产苦马豆素疯草内生真菌Undifilum oxytropis原生质体的制备和再生

以产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis NX-FEL001为供试菌株,研究了培养方式、菌龄、酶解时间和酶解温度等,对U.oxytropis原生质体制备和再生的影响。结果表明,U.oxytropis菌丝在质量分数为10g/L纤维素酶+10g/L蜗牛酶+1g/L溶壁酶组成的复合酶溶液,35℃恒温,80r/min振荡孵育3h左右,原生质体释放量最高;原生质体在YCM培养基上,22℃培养9d可以再生形成菌落,培养15d其再生率可达8.5%;原生质体在YCM培养基上再生后其菌落颜色与野生型U.oxytropis不一致,呈现白色;菌丝形态与野生型U.oxytropis相一致,经检测再生后菌丝仍然能够产生苦马豆素。U.oxytropis原生质体的制备,将为进行疯草内生真菌的遗传转化和基因操作研究提供重要工具,为进一步开展疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机制奠定了基础。     

冻融过程对绵羊精子ATP酶活性的影响

为了充分发挥和提高优良种公羊的利用率,提高绵羊冻融精液品质,试验采用酶动力学分光光度法对冷冻保存前后小尾寒羊精子和精清中ATP酶活性变化进行研究。结果表明:冷冻保存小尾寒羊精子中ATP酶活性(83.76±3.53)U/m L与冷冻前(175.42±4.32)U/m L相比极显著降低(P0.01),精清中ATP酶活性(164.96±3.22)U/m L与冷冻前(73.51±2.23)U/m L相比极显著升高(P0.01);冷冻前后精子活率与精子ATP酶活性均呈极显著正相关(r=0.979和0.968,P0.01)。说明冻融过程对绵羊精子中ATP酶的活性造成了严重损伤。绵羊冻融精子ATP酶的活性可以在一定程度上预测精子活率,并可作为绵羊精液品质评价的重要指标。     

高产纤维素酶真菌的筛选鉴定与紫外诱变选育研究

试验旨在拟从腐朽木材和腐质土壤中获得1种高效的纤维素酶生产菌，利用紫外线诱变技术对其进行改造。采用刚果红染色法和酶活性试验，筛选出2株纤维素酶产率较高的菌（菌株HS5、菌株1）。经形态学和分子鉴定，菌株HS5为黄曲霉（Aspergillus flavus），菌株1为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。在固体产酶培养基中，以水稻秸秆为唯一的碳源，28℃培养4 d后，HS5滤纸酶（FPA）的酶活为306 U/g，羟甲基化纤维素（CMC）的酶活为592.2 U/g；菌株1的FPA酶活为214.2 U/g,CMC酶活为523.8 U/g，表现出了较好的降解纤维素的能力。紫外诱变处理得到产酶能力提高的突变菌株为UR-07和URM-13。与原始菌株相比，UR-07的FPA和CMC酶活分别比原始菌株HS5提高了15.86%、16.68%,URM-13的FPA和CMC酶活比菌株分别提高了26.94%、19.03%。研究表明，经紫外诱变后，产纤维素酶真菌的产酶能力有所提升且具有较好的遗传稳定性，两株菌株在纤维素酶的生产和纤维素类物质降解菌剂的研究中具有较高的潜力。     

灵芝漆酶在黑曲霉中的重组表达及发酵条件优化

【目的】 在黑曲霉（A.niger）中重组表达灵芝L菌漆酶基因，并对其发酵条件进行优化，旨在获得一株高产灵芝漆酶的黑曲霉基因工程菌。【方法】 从灵芝L菌克隆漆酶基因Lac-L，并根据黑曲霉密码子偏好性进行优化。选用黑曲霉糖化酶启动子（PglaA）、信号肽及终止子为表达原件，以米曲霉pyrG基因为筛选标记，构建漆酶表达盒，采用聚乙二醇-CaCl₂法将其转化至黑曲霉X1（ΔpyrG）原生质体中。对转化子进行PCR验证及固态发酵酶活测定，筛选高产漆酶重组菌株，并对阳性转化子固态发酵培养基碳源、无机与有机氮源比例、Cu²⁺浓度及发酵时间进行优化。【结果】 经尿嘧啶缺陷及含2，2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2，2'-azinobis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt），ABTS）培养基筛选获得25株重组漆酶转化子，酶活复筛获得灵芝漆酶异源表达6号重组菌株，发酵72 h酶活可达3 532.6 U/kg，宿主菌株的酶活仅为58.37 U/kg。重组6号菌优化后的最适固态发酵条件为：以麸皮为基础培养基，添加2%麦芽糖、2%（NH₄）₂SO₄、0.25 g/L CuSO₄，发酵60 h时重组菌株产漆酶活力最高，达到6 255.47 U/kg。【结论】 在黑曲霉中成功实现灵芝L菌漆酶基因Lac-L的异源表达。     

