鲫鳃出血病2种病原菌的分离及鉴定

从患有鳃出血病的鲫鳃组织分离出2种革兰氏阴性杆菌,并进行形态特征及16S r RNA基因序列分析。结果显示,这2种病原菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。体外溶血试验结果显示,2种菌对鱼的红细胞都有较强的溶血作用,且维氏气单胞菌的溶血速率明显高于阴沟肠杆菌。人工感染试验显示,这2种菌都具有较强的毒力,两者混合感染比单独感染致病率更高;但单独感染时阴沟肠杆菌比维氏气单胞菌引起的鳃出血症状更明显。5种常用水产药的耐药性结果表明两种菌都有一定的耐药性,但是维氏气单胞菌的耐药性更强。     

双重PCR在创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytious)快速检测中的应用

建立双重PCR方法检测海产品中的创伤弧菌(Vbrio vulnificus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytious)。针对创伤弧菌和副溶血弧菌的gyrB基因的不同位点设计引物,前者扩增片断的大小为968bp,后者扩增片断的大小为284bp。共对三种海产品进行了创伤弧菌和副溶血弧菌的检测,结果在部分海产品中能特异性地检测到目标菌株。该方法快速,灵敏度高,特异性强。为海产品的创伤弧菌和副溶血弧菌的检测提供了有效的方法。     

温和气单胞菌PCR快速诊断方法的建立

根据NCBI公布的温和气单胞菌(Aeromonas sobria)丝氨酸蛋白酶的基因序列,设计并选取一对能够快速而准确地检测温和气单胞菌的PCR引物,建立PCR快速检测体系,并对患病的鱼组织进行检测。研究结果表明,使用设计的引物能够扩增出与预计大小相符合的131 bp的特异性片段,具有较好的检测特异性,对靶标DNA的检测灵敏度为1.0 pg/20μL,对温和气单胞菌的检测灵敏度为50 cfu/20μL。样品的检测结果与实际发病情况一致,表明本研究成功建立了温和气单胞菌常规PCR检测体系,该体系可以用于温和气单胞菌的诊断和样品的检测。     

应用多重PCR检测水生动物源气单胞菌安徽分离株的毒力基因型分布

粘附素(aha1)、气溶素(aerA)和细胞兴奋性肠毒素(alt)是气单胞菌的主要毒力因子。根据aha1、aerA和alt基因序列设计三对引物建立了可同时检测三种毒力基因的多重PCR方法(MPCR)。该方法扩增出气单胞菌的aha1大小为1087bp,aerA为721bp,alt为480bp,其敏感度为102CFU·mL-1。而对金黄色葡萄球菌、恶臭假单胞菌、拟态弧菌以及非致病性气单胞菌均未扩增出任何条带。用限制性内切酶EcoRⅤ、BamHⅠ和FbaⅠ分别酶切PCR扩增产物,均获得与预期一致的酶切图谱。用建立的MPCR对15株水生动物源气单胞菌安徽分离株进行毒力基因检测,结果显示在13株致病性气单胞菌中10株细菌的毒力基因型为alt aha1 aerA ,2株为alt aha1-aerA-,1株为alt aha1 aerA-;alt、aha1和aerA基因在气单胞菌中的携带率分别为100%、84.62%和76.92%。表明气单胞菌安徽分离株的主要毒力基因型是alt aha1 aerA 的高毒力表型,alt毒力基因普遍存在于不同表型种气单胞菌中。     

异育银鲫病原温和气单胞菌表型及分子鉴定与溶血素基因检测

2008年10月江苏盐城大丰精养异育银鲫（Carassius auratus gibelio) 发生严重疾病,从病鱼肝脏、血液及腹水中分离到优势生长的细菌。对分离做纯培养的4株菌(JY081016-1至JY081016-4)进行形态特征、理化特性等表型生物学性状检验;测定了菌株（JY081016-1）的16S rRNA和gyrB基因序列,分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树。结果表明分离菌对供试健康异育银鲫有强致病性,菌株（JY081016-1）所扩增的16S rRNA基因序列长度为1448bp（GenBank 登录号：GQ232759）,所扩增的gyrB基因序列长度为1177bp（GenBank 登录号：GQ232760）,其16S rRNA和gyrB基因序列与GenBank数据库中维氏气单胞菌和维氏气单胞菌温和生物型的16S rRNA和gyrB基因序列相似性均在97%以上;根据分离菌的表型及分子特征,判定分离鉴定的4株菌为温和气单胞菌（Aeromonas sobria）。胞外酶及溶血活性检测表明分离菌均能产生蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶,在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血;设计的特异性引物可扩增出溶血素基因。     

