斑马鱼胚胎发育过程中miR-9、miR-219及Dicer基因的时序性表达

目的探讨斑马鱼胚胎发育过程中miR-9、miR-219及Dicer基因时序性表达规律。方法取正常发育至受精后4、8、12、16、20、24、36、48和72 h(hpf)斑马鱼胚胎各约40枚,用Trizol法分别提取总RNA,茎环法反转录为c DNA,用Real-time PCR检测胚胎miR-9、miR-219及Dicer表达量。结果 miR-9、miR-219及Dicer表达水平在胚胎发育过程中呈现峰谷变化,不同发育阶段之间总的差异有统计学意义(P0.05)。与胚胎发育全程的基因平均表达水平相比,miR-9在8 hpf之前表达量较低(P0.05),36 hpf后表达量持续增高,48 hpf和72 hpf时表达量显著高于平均水平(P0.01)。miR-219在8 hpf之前表达量也处于较低水平(P0.05),20 hpf后迅速增高,24hpf时达到峰值,并持续到48 hpf(P0.01)。Dicer在胚胎早期(4 hpf)就有明显表达(P0.05),随后表达水平迅速下降,16 hpf时达到低点(P0.05),然后逐渐回升,直至胚胎末期。结论斑马鱼胚胎发育过程miR-9、miR-219及Dicer时序性表达有一定规律,miR-9主要在胚胎后期表达,miR-219主要在胚胎中期表达,Dicer主要在胚胎早期表达,其次在胚胎后期,提示miR-9、miR-219及Dicer参与胚胎发育调控过程。     

sox19b在斑马鱼胚胎眼睛发育中的作用

目的 通过抑制sox19b基因的表达,探讨sox19b基因在斑马鱼胚胎眼睛发育和形成中的作用。方法 通过显微注射sox19b 吗啉寡聚核苷酸（MO）抑制sox19b 基因的表达,观察胚胎发育过程中表型的变化;采用石蜡包埋组织切片及HE染色、RT-PCR和整封原位杂交等方法探讨敲除sox19b 后对斑马鱼胚胎眼睛发育的调控机制。 结果 敲除sox19b 基因后,斑马鱼胚胎眼睛发育受到影响,表现为眼睛变小或缺失,视网膜及晶状体结构发育异常(n =57/93);眼睛发育过程中重要调控基因 rx3、pax2a及 vsx2 等表达明显降低,进而影响眼睛的发育和形成。 结论 sox19b 基因作为转录调控因子,可以通过调节眼区转录因子的表达进而影响斑马鱼胚胎早期眼睛的发育和形成。     

胚胎期铅暴露对斑马鱼胚胎及幼鱼NMDA受体mRNA表达的影响

目的:了解胚胎期铅暴露对斑马鱼胚胎及幼鱼N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体mRNA表达的影响。方法:野生型AB品系斑马鱼胚胎醋酸铅暴露浓度分别为0、0.1、0.5、2.5和12.5 μmol/L,提取各组受精后24、48、72、96和120 h(hpf)斑马鱼胚胎或幼鱼总RNA,实时定量PCR检测NMDA受体亚基NR1.1、NR1.2和NR2B的mRNA表达量。结果:(1)对照组NR1.1和NR1.2及NR2B表达量在胚胎发育过程中逐渐升高,在孵化期(72 hpf)表达量增加明显,在幼鱼早期(96 hpf)时达到高峰(与24 hpf时比较, P<0.01),在120 hpf时仍处于较高水平。(2)随着铅暴露浓度增高,NR1.1表达量增加并有高峰前移的趋势,2.5 μmol/L和12.5 μmol/L铅暴露组NR1.1表达高峰期在72 hpf,并且显著高于对照组(P<0.05);铅暴露组NR1.2和NR2B动态表达也呈类似规律,但NR1.2表达高峰期呈平台化趋势,横跨72 hpf至120 hpf阶段,NR2B表达高峰期出现在72 hpf和120 hpf阶段。(3)NR1.1、NR1.2及NR2B mRNA表达量之间Pearson相关系数值分别为r_NR1.1-1.2 =0.681、r_NR1.1-2B=0.637和r_NR1.2-2B =0.514,均有统计学意义(P<0.01)。结论:在斑马鱼胚胎发育过程NR1.1、NR1.2及NR2B mRNA表达水平逐渐升高,在幼鱼早期达到高峰;胚胎和幼鱼阶段NR1.1、NR1.2及NR2B之间mRNA表达水平存在关联;铅有上调NR1.1、NR1.2和NR2B mRNA表达作用并使表达峰期前移,改变了正常的NMDA受体表达规律。     