高产淀粉酶枯草芽胞杆菌的诱变选育和酶学性质研究

为了提高产淀粉酶枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis N21的酶活,试验采用紫外线对该菌株进行诱变,并对该淀粉酶的部分酶学性质进行了研究。结果表明,淀粉酶酶活由出发株的32.96 U/mL增加到86.24 U/mL,比原菌株酶活提高了161.65%。该酶的最适反应温度为35℃,最适pH值为7.0,在30~40℃,pH值为5.0~8.0条件下较稳定。Ca2+和Mn2+对酶有激活作用,Cu2+、Zn2+对酶有抑制作用,而Mg2+、Fe2+对其影响较小。说明筛选出1株产酶活性较强的突变菌株。     

纤维素酶高产菌株的选育

从土样中分离筛选出12株产纤维素酶能力较强的菌株。经摇瓶发酵复筛,获得产纤维素酶活较高且稳定的菌株F6,其CMC酶活为887 U/mL,滤纸酶活为210.72 U/mL。以该菌株为出发菌株,经紫外线诱变处理,获得纤维素酶高产菌株4-2-2。将菌株4-2-2摇瓶发酵4 d后,产CMC酶活达3171.598 U/mL,滤纸酶活达1827.372 U/mL,分别比出发菌株提高3.58倍和8.67倍。     

复合诱变选育高产β-葡聚糖酶菌株

以黑曲霉SD16为出发菌株,经紫外线和N 注入诱变处理,选育高产β-萄聚糖酶菌株.结果表明:紫外线的最佳照射时间为10min,N 最佳注入剂量为70×2.6×1012 N /cm2;突变高产菌株AN1的β-葡聚糖酶酶活由出发菌株SD16的493.2 U/mL提高到902.5 U/mL.且突变菌株AN1经传5代培养,产酶性能稳定.     

产植酸酶枯草芽孢杆菌诱变选育方法的研究

通过对产植酸酶枯草芽孢杆菌进行不同方法的诱变处理,确定最佳诱变条件.对产植酸酶的枯草芽孢杆菌进行筛选,然后采用紫外(UV)、亚硝基胍(NTG)、UV-NTG和NTG-UV4种方法对其进行诱变.UV诱变(100 s)选育的Z3菌株植酸酶活性最高(71.96 U/mL),比筛选出发菌株提高38.46％.结果表明:UV (100 s)选育方法为最佳的诱变条件.     

应用原生质体融合技术构建纤维素发酵产油脂菌株的试验

原生质体融合(protoplast fusion)技术是将遗传性状不同的亲本原生质体融合杂交的基因重组技术。从健康桑树根系中分离到一株产油脂内生真菌MOD-1,采用酶解方法制备内生真菌MOD-1和产纤维素酶菌株绿色木霉TP4、T44及长柄木霉TL的原生质体,获得4个菌株的原生质体产量分别为7.02×10~6个/m L、4.43×10~6个/m L、6.35×10~6个/m L和4.35×10~6个/m L,再生率分别为4.90%、3.26%、4.51%和4.12%。优化亲本原生质体灭活条件为:MOD-1菌株经紫外线照射10 min或加热15 min,TP4菌株经紫外线照射25 min或加热20 min,T44菌株经紫外线照射25 min或加热25 min,TL菌株经紫外线照射30 min或加热25 min。在上述条件下各亲本原生质体的灭活率均达到100%。将灭活的MOD-1菌株原生质体分别与不同方式灭活的TP4、T44、TL菌株原生质体融合,经初筛和复筛获得了一株兼具MOD-1与TP4双亲优良性状的融合菌株MP-1,其油脂产量、油脂含量(质量分数)分别为0.082 4 g/L、14.46%,显著高于亲本菌株MOD-1。融合菌株MP-1传代培养10代后,油脂产量与油脂含量的遗传稳定性分别达到92.84%和95.00%。     

