及流行病学分析

目的：研究大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产质粒型AmpC酶株的比率、酶的基因型及其流行病学状况。方法：收集本院、福建省立医院两家医院2004年9月至2005年3月的67株耐头孢西丁不重复大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，用酶提取物三维试验检测高产AmpC酶；抽提高产AmpC酶株质粒。用聚合酶链式反应（PCR）及产物序列分析确定质粒AmpC酶和β内酰胺酶的基因型；质粒转化试验定位耐药基因；ERIC—PCR指纹图确定产酶株间的同源关系。结果：福州两家医院耐头孢西丁菌中产质粒型AmpC酶的发生率，大肠埃希菌分别为16．7％和10．5％。肺炎克雷伯菌则分别为8％和0。2株肺炎克雷伯菌产DHA-1型、4株大肠埃希菌产CMY-2型、1株大肠埃希菌产CMY-22型质粒Am—pC酶；5株产CMY型AmpC酶的大肠埃希菌还分别同时产CTX—M-14、CTX—M-27、TEM-144和TEM-1型β内酰胺酶。7株菌中，1株肺炎克雷伯菌和3株大肠埃希菌可将头孢西丁耐药性转移给受体菌。7株产酶菌ERIC—PCR指纹图显示，2株肺炎克雷伯菌来自相同克隆，其余菌株来自不同克隆。结论：福州地区发现产DHA-1型AmpC酶肺炎克雷伯菌和产CMY-2型及CMY-22型AmtpC酶大肠埃希菌。CMY-22型AmpC酶和TEM-144型B内酰胺酶是国内外首次报道，GenBank登陆号为DQ256079和DQ256080。     

产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌及肺炎克雷伯菌下呼吸道感染的浅析

目的:调查本院产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌下呼吸道感染的情况,以期对临床医生在治疗这方面疾病有所帮助。方法:收集我院内大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌下呼吸道感染病例共187例,产超广谱β-内酰胺酶菌二者的鉴定采用双纸片扩散法检测,同时做抗生素耐药分析。结果:2001年至2003年,产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌逐年的检出率为23.3%、28.1%及32.4%。肺炎克雷伯菌逐年的检出率分别为22.2%、29.6%及38.2%,均呈逐年上升趋势。肺炎克雷伯菌对多种抗生素的耐药性较非产酶株显著升高,对β-内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖甙类抗生素的耐药率均较高,但对亚胺培南的敏感性为100%,对哌拉西林/他唑巴坦的敏感性为≥80%。结论:1治疗产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌下呼吸道感染首选抗生素是碳氢霉烯类。2产超广谱β-内酰胺酶菌株的分离率和耐药率逐年上升。3为了控制其感染和播散,应控制使用广谱β-内酰胺类抗生素和加强院内消毒隔离措施。     

产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌的耐药表型及基因型研究

目的研究大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酸ESBLs耐药表型及基因型特性。方法2006年1月至2006年12月我院临床分离的大肠埃希菌125株。先后用标准纸片法筛选试验和确认试验、Etest条分别检测ES-BLs。聚合酶链反应(PCR)以及基因测序分析测定ESBLs基因的类型。结果125株大肠埃希菌中检出71株产ESBLs(56.8%)菌株。PCR结果显示,产ESBLs大肠埃希菌基因主要是CTX-M-14型为主;TEM基因型均为TEM-1型,SHV基因型均为SHV-1型。产ESBLs肺炎克雷伯菌对头孢曲松、头孢噻肟、左氧氟沙星耐药率在70%以上,对美罗培南,亚胺培南敏感性好。结论本地区大肠埃希菌ESBLs携带率较高,其基因以CTX-M-14型为主,其次CTX-M-3型ESBL,产酶株对多种抗菌药物耐药,对美罗培南、亚胺培南敏感性好。     

革兰阴性杆菌TEM型β-内酰胺酶耐药基因研究

目的 了解中南大学3所附属医院产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)革兰阴性杆菌TEM型耐药基因的检出及流行情况.方法 收集254株多重耐药革兰阴性杆菌,采用双纸片协同法(DDS)进行ESBLs表型确证,多重PCR.法扩增blaTEM、blaSHV、blaOXA-1基因,TEM特异性引物对其整个开放阅读框进行扩增并对PCIL产物测序,通过BLAST分析确定基因型;并对携带有TEM基因的革兰阴性菌株用随机扩增多态DNA(RAPD)方法进行菌株的同源性分析.结果 经多重PCR扩增,105株肠杆菌获得阳性结果,其中85株菌携带TEM基因,26株菌携带SHV基因,10株菌携带OXA-1基因;6株非发酵菌获得阳性结果,均携带TEM基因,且全部为TEM-1型广谱β-内酰胺酶.携带blaTEM耐药基因的菌株所含RAPD类型:大肠埃希菌12种,肺炎克雷伯菌6种,阴沟肠杆菌7种.结论 TEM-1型β-内酰胺酶是湖南地区主要流行的TEM型酶;大肠埃希菌产TEM酶情况尤为突出;在同一医院以及同一病区存在TEM-1型β-内酰胺酶的克隆传播.     

产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌耐药表型和基因型分析

目的:分析临床分离大肠埃希菌耐药性、产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性率及耐药基因之间的关系。方法:用K-B法检测117株大肠埃希菌耐药性,用酶抑制剂增强实验纸片法检测产ESBLs菌株,用PCR法检测相关耐药基因,用DNA序列分析确认基因亚型。结果:117株大肠埃希菌产ESBLs 49株,阳性率41.9%。产ESBLs菌株对青霉素类和第一、第二代头孢菌素耐药率100%,对第三代头孢菌素中头孢哌酮、头孢噻肟和头孢曲松耐药率>95%,对酶抑制剂哌拉西林/三唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦耐药率<20%,未检测到亚胺培南耐药株。非产ESBLs菌株耐药率明显低于产ESBLs菌株。49株产ESBLs菌株PCR均扩增到CTX-M型耐药基因,44株扩增到TEM型基因,未扩增到其他基因型。DNA序列分析证实为CTX-M-14亚型、CTX-M-3亚型和广谱酶TEM-1亚型基因。结论:大肠埃希菌产ESBLs较高,耐药显著;耐药基因以CTX-M-14亚型为主,其次为CTX-M-3亚型,尚未检出其他ESBLs基因。TEM-1亚型广谱内酰胺酶基因在大肠埃希菌中普遍存在。     

临床分离的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中超广谱β-内酰胺酶的检测

目的：检测临床分离的临床分离的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）菌株的发生率、耐药性、流行性以及酶的基因型别。方法：采用双纸片法、琼脂稀释法、PCR、脉冲场电泳对1999年复旦大学附属华山医院临床分离的559株肺克雷伯菌和427株大肠埃希菌进行检测。结果：肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中产ESBL菌株的发生率分别为51％和23.6％,产ESBL菌株主要分布于ICU和神经外科病房,对大多数的β-内酰胺酶和非β-内酰胺类抗菌药物耐药;PFGE显示,产ESBL菌株（尤其是产ESBL肺炎克雷伯菌株）在ICU病房中存在同一菌株的克隆传播;PCR检测显示TEM型是最为常见的β-内酰胺酶型别,CTX-M型ESBL亦较为普遍。结论：产ESBL菌株在临床分离的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中较为普遍,而且为多重耐药菌株,在医院内中存在流行与传播。