Foxi蛋白对第1、2鳃弓衍生物的发育调节

第1、2鳃弓是胚胎发育过程中的重要结构,可分化为颅面骨骼、耳等结构。鳃弓发育异常可导致斑马鱼、大鼠等动物产生颅面、耳等结构畸形。Forkhead(Fox)蛋白家族是胚胎发育过程中的关键转录因子,该家族中Foxi在胚胎内外胚层的不同时期有相应程度的表达,foxi1基因突变斑马鱼存在颚骨、耳板缺失及鳃弓神经嵴细胞凋亡增加等异常,Foxi1突变大鼠、狗等动物中也有相似异常。Foxi蛋白可能通过先驱因子作用调节早期胚胎发育过程中相关基因的表达,影响整个胚胎颅面结构的形成。     

斑马鱼胚胎发育过程成纤维细胞生长因子受体基因时序性表达

目的探讨斑马鱼胚胎发育过程成纤维细胞生长因子(FGF)受体基因时序性表达规律。方法分别提取发育至4、6、10、12、18、24、48及72hpf斑马鱼胚胎总RNA并反转录为cDNA,用实时定量PCR方法检测FGF受体基因(fgfrs)mRNA的相对表达量。结果斑马鱼胚胎发育过程fgfrs mRNA动态表达水平有明显峰谷变化(P0.01),胚胎fgfrs开始表达阶段依次为fgfr1a与fgfr1b(囊胚期)、fgfr4(原肠胚初期)、fgfr2(原肠胚期)及fgfr3(原肠胚后期),其表达高峰期分别在原肠胚期、原肠胚后期、体节期及胚胎发育中后期。旁系同源基因fgfr1a与fgfr1b动态表达趋势相似(r=0.830,P0.05)。fgfr1a与fgfr3、fgfr1b与fgfr4、fgfr2与fgfr3 mRNA表达量之间相关分析也有意义(r值分别为-0.726,0.821及0.772,P0.05)。结论斑马鱼胚胎发育过程fgfrs时序性表达有一定规律性,fgfr1、fgfr4主要参与胚胎早期发育调控,fgfr2、fgfr3主要参与胚胎中、后期发育调控。fgfr1a与fgfr1b共表达使其调控作用具有冗余能力。fgfr1和fgfr3之间在表达上可能存在相互制约关系。     

Tbx1基因和DiGeorge综合征

Tbx1基因属于T-box基因家族。Tbx1蛋白通过与DNA上的T盒结合调控基因的表达。Tbx1位于人的22q11．2和小鼠的16号染色体。胚胎发育过程中，Tbx1参与了咽弓内胚层的发育和神经嵴细胞的迁移和分化。小鼠和斑马鱼的研究均表明Tbx1的缺失将导致来源于咽弓的结构发育异常。Tbx1基因是DiCeorge综合征最重要的候选基因。Shh,Fgf,视黄酸可以对Tbx1基因的功能进行调控。     

