低磷胁迫对太空诱变耐低磷柱花草酸性磷酸酶活性和磷效率的影响

低磷胁迫是酸性土壤限制牧草生产的主要障碍因子之一。本课题组前期的研究中,通过太空诱变获得了一个耐低磷柱花草突变体TPRC2001-84,但其适应低磷胁迫的机制仍不清楚。以TPRC2001-84及其亲本热研2号(RY2)为试验材料,通过水培方法,比较正常供磷(+P,250 μmol·L^-1 KH₂PO₄)和低磷(-P,5 μmol·L^-1 KH₂PO₄)处理对TPRC2001-84和RY2生物量、磷吸收效率、磷利用效率、可溶性磷浓度、细胞壁磷含量和酸性磷酸酶(ACP)活性的影响。结果表明,相对于正常供磷处理,低磷处理显著降低了两份柱花草材料的植株干重和磷吸收效率(P<0.05),但显著提高了两份柱花草材料的磷利用效率(P<0.05)。并且,TPRC2001-84在低磷处理下的植株干重和磷利用效率分别是RY2的1.6和1.4倍。在低磷胁迫下,虽然TPRC2001-84叶片和根系的细胞壁磷含量只有RY2的70%左右,但是,TPRC2001-84叶片和根系的可溶性磷浓度分别比RY2高36.8%~42.6%,细胞壁ACP活性分别比RY2高46.6%~53.6%。以上结果说明,柱花草TPRC2001-84在低磷胁迫下具有较高的细胞壁ACP活性,有利于其对细胞壁中贮存磷的活化利用,从而获得较高的磷利用效率。这将为选育磷高效柱花草新品种提供理论依据和种质材料。     

柱花草SgSTOP1和SgSTOP2基因的克隆与表达分析

铝毒是酸性土壤中限制作物生长和产量增加的主要因素之一。转录因子STOPs具有调控耐铝相关基因表达的功能,是植物耐铝毒的重要基因。本研究以耐铝柱花草(Stylosanthes guianensis)基因型‘TPRC2001-1’为材料,首次克隆到两个柱花草编码锌指蛋白SgSTOP1和SgSTOP2基因。这两个基因cDNA全长分别为1 515和1 077 bp,编码504和358个氨基酸残基,蛋白分子量分别为56.2和39.7 kDa。亚细胞定位预测表明,SgSTOP1和SgSTOP2均定位于细胞核中。并且,SgSTOP1和SgSTOP2均为ZF-C_2H_2家族成员,SgSTOP1和SgSTOP2均包含4个保守的锌指结构域。定量PCR结果表明,铝毒胁迫显著增强SgSTOP1在‘TPRC2001-1’根和叶中的表达(P 0.05),但铝处理对SgSTOP2表达影响不明显(P 0.05),暗示SgSTOP1基因可能参与柱花草对铝毒胁迫的应答过程。本研究结果为进一步解析柱花草适应铝毒胁迫的分子调控机制提供了候选基因资源。     

柱花草磷高效种质筛选及根系形态对低磷胁迫的响应分析

为筛选磷高效柱花草（Stylosanthes guianensis）种质并解析其根系适应低磷胁迫的机理,本试验水培了31份柱花草,开展了磷效率评价,分析了低磷胁迫对柱花草根系的影响,并检测了6个扩展蛋白基因（Expansins,EXP）响应低磷胁迫的表达模式。结果表明,低磷胁迫显著降低柱花草的干重和全磷含量。磷效率分析结合根系表型显示,TF291为磷高效高响应型,且低磷胁迫显著促进其根系生长,TF343为磷低效低响应型,且低磷条件下其根系生长显著受抑制。荧光定量PCR表明,低磷处理（-P）使SgEXPB2在TF291和TF343根系中的表达分别增加3.73倍和1.52倍（P<0.05）,SgEXLB1在TF291根系中表达增加1.61倍（P<0.05）。综上所述,本研究筛选到磷高效高响应型柱花草种质为TF291,且根系中SgEXPB2和SgEXLB1基因上调表达,可能参与柱花草适应低磷胁迫。     