豚鼠气单胞菌快速检测间接ELISA法的建立

应用从患败血症的鳗鲡中分离、纯化出的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)菌株AB40511NA1,制备了兔抗血清,建立了快速检测豚鼠气单胞菌的间接ELISA方法.研究结果显示:AB40511NA1兔抗血清的效价为1:16000.该法对AB40511NA1最低检测量为6×104 cfu·mL-1;与水产养殖动物主要致病菌嗜水气单胞菌(A. hydrophila)、温和气单胞菌(A. sobria)、鳗弧菌(V. anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)及非O1-群霍乱弧菌(Non-O1 Vibrio cholerae)均无交叉反应,特异性强;能快速、准确、方便地检测出豚鼠气单胞菌.     

病原性鳗弧菌(Vibrio anguillarum)双重PCR与LAMP检测方法的建立

本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的22株病原鳗弧菌(Vibrio anguillarum)毒力相关基因的携带情况,并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以PCR方法检测8个毒力相关基因的分布,结果显示,22株病原鳗弧菌均可扩增出6个基因(empA、vah1、vah4、flaA、rtxA和tonB)目的条带,未扩增出virA和angM基因;针对vah4和rtxA设计引物进行双重PCR扩增,同一PCR反应体系可扩增出两条目的条带,灵敏度为2.4×103 CFU/ml,对照菌无任何扩增条带;以vah4设计引物进行LAMP扩增,病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带,呈现阳性反应,6株对照菌无阶梯状扩增条带且呈现阴性反应,LAMP扩增灵敏度为2.4×101 CFU/ml。LAMP检测灵敏度是双重PCR的100倍,LAMP技术与PCR比较,操作简便、快速、灵敏度高且不需昂贵仪器,LAMP检测鳗弧菌的方法更适合于养殖生产实际应用。     

2株海水鱼源潜在益生菌的分离、鉴定及特性分析

为筛选用于微生态制剂研发的海水鱼源益生菌,本研究对海捕野生许氏平鲉(Sebastes schlegelii)和大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)的消化道内壁黏膜样品进行细菌分离纯化,获得80株可培养细菌。使用选择性培养基对菌株的产酶能力进行测定,选取海水鱼常见病原菌为指示菌测定分离菌株产物的抑菌活性,筛选出2株潜在益生菌TS2和TH8,并进行菌株的生理生化检测、16S rDNA序列分析、生长特性及其对宿主安全性的研究。结果显示,TS2产蛋白酶(protease)、淀粉酶(amylase)和脂肪酶(lipase),其无菌培养产物可显著抑制鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harvey)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)的生长。TH8产蛋白酶和脂肪酶,其无菌培养产物可显著抑制鳗弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌、假交替单胞菌、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、金黄色葡萄球...     

黄颡鱼暴发性流行病病原的分离鉴定及其3种毒力基因检测

为查明黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)暴发性流行病的病原菌及其3种毒力基因的携带情况,以常规方法进行细菌分离,人工感染试验确定病原菌的致病性,API 20NE和16S rRNA基因序列分析进行细菌鉴定,PCR扩增法检测病原菌的3种毒力基因。结果显示,从发病症状典型的黄颡鱼肝脏中分离到1株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)GXGP1,与嗜水气单胞菌标准株ATCC 7966T的同源性为99.9%,对黄颡鱼有很强致病力,是引起黄颡鱼暴发性流行病的病原菌,该菌携带有Aer、hly和ahp 3种毒力基因。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体病原肠杆菌PCR检测技术的建立与应用