适用于制备对虾发酵饲料的益生芽孢杆菌复配组合的筛选和评价

为克服芽孢杆菌单株菌株在水产动物发酵饲料应用上的局限性和优化对虾颗粒饲料发酵条件,本试验通过对优选芽孢杆菌菌株进行配伍组合,使用福林酚法、3,5-二硝基水杨酸法和DNS法分别进行蛋白酶、淀粉酶以及纤维素酶活性的定量测定,将选出的酶活性较高的菌株,通过16S rDNA序列信息鉴定定种,并将各菌株进行配伍,以3种酶活性为指标优选最优组合。制备发酵对虾饲料,以酶活性为指标优化加水量、接种量、颗粒大小以及通气量。结果表明:在9种芽孢杆菌组合中,蛋白酶活性最高的组合为8-Z,酶活性为(28.58±0.34)U/mL、淀粉酶活性最高的组合为3-Z,酶活性为(5.58±1.10)U/mL、纤维素酶活最高的组合为3-Z,酶活性为(34.53±7.41)U/mL。菌株组合8-Z(包含解淀粉芽孢杆菌1-D、枯草芽孢杆菌3-D和枯草芽孢杆菌9-D)制备对虾发酵饲料的适宜参数为:加水量1 mL/g,接种量0.5×107～1.5×107 cfu/g,充气量20 mL/g,发酵时间24 h,在此条件下发酵后活菌数为6.48×108 cfu/g。     

木质素降解菌的筛选及其漆酶性质研究

为筛选产漆酶的木质素降解菌,采用愈创木酚平板法和RB亮蓝平板法进行菌株筛选,利用16S r DNA序列分析对菌株进行鉴定,通过液体发酵培养对漆酶活性和木质素降解能力进行研究。将漆酶基因cot A克隆到表达载体p ET-32a(+)上获得重组质粒p ET-32a(+)-Cot A并转化到BL21中进行表达,通过酶活测定将表达条件进行优化。结果:从白蚁肠道中成功筛选出1株产漆酶的木质素降解菌,鉴定为枯草芽胞杆菌。漆酶的最适酶活温度为60℃,最适酶活p H为3.5~4.0;0.2 mmol/L Cu2+可诱导菌株漆酶的产生,缩短了产酶时间并提高了酶活性。菌株木质素降解率在液体发酵培养24 h后达到了17.1%。漆酶基因大小为1 542 bp,表达的重组蛋白为85 ku,属于有活性的可溶性蛋白。在IPTG浓度为1mmol/L、Cu2+浓度为0.3mmol/L、诱导时间为9 h的条件下,漆酶蛋白活性可达到113.10 U/L。研究表明,本试验成功筛选出1株降解木质素能力较强的枯草芽胞杆菌,获得可分泌较高活性漆酶的重组菌,为木质素酶在畜牧业生产实践上的应用奠定了基础。     

黑曲霉固态发酵饲用复合酶酶活分析

通过NTG和γ射线等物理化学手段诱变获得的产酶霉菌 ,其固态发酵的产物通常都是含有多种酶活性的复合酶。准确分析这些酶蛋白的活力及其在不同 pH值条件下的稳定性对于产品应用于实际生产是很有必要的。黑曲霉是美国FDA和我国农业部认证的安全菌株。黑曲霉mafic -0 0 5在固态发     

饲料用脂肪酶产生菌——黑曲霉G55高产菌株的选育

本研究以饲料用脂肪酶产生菌——黑曲霉(Aspergillus niger)G55为出发菌株,通过紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变,结合自然分离纯化,选育出了遗传稳定的高产菌株uan370(s)和uan783(s),其产酶量分别为2410 U/mL和2486 U/mL,相比出发菌株G55提高32.1%和36.3%。通过斜面连续传5代,证明两菌株的遗传稳定性良好。     

高产葡萄糖氧化酶菌株的分离鉴定及发酵条件优化

采集果园土样,采用梯度稀释涂布法及平板显色筛选法初步分离得到60株产葡萄糖氧化酶的菌株。采用Underbofler滴定法筛选出一株产酶性能较好的菌株GX-2,并采用正交设计对发酵培养基进行优化,在接种量为4%、温度为30℃、转速为180 r/min的条件下发酵5d酶活可达9.55U/m L。综合菌落形态、生长特性镜检形态及5.8S r DNA-ITS区序列系统进化分析证明所分离的菌株GX-2为黑曲霉(Aspergillus niger)。     

冷冻保存对绵羊精子乳酸脱氢酶活性的影响

为了研究冷冻保存对绵羊精液乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响,提高绵羊精液的品质,试验采用酶动力学分光光度法对冷冻保存前后绵羊精液、精清和精子中LDH的活性分别进行研究。结果表明:冷冻保存后绵羊精液LDH活性[(18.40±7.85)U/m L]和精子LDH活性[(5.91±2.16)U/m L]与冷冻前[(24.89±8.21)U/m L、(10.80±4.95)U/m L]相比均极显著降低(P0.01),而精浆中LDH活性则极显著升高(P0.01),冷冻保存对绵羊精液及精子中LDH的活性造成严重损伤。冷冻前后精子活率与LDH活性均呈极显著正相关(P0.01),LDH的活性可以在一定程度上预测精子活率,可以作为绵羊精液品质评价的新指标。     