镉胁迫对3种柱花草生长及植株镉积累和分配的影响

利用不同浓度镉离子(Cd²⁺)溶液对3个柱花草(Stylosanthes spp.)品种进行不同程度的胁迫处理,以研究Cd²⁺胁迫对柱花草生长、镉积累及其分配的影响。结果表明:随着Cd²⁺浓度的增加,3种柱花草生长均受到抑制,Cd²⁺胁迫对西卡柱花草(Stylosanthes scabra cv.Seca)株高、分枝数、地上部和地下部生物量影响最大,其次是TPRC2001-1柱花草(Stylosanthes guianensis.TPRC2001-1),而热研2号柱花草(Stylosanthes guianensis cv.Reyan2)影响最小;在Cd²⁺胁迫下3种柱花草地上部和地下部Cd²⁺含量均显著增加,TPRC2001-1柱花草体内含Cd²⁺量较热研2号柱花草和西卡柱花草大;地上部富集系数随Cd²⁺浓度增加呈下降趋势,且在低Cd²⁺浓度(≤1 mg·kg^-1)下更易富集Cd²⁺;Cd²⁺转运系数呈现先上升后下降。     

低磷胁迫对太空诱变耐低磷柱花草酸性磷酸酶活性和磷效率的影响

低磷胁迫是酸性土壤限制牧草生产的主要障碍因子之一。本课题组前期的研究中,通过太空诱变获得了一个耐低磷柱花草突变体TPRC2001-84,但其适应低磷胁迫的机制仍不清楚。以TPRC2001-84及其亲本热研2号(RY2)为试验材料,通过水培方法,比较正常供磷(+P,250μmol·L-1 KH2PO4)和低磷(-P,5μmol·L-1KH2PO4)处理对TPRC2001-84和RY2生物量、磷吸收效率、磷利用效率、可溶性磷浓度、细胞壁磷含量和酸性磷酸酶(ACP)活性的影响。结果表明,相对于正常供磷处理,低磷处理显著降低了两份柱花草材料的植株干重和磷吸收效率(P0.05),但显著提高了两份柱花草材料的磷利用效率(P0.05)。并且,TPRC2001-84在低磷处理下的植株干重和磷利用效率分别是RY2的1.6和1.4倍。在低磷胁迫下,虽然TPRC2001-84叶片和根系的细胞壁磷含量只有RY2的70%左右,但是,TPRC2001-84叶片和根系的可溶性磷浓度分别比RY2高36.8%~42.6%,细胞壁ACP活性分别比RY2高46.6%~53.6%。以上结果说明,柱花草TPRC2001-84在低磷胁迫下具有较高的细胞壁ACP活性,有利于其对细胞壁中贮存磷的活化利用,从而获得较高的磷利用效率。这将为选育磷高效柱花草新品种提供理论依据和种质材料。     

柱花草SgLPR1基因克隆与表达分析

植物的生长和发育受土壤磷有效性的影响。柱花草(Stylosanthes guianensis)是主要的热带豆科牧草，对低磷胁迫表现出优良的适应性。由LPR基因编码的多铜氧化酶被报道在调控植物根系生长和低磷响应方面发挥重要作用。本研究分析了低磷胁迫对两个柱花草基因型生长的影响，并对SgLPR1基因进行了克隆和表达分析。结果表明：相对柱花草基因型‘TF0285’，‘TF0277’具有较高的植株干重和磷吸收效率，且低磷处理促进了‘TF0277’根系的生长。基因克隆分析表明，SgLPR1基因全长为1 713 bp，编码570个氨基酸残基，蛋白分子量为64.1 kDa，属于Cupredoxin家族成员，亚细胞定位预测SgLPR1蛋白定位于内质网上。实时定量聚合酶链反应(PCR)结果表明，SgLPR1基因在柱花草茎中表达量高于其他组织中的表达量，且在根尖大于1 cm的根段中表达量最高。相比对照处理，缺氮、缺磷和缺钾处理均增加了SgLPR1基因在柱花草叶和根中的表达量。此外，低磷处理增加了SgLPR1基因在柱花草‘TF0277’根中的表达，但其在‘TF0285’根中的表达无显著变化。本研究结果揭示了...     