铅对斑马鱼胚胎发育的毒性作用

目的 探讨铅对斑马鱼胚胎发育的毒性作用. 方法 野生型AB品系斑马鱼胚胎,自受精后1h(1 hpf)起,分别用醋酸铅质量浓度为0.1、0.5、2.5、12.5 μmol/L胚胎培养液染毒至胚胎孵出或死亡,每组胚胎50枚,相差显微镜下观察胚胎发育全程并记录毒性反应,于4、8、16、24、48、72hpf进行胚胎活体摄片,以不含铅培养液孵养的胚胎作为对照.另取各组36 hpf胚胎,电镜下观察间脑神经细胞超微结构. 结果 铅暴露组胚胎死亡率明显升高(P＜0.05),在胚胎发育早期有1个高峰,而且随着铅暴露浓度增高,胚胎死亡率总体呈上升趋势(P＜0.01);铅暴露胚胎发育异常主要见于胚胎发育早期,多表现为胚胎发育迟缓;铅暴露胚胎在发育过程中出现少数畸形,但无统计学意义;除12.5μmol/L铅暴露组外,其他铅暴露组胚胎的平均孵出时间较对照组滞后(P＜0.05);电镜观察显示,铅暴露可引起胚胎神经细胞核固缩,细胞水肿,细胞器结构受损. 结论 铅对斑马鱼胚胎发育有明显的毒性作用,在胚胎发育早期尤为敏感;即使较低水平的铅暴露,仍可引起胚胎神经细胞的损害.     

zdhhc17对斑马鱼集中延伸运动的调节及其机制 

目的 通过抑制zdhhc17基因的表达,探讨其在斑马鱼胚胎发育过程中的作用及机制。方法 通过显微注射zdhhc17吗啉反义寡聚核苷酸(MO)抑制zdhhc17翻译,观察斑马鱼胚胎发育过程中相关表型的变化。利用斑马鱼整封原位杂交技术,检测集中延伸运动相关标记基因（dlx3b、ntl、myod1、 tbx6等）的表达变化。利用RT-PCR技术,检测集中延伸运动相关调控因子mRNA表达水平的变化。 结果 敲除zdhhc17基因后,斑马鱼胚胎集中延伸运动出现严重缺陷,主要表现为尾部弯曲变短（82/118）,且集中延伸运动相关标记基因表达异常,钙黏附蛋白家族cdh1、padh18a mRNA水平降低。结论 zdhhc17通过调节钙黏附蛋白家族cdh1、padh18a基因的表达,进而影响细胞黏附运动,最终参与调控斑马鱼胚胎集中延伸运动。     

基因芯片分析鱼藤素对斑马鱼胚胎发育的影响

背景：鱼藤素具有延缓斑马鱼胚胎发育的作用,但其具体作用机制尚未明确。 目的：分析鱼藤素处理斑马鱼胚胎的基因与信号传导通路表达差异。 方法：斑马鱼胚胎来自于根据Zebrafish book中描述的方法养的殖斑马鱼。用0.6 μmol/L鱼藤素处理2-细胞期斑马鱼胚胎,以二甲基亚砜孵化液处理2-细胞期斑马鱼胚胎为对照。4 hpf 时期提取二甲基亚砜组及鱼藤素组总RNA,利用基因芯片技术检测鱼藤素处理斑马鱼胚胎后基因的差异表达,采用实时荧光定量PCR验证基因芯片结果,结合聚类分析及通路分析来探索鱼藤素的作用机制。 结果与结论：芯片结果显示,鱼藤素处理斑马鱼胚胎后差异表达上调3倍以上的基因407个,下调的461个。PCR 验证结果与芯片结果相符。经KEGG 通路分析,涉及14条通路。鱼藤素可能通过干扰细胞的代谢生长及影响其分化起作用。     

下调lmna基因促进斑马鱼胚胎细胞凋亡

目的探讨利用吗啉代寡核苷酸技术(MO)下调lmna后斑马鱼胚胎细胞的凋亡机制。方法在目的基因lmna序列中选择靶点,设计针对目的基因的吗啉代寡核苷酸序列(lmna-MO),利用显微注射技术,将lmna-MO注射到野生型斑马鱼(Tüebingen品系)胚胎中,下调斑马鱼lmna基因。采用流式细胞技术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡蛋白p-AKT、AKT及BCL-2的表达量。结果注射lmna-MO后24和72 h,斑马鱼胚胎均存在细胞早期凋亡,且与药物暴露时相存在相关性(P0.01);lmna-MO注射后24和72 h,p-AKT蛋白的表达较野生型胚胎的表达均有增加(P0.01);AKT蛋白的表达较野生型胚胎的表达均有增加(P0.05);而BCL-2蛋白的表达较野生型胚胎的表达均有下降(P0.05)。结论 lmna基因参与调控斑马鱼胚胎细胞凋亡过程,其机制可能与AKT蛋白及BCL-2蛋白的表达有关;p-AKT(S473)参与AKT通路活化,而lmna基因下调可促进AKT磷酸化,通过活化P13K/AKT信号通路来抑制凋亡促进细胞存活,但其并非唯一凋亡调控机制。     