蛹虫草菌株原生质体的制备方法试验研究

蛹虫草具有与冬虫夏草极相似的药理作用,可作为冬虫夏草代替品.本试验以蛹虫草菌株CM-1为出发菌株,结果表明蛹虫草菌原生质体制备的快速简便方法为:菌体液体培养96h,用0.6 mol/L甘露醇溶液作为渗透压稳定剂,取1g菌丝体以1∶20比例加入复合酶液,在pH6.8、28℃条件下酶解2.5h,获得原生质体数最多,达到5.08 × 108个/mL;原生质体再生培养基为含0.6 mol/L甘露醇PDA培养基,原生质体再生率最高为4.69％.     

糙皮侧耳原生质体制备与再生条件的研究

以糙皮侧耳为材料,研究酶的组成、酶解时间、酶解温度、菌龄和渗透压稳定剂对糙皮侧耳原生质体制备率和再生率的影响.结果表明:静置培养7d的糙皮侧耳菌丝体,以0.6 mol/L甘露醇溶液为渗稳剂,2％溶壁酶+2％纤维素酶+1％蜗牛酶酶体系30℃酶解3h,原生质体制备率为415万个/mL；培养9d的菌丝体以0.6 mol/L硫酸镁溶液作为渗稳剂,2％溶壁酶+2％纤维素酶+2％蜗牛酶,28℃酶解4h,原生质体最佳再生率为2.86％.     

利用原生质体诱变筛选植酸酶高产菌株

对产植酸酶的纯化黑曲霉用混合酶制取原生质体进行了研究。研究发现,经诱变后的原生质体在再生过程中菌落形态发生了明显变化,从中选育出了一株植酸酶的高产菌株,并对其遗传稳定性进行了鉴定。     

一株高产中性蛋白酶菌株的筛选与诱变

通过牛奶平板初筛、摇瓶复筛，从土壤中筛选出产中性蛋白酶菌株L01，以紫外线和亚硝酸钠为诱变条件，分别利用单因素和复合诱变方法提高菌株的产酶能力，最后对遗传稳定性良好的菌株L01F进行鉴定。结果表明：菌株L01分别经过紫外线照射60 s和亚硝酸钠处理12 min时，其中性蛋白酶酶活力最高，为459.13 U/mL，是原始菌株的2.07倍。在先亚硝酸钠处理12 min后紫外线照射48 s的最适复合诱变条件下，筛选得到的高产中性蛋白酶菌株L01F，酶活力达到577.87 U/mL，是原始菌株L01的2.61倍，且该菌株传代10次后仍具有良好的遗传稳定性。最后经过形态学和分子生物学鉴定，确定筛选出的菌株L01F为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。 [关键词] 中性蛋白酶|诱变|稳定性研究|枯草芽孢杆菌     

一株桑枝纤维降解菌株的鉴定及纤维素降解能力测定

利用高产纤维素酶微生物分解桑树枝条中的木质纤维素,有益于桑枝条资源的高效开发利用。采用刚果红染色法,将分离自桑园土壤的菌株经羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基初筛和桑枝粉培养基复筛后,获得1株能产生纤维素酶的真菌菌株PTY1。PTY1菌株能够在以桑枝粉末为碳源的培养基中良好生长,最适生长p H为6,最适生长温度为32℃。基于形态和18S r DNA序列鉴定PTY1为烟管菌(Bjerkandera adusta)。该菌株产生的纤维素酶类呈现较高的滤纸酶(FPAase)、羧甲基纤维素酶(CMCase)和β-葡萄糖苷酶活性,其中FPAase在发酵第8天的活力最高,可达5.466 U/m L,CMCase在发酵的第6天和第10天出现2个活力小高峰,β-葡萄糖苷酶活力总体较高,发酵第8天活力最高为12.220 U/m L;FPAase最适反应温度为40℃,最适反应p H为5.5,而CMCase在50℃、p H 4.5~5.5时活力较高,均为酸性酶;以CMC-Na为底物时PTY1菌株酶促反应的Km为0.676 mg/m L,Vmax为0.038 9 mg/(m L·min)。PTY1菌株经过诱变处理后,有望成为降解桑枝纤维素的专用菌株。