根据罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体培育期主要细菌性病原阴沟肠杆菌omp A基因序列、产气肠杆菌gry B基因序列设计特异性引物,通过对PCR扩增产物进行测序鉴定与特异性和敏感性试验,建立了两种病原菌的PCR快速检测方法,并对发病样品进行了检测。结果显示,设计的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌检测引物能分别扩增出与预计大小一致的385 bp和201 bp的特异性片段,与其余供试菌株无交叉反应。两种检测方法的灵敏度分别为103 CFU/ml和102 CFU/ml。罗氏沼虾幼体样品的检测结果与实际发病情况一致,建立的检测方法也可直接对样品进行PCR检测,而无需细菌分离培养。本研究建立的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌PCR检测方法具有较高的特异性与灵敏度,可缩短检测时间,该方法的建立对罗氏沼虾幼体病原的快速诊断、分子流行病学的调查及无特定病原(SPF)群体的建立具有重要意义。     

患病蝶尾金鱼维氏气单胞菌温和生物变种的分离鉴定

研究从患病蝶尾金鱼(Butterfly)肝脏中分离获得的1株病菌,为金鱼疾病防治提供参考。分离纯化获得1株细菌,编号为DW-1,通过细菌形态观察、理化特性、16S rDNA序列分析等方法进行鉴定。结果表明DW-1菌株为革兰氏阴性短杆菌,可发酵葡萄糖产气,赖氨酸脱羧酶、硝酸盐还原等为阳性;进一步通过PCR方法扩增16S rDNA序列,测得长度为1 385 bp,与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)相似性为99%~100%;构建系统发育树与维氏气单胞菌温和生物变种(A.veronii biovar sobria)模式菌株ATCC9071聚为一支。最终鉴定该菌株为维氏气单胞菌温和生物变种。人工感染试验结果表明,对斑马鱼半数致死量(LD_(50))为1.17×10~6CFU/m L。药敏试验结果显示该菌株对头孢克肟、头孢哌酮、链霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、左氟沙星、复方新诺明等23种药物敏感。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

龟致病性维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌双重PCR检测方法的建立

应用2对特异性引物,通过对反应条件和体系的优化,成功建立了能快速检测维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌两种病原的双重PCR方法。研究结果表明,该方法特异性强,仅对龟鳖维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌有扩增,而对其他龟鳖常见病原无扩增;该方法对维氏气单胞菌最低检测核酸质量浓度为1.75×10-3 ng/μL,对鲍曼不动杆菌最低检测核酸质量浓度为3.96×10-3 ng/μL,检出率较传统检测方法高。该研究所建立的双重PCR方法灵敏度高、特异性好,可为临床龟鳖维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌感染的诊断和流行病学调查等提供帮助。     

基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR检测病原灿烂弧菌

灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。     

贝类派琴虫PCR检测方法的建立及初步应用

根据派琴虫的基因保守序列设计了特异性引物,对派琴虫的DNA进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序.结果表明,扩增大小为596bp,与预期扩增序列同源性为99.8%.该PCR方法检测灵敏度高,最低可检测1pg的派琴虫DNA;特异性强,对荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌、副溶血孤菌、沙门氏菌、诺瓦克样病毒等贝类病原体的扩增均为阴性.用该PCR技术对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,阳性率分别为14.6%、10.6%和15.0%.结果显示,派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可用于贝类派琴虫的临床快速检测.     