Tbx1基因和 DiGeorge综合征

Tbx1基因属于T-box基因家族.Tbx1蛋白通过与DNA上的T盒结合调控基因的表达.Tbx1位于人的22q11.2和小鼠的16号染色体.胚胎发育过程中,Tbx1参与了咽弓内胚层的发育和神经嵴细胞的迁移和分化.小鼠和斑马鱼的研究均表明Tbx1的缺失将导致来源于咽弓的结构发育异常.Tbx1基因是DiGeorge综合征最重要的候选基因.Shh,Fgf,视黄酸可以对Tbx1基因的功能进行调控.     

长春碱增加班马鱼肿瘤耐药基因abcb4的表达

目的通过研究长春碱(VBL)对斑马鱼早期发育过程中abcb4肿瘤耐药基因表达的影响,为进一步建立抗肿瘤药物多药耐药筛选的斑马鱼模型奠定重要的实验基础。方法将长春碱稀释成不同浓度梯度的药液,在受精后0.5~1.5 h的斑马鱼胚胎上完成药物暴露实验,计算出长春碱IC_(50)的数值。设置长春碱为实验组,胚胎培养液为空白对照组,分别作用于受精后0.5~1.5 h的斑马鱼胚胎,观察受精后24~120 h的斑马鱼胚胎发育情况,记录死亡、孵化及畸形的胚胎数目;收集不同组别的斑马鱼胚胎,通过实时荧光定量PCR和胚胎整体原位杂交的方法,检测斑马鱼胚胎中abcb4基因的表达量。结果计算出长春碱在斑马鱼胚胎中的IC_(50)为3.08μmol/L;与对照组比较,实验组的斑马鱼胚胎abcb4基因的mRNA水平明显升高(P0.05);通过胚胎整体原位杂交的方法,在受精后120 h斑马鱼胚胎的小肠部位发现有abcb4基因阳性杂交信号,且实验组斑马鱼胚胎在脑和心脏部位发现abcb4基因阳性杂交信号。结论长春碱能明显增加斑马鱼早期胚胎中abcb4肿瘤耐药基因的表达水平,提示使用斑马鱼可以复制肿瘤耐药模型。     

鱼藤素对斑马鱼胚胎毒性的作用*

背景：以模式生物斑马鱼构建生物模型,易于开展活体实验。 目的：探讨了不同鱼藤素浓度对斑马鱼胚胎发育的影响。 方法：不同鱼藤素浓度作用于斑马鱼胚胎,分别在受精后48,72 h观测其表型变化,受精后72 h统计其胚胎孵化率。 结果与结论：鱼藤素在0.1 μmol/L浓度以下对斑马鱼胚胎发育无影响,0.2 μmol/L浓度延缓斑马鱼胚胎发育,0.3 μmol/L浓度以上抑制了斑马鱼胚胎发育,使胚胎致死。结果表明,鱼藤素高浓度使胚胎致死,低浓度延缓胚胎发育。       