无芒隐子草SAMS1基因的克隆及干旱胁迫下的表达分析

以无芒隐子草干旱诱导的cDNA文库中获得的一个与S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因同源性较高的EST序列为基础,采用RT-PCR技术克隆该基因全长序列(命名为CsSAMS1),该序列全长1 399 bp,编码397个氨基酸,具有SAMS基因的典型结构特征。无芒隐子草SAMS1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构域,其空间结构主要由α-螺旋和无规则卷曲结构构成。与近缘植物SAMS的氨基酸序列多重比较分析表明,不同植物的SAMS的氨基酸相似程度非常高(92%~100%), 其中无芒隐子草与水稻的相似性最高(99%), 说明SAMS基因在植物进化中非常保守。CsSAMS1基因在无芒隐子草幼苗干旱过程中的半定量和实时定量RT-PCR表达模式分析均表明,干旱胁迫诱导该基因在根中大量表达, 叶中表达量变化不明显。CsSAMS1基因受干旱胁迫的诱导表达,为进一步探讨其应用于草类作物抗旱性的遗传改良奠定了基础。     

柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆与表达分析

为了探究植物天然抗性相关巨噬蛋白（Nramp）在金属元素吸收、转运和分配等方面的重要作用，本研究以柱花草（Stylosanthes guianensis）为材料，采用PCR方法克隆了柱花草SgNramp1/2基因，并分析了该基因的表达模式。结果表明：SgNramp1和SgNramp2基因全长分别为1 654 bp和1 716 bp，且均含有12个跨膜结构域。基因表达分析发现，SgNramp1在柱花草根部的表达高于叶部，而SgNramp2则在叶中特异性表达；金属元素缺乏和过量胁迫对SgNramp1/2基因表达的影响有所差异，缺锰（-Mn）处理抑制了SgNramp1/2基因在根和叶中的表达，而缺铁（-Fe）处理则增强了SgNramp2基因在叶中的表达，但抑制了其在根中的表达，SgNramp1/2基因在根和叶中的表达至少受到一种元素过量胁迫的影响。此外，金属镉（Cd）处理均增强了SgNramp1/2基因在柱花草根中的表达，而铝（Al）和镧（La）处理抑制了SgNramp1基因的表达，但增强了SgNramp2基因的表达。本研究结果表明SgNramp1/2基因可能参金属离子的转运。     

小花碱茅HKT2;1基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

Na⁺是盐渍化土壤中主要的毒害离子,对植物生长发育和农业生产构成严重威胁。高亲和性K⁺转运蛋白HKT2;1在控制高等植物Na⁺吸收,增强K⁺的选择性,进而提高耐盐性方面发挥着重要作用。本研究以拒盐型牧草小花碱茅为材料,采用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends)方法克隆到HKT2;1基因,并命名为PutHKT2;1。该基因全长1 919 bp,包含1个长1 638 bp的开放阅读框(ORF),编码546个氨基酸,推测分子量为60.5 kDa,等电点PI为9.07。与其他植物HKT2;1氨基酸序列同源性多在66%以上,核苷酸序列同源性都在75%以上。PutHKT2;1可能跨膜11次,二级结构分析表明,PutHKT2;1蛋白含有47.99% α-螺旋、5.13% β-转角、31.87%无规则卷曲和15.01%延伸链。PutHKT2;1基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析为进一步揭示小花碱茅拒盐的分子机制奠定了基础。     

紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化

柠檬酸合成酶是调节植物体内有机酸的活性酶之一,增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。通过从紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中克隆柠檬酸合成酶基因(MsCS),以期获得该基因全长,并为将来研究紫花苜蓿耐铝性以及对磷的吸收方向提供基础。首先利用cDNA末端快速扩增方法(RACE),克隆获得MsCS的cDNA全序列,然后利用pBI121构建植物超表达载体pBI-MsCS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。结果显示:该基因序列全长为2031 bp,开放阅读框1551 bp,编码517个氨基酸,与其他物种的柠檬酸合成酶具有高度的同源性。获得17株卡那抗性植株。经PCR检测有6株为阳性植株,初步表明该基因已整合到烟草的基因组中。     

圭亚那柱花草苗期抗旱性评价及抗旱种质鉴定

本研究用水培试验方法，分别在15%聚乙二醇6000（Polyethylene glycol，PEG-6000）模拟干旱胁迫5 d和14 d后对93份圭亚那柱花草（Stylosanthes guianensis Sw.）的枯叶率、相对叶绿素含量、相对含水量、净光合速率、气孔导度及蒸腾速率进行测定，运用相关性分析、主成分分析、隶属函数法等方法对圭亚那柱花草种质进行抗旱性综合评价并筛选抗旱种质。隶属函数抗旱能力排序表明，在处理的第5 d，71（CIAT10598），73（CIAT10347），72[Wangtingbiao（Qi）]，74（Graham），32（TPRC2001-54），39（TPRC2001-26），33[GC1480（IRRI）]和37（TPRC2001-14）等8份材料抗旱性最差，表现为干旱敏感材料；在处理的第14 d，91（TPRC2001-83），82（Nan02145），19（CIAT11362），59（Endeavour），67（Reyan No.2），80（CIAT87830），55（TPRC90033），45（TPRC L2），27（TPRC2001-68），5（TPRC2001-85），23（TPRC2001-20）和50[TPRC90005（1）]等12份材料表现出较强抗旱能力。根据隶属函数排名选取部分材料进行土壤条件下抗旱性验证，结果表明59（Endeavour）和23（TPRC2001-20）的抗旱性明显优于其它材料。本试验可为柱花草抗旱育种提供理论依据。     