黄金鲫温和气单胞菌鉴定及溶血素基因检测

采用常规的培养特征、理化特性及分子生物学的方法,从患病的黄金鲫体内分离到的优势菌YD-1进行了回感试验、表观生物学、药敏试验及毒力因子检测等系统性研究。结果表明,该菌在盐度1-3%、PH4-9,温度10-30℃的营养肉汤培养基中均能生长。该菌株16S rRNA基因序列（GenBank收录号: KC561935, 长度1446bp）和gyrB基因序列（GenBank收录号: KC561934, 长度1169bp）分别与其他气单胞菌属细菌的基因同源性相思似在97%-99%之间,构建系统发育树确定该菌株为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。人工回感试验可引起健康银鲫死亡。对该菌毒力因子进行检测,可扩增出溶血素基因片段。药敏试验显示：该菌对多粘菌素、头孢呋辛、米诺环素、复达新、菌必治、新霉素等6种药物敏感。     

用nested—PCR方法快速检测鲑鱼肾杆菌

描述了用嵌套式聚合酶链式反应(nested PCR)快速检测鲑鱼细菌性肾病病原鲑鱼肾杆菌的方法。以BKDR和BKDF为引物,扩增鲑肾杆菌编码57kDa主要可溶性蛋白基因中501bp的DNA片段,再用引物BKDR2和BKDF2扩增其中长度为314bp的DNA片段。用其它15种常见鱼类致病菌验证这两组引物的特异性,结果没有非特异性的DNA片段被扩增出来。用酚抽提法和煮沸加冻融的方法获得的细菌裂解产物,PCR检测的灵敏度均可达到1.8×103CFU·mL-1,用Nested PCR进一步扩增PCR扩增的产物,检测灵敏度可再提高100倍。检测鲑鱼肾杆菌菌悬液与鲟卵的混合物,结果表明,该方法能准确、可靠、快速地检测鲑肾杆菌。     

日本沼虾细胞自噬基因ATG13和ATG101的克隆及其低氧胁迫下表达分析

为研究自噬相关基因(autophagy-related genes, ATG) ATG13和ATG101在甲壳动物应答低氧胁迫过程中的调节作用,实验采用RACE PCR技术通过克隆测序和基因序列拼接,首次克隆了日本沼虾的细胞自噬基因ATG13和ATG101的全长cDNA序列,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13 cDNA全长2 043 bp (NCBI登录号为MT084347),包括211 bp的5′末端非翻译区(untranslated region,UTR),449 bp的3′UTR和1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),开放阅读框编码460个氨基酸;ATG101 cDNA全长1 051 bp(NCBI登录号为MT084348),包括18 bp的5′末端非翻译区,373 bp的3′UTR和660 bp的开放阅读框,开放阅读框编码219个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13富含高度保守的LC3作用结构域(LIR);系统进化树分析显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13与凡纳滨对虾ATG13具有最近的亲缘关系;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)实验分析发现,日本沼虾ATG13和ATG101在其肝胰腺和脑组织表达量较高,而在肌肉中表达量较低;利用qRT-PCR追踪其在肝胰腺组织低氧胁迫过程中出现的表达差异情况,结果显示,实验组日本沼虾在低氧胁迫6和24 h时,其细胞自噬基因ATG13和ATG101表达量显著高于对照组,而在复氧12 h后,实验组与对照组的ATG13和ATG101表达量差异不显著;Western blot分析结果显示,日本沼虾ATG13和ATG101表达丰度基本与基因表达模式相似。透射电镜分析结果显示,在低氧胁迫6和24 h后,肝胰腺组织中的溶酶体开始出现自噬空泡,表明急性低氧胁迫会诱导自噬体的形成,本研究结果可为了解日本沼虾应对低氧胁迫下的调控机制提供理论参考。     

圆口铜鱼维氏气单孢菌的分离鉴定及药敏试验

从濒死圆口铜鱼的脾和肾病灶部位分离优势菌,进行纯化分离并开展生理生化鉴定、16S r DNA序列分析以及常用抗生素药物的药敏性筛选,以期丰富圆口铜鱼病害防治的基础资料。分离出的1株优势菌在BHI固体培养基上长出表面光滑的灰白色圆形菌落,边缘整齐、不透明、稍隆起;序列长度为1 399 bp,与维氏气单孢菌的同源性为100%,与维氏气单孢菌(KT964297.1;KJ650080.1;KM362731.1)聚为一支,置信度99。结合菌落形态特征和生理生化特征,鉴定菌株为维氏气单孢菌。该菌株对氟苯尼考等7种药物敏感,对利福平中度敏感,对新霉素等9种药物耐药。