鱼藤素对斑马鱼胚胎中细胞周期蛋白D1基因下调的作用:整胚原位杂交检测

背景:斑马鱼胚胎发育早期,细胞分裂增殖快速,低浓度的鱼藤素可以延缓斑马鱼胚胎发育。目的:观察鱼藤素对斑马鱼胚胎中细胞周期蛋白D1基因的表达影响。方法:收集正常受精后发育至2-cell期(受精后约0.75 h)以及shield期(受精后6 h)斑马鱼胚胎于12孔板,分别用100,200,400 nmol/L鱼藤素在28.5℃的培养箱中避光处理至shield期及受精后24 h。同时用1%的二甲基亚砜溶液作为对照组,于相同条件下培养。后收集对照组及实验组胚胎,制备细胞周期蛋白D1 RNA探针进行整胚原位杂交,于正置荧光显微镜下拍照观察染色情况以检测鱼藤素对胚胎中细胞周期蛋白D1基因的表达影响。结果与结论:鱼藤素对斑马鱼胚胎中细胞周期蛋白D1基因的表达有明显的负调控作用。Shield期对照组胚胎细胞周期蛋白D1在外包细胞中泛表达,随着给药浓度的增加,细胞周期蛋白D1的表达显著减少,400 nmol/L鱼藤素处理组几乎不表达。受精后24 h的胚胎中细胞周期蛋白D1在脑部、中枢神经系统、发育未成熟的眼部、体节、躯干、尾部等有表达,100 nmol/L鱼藤素处理组表达明显下调,在增殖性区域几乎不表达。200,400 nmol/L处理组胚胎发育明显延缓,细胞周期蛋白D1主要表达于背侧外胚层细胞。     

缺氧再灌注斑马鱼胚胎脑部细胞凋亡及c-fos基因的表达

背景：国外已经有学者使用斑马鱼胚胎开始进行缺氧再灌注的研究,但还没有关于c-fos基因在斑马鱼脑缺氧再灌注过程中的表达及其作用机制的报道。 目的：观察缺氧再灌注后斑马鱼胚胎脑部细胞凋亡及脑组织中c-fos基因的表达情况。 方法：取48 hpf的斑马鱼胚胎进行缺氧实验,模拟新生儿缺氧再灌注损伤环境,通过向水中通入99.999%高纯氮气制造缺氧环境,分别经过6,12,24 h的缺氧处理后,在正常氧体积分数下进行6 h恢复。对照组为正常通气组(溶解氧浓度在7.0 mg/L左右)。采用吖啶橙染色方法,观察不同缺氧时间对斑马鱼神经细胞凋亡的影响,同时采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR),对c-fos基因表达情况进行定量分析,比较缺氧再灌注前后c-fos基因表达水平的变化。 结果与结论：对照组脑部能检测到微量细胞凋亡,c-fos基因呈低水平表达;实验组经过6,12,24 h缺氧后,脑部凋亡细胞逐渐增多,缺氧24 h组凋亡细胞增幅最大(P < 0. 05),c-fos基因表达有不同程度升高(P < 0.05),尤其是缺氧6 h后,该基因的表达上调幅度最高。结果表明缺氧会导致斑马鱼脑细胞内c-fos基因表达上调,可能是导致缺氧后期脑细胞凋亡激增的机制之一。     

鱼藤素可影响斑马鱼胚胎Wnt信号通路相关基因的表达

背景：前期研究发现,在斑马鱼早期发育的不同时期,经过一定浓度鱼藤素处理的胚胎表现出不同程度的发育延缓和表型异常。 目的：观察斑马鱼早期胚胎发育过程中鱼藤素对wnt信号通路相关基因表达的影响。 方法：收集孵育至shield期的斑马鱼胚胎于6孔板中,加入0.6 μmol/L浓度的鱼藤素溶液,避光处理,28 ℃培养箱中孵养。用0.1%二甲基亚砜溶液作为对照组,相同条件培养。在受精后6,8,10,12,14,24 h时用正置荧光显微镜拍照观察鱼藤素处理后斑马鱼胚胎发育表型。实时荧光定量核酸扩增检测鱼藤素作用前后目的基因表达水平的变化。 结果与结论：shield期处理的斑马鱼胚胎在bud期停止生长;wnt信号通路上的wnt9a,wnt10b和axin2以及与wnt信号具有密切联系的snail1b,Jnk2表达发生显著变化,其中wnt9a,wnt10b,axin2,snail1b表达下调,Jnk2表达上调。结果提示鱼藤素对斑马鱼体内wnt信号具有负调节作用。     