地毯草铝响应基因AcABCG1的克隆与表达分析

铝毒抑制植物根系生长,是酸性土壤上限制作物产量的重要因素之一。ABC转运蛋白在金属离子转运和非生物胁迫应答等方面起作用。本研究以地毯草（Axonopus compressus）为材料,克隆了地毯草编码ABC转运蛋白AcABCG1基因,并对其进行了生物信息学和基因表达模式分析。结果表明,AcABCG1基因cDNA全长为2 434 bp,编码811个氨基酸残基,蛋白分子量为91.85 kD。亚细胞定位预测表明AcABCG1定位于细胞质膜上。定量PCR结果发现,金属铝（Al）、镉（Cd）和镧（La）处理均能显著增强AcABCG1基因在地毯草根系中的表达。不同铝浓度和时间处理进一步表明了AcABCG1基因在转录水平上响应铝胁迫。此外,AcABCG1基因在根中的表达量显著高于茎和叶中的表达量,且AcABCG1基因主要在0~1 cm根尖中表达。本研究结果为进一步挖掘AcABCG1基因参与地毯草耐铝毒的生物学功能奠定基础。     

非洲狗尾草4品种在滇南的品比试验

在滇南雨养条件下,对4个非洲狗尾草（Setaria sphacelata）品种进行区域性品比试验。结果表明：参试各品种适应性强,均未染病,存活率和越冬率都在98.61%以上。种植第1年TPRC010的干草产量最高,为27.68 t·hm^-2。用灰色关联法进行综合评价,TPRC001表现最优,TPRC010次之。     

13份柱花草品系生产性能比较

为筛选出性状优良的柱花草(Stylosanthes)品种,2011-2014年对13份柱花草品种(系)的株高、存活率、茎叶比、抗炭疽病能力、干草产量、种子千粒重和产量及养分进行测定分析,并采用隶属函数法对其综合生产性能进行评价。结果表明,13份柱花草品系初花期在9~(-1)1月;TPRC2001-84柱花草植株存活率最高(72.6%),TPRC 2001-81其次(56.6%);13份柱花草品系均较抗柱花草炭疽病;TPRC 2001-84柱花草年均干草产量最高(15 968kg·hm-2),TPRC2001-81和热研20号其次(12 206和12 724kg·hm-2);TPRC 2001-85柱花草种子产量最高(56.7kg·hm-2);热研21号柱花草粗蛋白含量最高(21.57%),热研20号和热研21号柱花草粗脂肪和磷含量较高,热研20号(CK)柱花草钙含量最高,TPRC 2001-85柱花草钾含量最高。TPRC 2001-84、热研21号、TPRC 2001-85和TPRC 2001~(-1)柱花草的综合生产性能较优,适于在热带亚热带地区推广种植。     

盐胁迫下磷素对沟叶结缕草生长及Na+和K+含量的影响

采用水培法研究了盐胁迫(300 mmol/L NaCl)下不同浓度磷素(0,1,5,20 mmol/L)对沟叶结缕草生物量以及钠钾离子调控方面的影响。结果表明,缺磷和盐胁迫均抑制了沟叶结缕草的生长。在磷和盐的双重胁迫下,并没有表现出叠加效应。在缺磷环境下,缺磷对植物生长的抑制比盐胁迫的影响更大。不管有无盐胁迫,随培养液中磷素浓度增加,沟叶结缕草的生长受到促进,但在20 mmol/L 磷浓度处理时植株的生长反而受到一定的抑制。适量磷素促进了沟叶结缕草的根系生长,有提高叶片Na⁺分泌量,抑制Na⁺从根系往叶片的运输,减低叶片Na⁺的积累,提高K⁺的吸收和选择性运输,增加叶片K⁺积累的趋势,但相关指标并不显著。同时提高了叶片K⁺/Na⁺,促进了植物的生长。     