组蛋白去乙酰化调控软骨细胞Ⅱ型胶原表达的机理研究

目的　探讨通过TSA抑制组蛋白去乙酰化水平,研究组蛋白去乙酰化对软骨细胞表型相关基因的影响及其机制,从表观遗传学角度为维持软骨细胞表型提供新的思路。 方法 体外培养人关节软骨细胞,建立软骨细胞去分化模型,采用不同浓度TSA刺激,在不同时间点收集细胞,提取总RNA,利用qRT-PCR检测Wnt-5a、SOX-9、COL-Ⅱ、COL-Ⅰ的mRNA表达情况。利用免疫荧光及Westerblot进行COL-Ⅱ蛋白表达水平的检测。 结果　与对照组比较,TSA（0.25~1.0 μmol/L）显著降低COL-Ⅱ mRNA表达水平及蛋白表达水平,升高Wnt-5a 和SOX-9 mRNA表达水平;抑制Wnt-5a信号通路减弱TSA 对COL-Ⅱ的抑制效应。 结论 TSA通过激活Wnt-5a和 SOX-9从而抑制COL-Ⅱ的表达,导致软骨细胞表型丧失。因此,组蛋白去乙酰化通过降低Wnt-5a和SOX-9,升高COL-Ⅱ的表达水平,发挥维持软骨细胞表型的作用。     

促红细胞生成素在斑马鱼胚胎发育中抑制肾脏细胞凋亡

目的:研究促红细胞生成素(Epo)在斑马鱼早期胚胎肾脏细胞发育中的凋亡和坏死方面起到的作用。方法:使用吗啉反义寡核苷酸技术通过胚胎注射使Epo及其受体(EpoR)的表达下调,并用real-time PCR及血红蛋白染色进行基因下调的有效性验证。在胚胎受精48 h观察肾脏形态并进行TUNEL凋亡染色,使用流式细胞术分析Annexin V凋亡染色,并用Western blot进行Akt磷酸化验证。结果:Epo及EpoR基因表达下调的斑马鱼胚胎在受精48 h可见明显肾小球囊样改变,且肾小管颈部缩短消失。TUNEL及Annexin V染色结果提示受精48 h后,Epo及EpoR基因表达下调的斑马鱼胚胎中肾脏凋亡细胞增多,但EpoR基因下调的斑马鱼胚胎内主要表现为晚期凋亡细胞及坏死细胞增多。Western blot实验结果提示Epo及EpoR基因表达下调的斑马鱼胚胎较对照组Akt磷酸化减少(P0.05)。结论:促红细胞生成素可引起Akt磷酸化。促红细胞生成素通过保护肾脏细胞免于凋亡和坏死而在斑马鱼胚胎肾脏发育中发挥重要作用。     

TBX1基因与染色体22q11.2微缺失综合征

染色体22q11·2微缺失综合征(22q11·2DS)是人类最常见的染色体微缺失综合征。TBX1基因作为一个T-BOX家族转录因子,其单拷贝缺失可能是22q11·2DS的主要原因之一,它对该综合征临床表征的出现可能有重要作用。TBX1在胚胎生长发育是胚胎咽部分节、咽弓和动脉弓形成、心脏流出道生长与排列及分隔等过程所必需的基因。TBX1受一系列调控基因调节,其本身也调控一系列基因。     

猪IL-10在软骨细胞中的表达

为了构建猪IL 10真核表达载体并在猪软骨细胞中表达。将目的基因酶切连入真核表达载体pcDNA3 1,以FuGENE 6介导转入猪软骨细胞中表达 ,RT PCR检测IL 10在软骨细胞中mRNA表达水平 ,ELISA检测细胞培养上清中IL 10蛋白含量。观察其对效应细胞PBMC分泌IFN γ和软骨细胞MHCII类分子表达的影响。结果显示 ,成功构建了猪IL 10真核表达载体 ,并转入软骨细胞 ,检测到细胞内IL 10mRNA转录 ,细胞培养 2 4、 4 8和 72h后 ,经ELISA检测上清中IL 10蛋白含量分别为 196 1 9、 2 92 5 9和 2 95 3 4pg/ml,能明显抑制经PHA刺激的PBMC分泌IFN γ (抑制率达 6 8 1% )和软骨细胞MHCII类分子的表达。猪IL 10真核表达载体的成功构建并在软骨细胞中表达 ,发挥其免疫调节功能 ,为研究IL 10诱导软骨细胞体内同种异体移植耐受奠定了基础。