东方山羊豆4香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)基因的克隆和荧光定量表达分析

东方山羊豆(Galega orientalis L.)是20世纪末引种到我国的牧草品种,为发掘其基因资源,本实验克隆出东方山羊豆4 CL基因,并深入研究4 CL基因对东方山羊豆抗逆性的影响,为今后东方山羊豆在我国的种植和应用奠定基础。结果表明:采用RACE技术结合RT-PCR方法从东方山羊豆中获得一个编码4 CL基因的cDNA全长序列,命名为Go4CL。该序列全长1916 bp,开放阅读框1653 bp,编码510个氨基酸。利用Real-Time PCR方法检测发现,Go4CL基因在东方山羊豆的根中表达量最高,叶中表达量最少。在PEG、ABA、MeJA、SA胁迫处理下Go4CL基因的表达量均有不同程度的上调,说明此基因在植物抵御干旱、病菌侵袭和机械损伤等胁迫过程中能够起到调控作用。     

过表达长穗偃麦草EeHKT1；4基因增强拟南芥抗旱耐盐性分析

植物高亲和性K⁺转运蛋白基因（HKT）编码K⁺、Na⁺转运或K⁺-Na⁺共转运质膜通道蛋白,在植物抗逆过程中发挥重要作用。为了研究长穗偃麦草EeHKT1;4（GenBank： KF956112.1）的功能作用,构建了EeHKT1;4过表达植物表达载体转化拟南芥,进行拟南芥转基因植株的抗旱耐盐性评价分析。结果显示,正常生长条件下野生型（WT）与转基因株系的主根长度无差异,NaCl与甘露醇处理下WT和转基因株系根的生长受到抑制,转基因株系根长度均大于同等胁迫条件下（WT）的根长;正常生长条件下WT与转基因株系表型无显著差异,但在NaCl与甘露醇处理下WT表现出叶片萎缩和植株枯黄,转基因株系仅部分植株表现出叶片萎缩,同一胁迫条件下转基因株系的植株存活率皆高于WT。硝基氮蓝四唑（NBT）与二氨基联苯胺（DAB）染色结果显示,正常生长条件下WT与转基因株系叶片染色相对较浅,随着NaCl与甘露醇浓度提高,所有叶片染色程度逐渐加深且同等胁迫下WT染色程度高于转基因株系。以正常生长条件下基因的表达量为对照,随着NaCl浓度的增加,AtSOS1基因在WT和转基因植株中逐渐上调且在转基因中的表达量高于WT;AtNHX1基因在NaCl处理下上调表达且转基因植株中表达量低于WT,除转基因株系L5外并未检测到WT和转基因株系自身因NaCl浓度的提高AtNHX1基因表达量发生改变;在甘露醇处理下,AtRD29B和AtP5CS1基因均上调表达且转基因植株中表达量高于WT。综上所述,EeHKT1;4过表达降低了逆境胁迫下拟南芥中超氧阴离子和H₂O₂的积累,诱导抗逆基因上调表达,增强拟南芥抗旱耐盐性。     

遮阴胁迫对麦冬和多年生黑麦草根际土壤细菌群落结构和多样性的影响

为探究麦冬（Ophiopogon japonicus（Linn.f.）Ker-Gawl.,缩写为OJ）和多年生黑麦草（Lolium perenne L.,缩写为LP）根际土壤微生物群落对遮阴胁迫的响应机制,本试验利用Illumina HiSeq2500测序平台,以16S rRNA基因为标靶进行相关研究。结果表明：遮阴改变OJ和LP土壤中硝态氮、铵态氮、全磷、全钾、速效钾和速效磷含量;遮阴显著改变OJ和LP根际土壤细菌群落组成,但是对其多样性影响不显著;OJ和LP根际土壤中变形菌门（Proteobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）为主要优势菌群,相对丰度分别为26.34%~35.23%,19.79%~24.24%和19.03%~24.49%,19.20%~32.96%。遮阴导致OJ根际土壤中变形菌门、绿弯菌门（Chloroflexi）和疣微菌门（Verrucomicrobia）的丰度降低,而LP根际土壤中其相对丰度显著高于OJ。相关性分析表明：土壤速效钾、全氮是影响OJ根际土壤细菌群落结构的主要原因,而铵态氮、硝态氮、全氮是影响LP根际土壤细菌群落结构的主要原因。因此可得出,遮阴改变了OJ和LP土壤的理化性质,改变了其根际土壤中优势细菌类群组成,而植物本身对土壤细菌群落组成的影响强于遮阴胁迫。