实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌方法的建立和应用

目的建立丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR检测方法。结果检测体系灵敏度高,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10fg和20CFU/反应体系;特异性好,对71株细菌的检测符合率达100%。20株沙门菌采取盲号模拟血培养标本进行血培养检测及鉴定,检出5株丙型副伤寒沙门菌和4株猪霍乱沙门菌,与试验的菌株相符。70份食品中用实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌均为阴性,而用传统方法分离培养未检出。结论建立的实时PCR检测方法可以快速、特异、灵敏地检测出丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。     

甲型副伤寒沙门菌套式PCR检测方法的研究

目的 探讨套式聚合酶链反应(Nested polymerase chain reaction,Nested-PCR)快速检测伤寒杆菌的实验方法。方法 根据副甲伤寒杆菌鞭毛抗原基因DNA核苷酸序列设计特异寡核苷酸引物，建立套式PCR技术，对1株伤寒杆菌及5株非伤寒杆菌进行扩增。结果 除副甲伤寒杆菌出现343bp的特异性扩增区带外，其他5株非伤寒杆菌均为阴性。结论 Nested-PCR是一种快速、敏感、特异检测伤寒杆菌的方法，为伤寒的临床早期诊断和及时治疗提供客观依据。     

沙门菌PCR检测技术应用进展

沙门菌是引起食物中毒的主要致病菌之一,其传统检测方法包括选择性培养、生化鉴定等步骤,耗时长、灵敏性差,很难满足快速检测要求。聚合酶链反应（PCR）技术是近年来广泛应用于食品中沙门菌快速检测的方法之一,其检测目的基因多种多样,主要包括属特异性引物基因、血清群特异性引物基因与血清型特异性引物基因。本文主要概述PCR技术应用于沙门菌检测的各种目的基因,并简要介绍常规PCR、多重PCR及实时定量PCR等技术的应用。     

荧光PCR对从业人员肠道致病菌筛查的评价

目的评价荧光PCR法用于食品及公共场所从业人员肠道致病菌的筛查。方法随机采集12780份从业人员肛拭子标本用荧光PCR检测,以传统分离培养方法作为“金标法”进行对照,分析灵敏性和特异性。结果在12780份标本中,荧光PCR检测出沙门菌阳性14份,阳性率为1.10‰,培养法检测出10份,阳性率为0.78‰,沙门菌荧光PCR检测法的灵敏度为100％,特异性为99.97％。荧光PCR检测出志贺菌18份,阳性率为1.41‰,培养法检测出3份,阳性率为0.23‰,志贺菌荧光PCR法的灵敏度为100％,特异性为99.88％。结论荧光PCR法灵敏度性高,特异性强,简便快速,为从业人员健康检查提供了一套快速的筛查方法,值得广泛推广应用。     

成都地区腹泻儿童伤寒和副伤寒沙门氏菌感染状况研究

目的分析成都市2012年1月至2017年12月腹泻儿童伤寒和副伤寒沙门菌感染的流行病学特征及耐药性,为食品安全控制及临床合理使用抗生素提供依据。方法对腹泻儿童72株肠道伤寒和副伤寒沙门菌进行血清分型及药敏试验。结果培养5934份粪便标本只检出伤寒沙门菌、乙型副沙门菌、丙型副沙门菌三种血清型72例(检出率1.2%),伤寒沙门菌、乙型副沙门菌、丙型副沙门菌检出率分别25%(17/72)、69.4%(50/72)、5.6%(4/72)。伤寒和副伤寒沙门菌检出率总体呈逐年增高趋势,乙型副伤寒从2014年开始上升,伤寒从2016年开始上升。伤寒和副伤寒沙门氏菌全年除1月和2月份外均有检出,主要分布在5～11月占91.7%(66/72),6～9月是检出高峰占65.3%(47/72)。0～6个月患儿感染率低于7月～6岁患儿(P均<0.01),差异有统计学意义; 3岁以下是伤寒和副伤寒沙门菌感染的易感人群占88.9%(64/72)。感染数男孩∶女孩=1.3∶1。伤寒和副伤寒沙门菌对氨苄西林、复方磺胺甲恶唑、环丙沙星、头孢噻肟耐药率分别为84.7%(61/72)、29.2%(21/72)、8.3%(6/72)、2.8%(2/72)。结论成都市儿童伤寒和副伤寒沙门菌感染呈逐年上升的趋势,以3岁以下为高发;乙型副伤寒沙门菌为主要血清型,其次为伤寒沙门菌;头孢噻肟敏感性较高,经验性用药首选头孢三代;临床医生应规范用药,改善卫生条件和习惯是目前当务之急。     

PCR检测法在沙门菌检测中的应用

目的探讨快速检测沙门菌的方法,分析PCR技术在沙门菌检测中的应用。方法对已用传统方法检测的沙门菌和非沙门菌采用PCR技术检测,对比分析两种方法的特异性、灵敏度和稳定性。结果 PCR检测技术检出时间比传统方法短,稳定性好,特异性强,灵敏度高,差异均具有统计学意义（P〈0.05）。结论应用PCR技术检测沙门菌特异性高,灵敏度高,可重复操作性好,方便、快捷,值得推广应用。     

用PCR扩增16SrRNA基因鉴定甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株

目的: 探讨甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株的检测与鉴定方法.方法:提取甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株及其亲代细菌型的染色体DNA,根据甲型副伤寒沙门菌的16SrRNA基因保守序列设计引物,进行PCR扩增,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳与分析.结果:甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株16SrRNA基因的PCR扩增产物16SrDNA,在230 bp处出现与其亲代细菌型一致的DNA条带和图谱.结论:甲型副伤寒沙门菌的细胞壁缺陷突变株虽然丧失了常规细菌学方法可检测的绝大多数表型特征,但采用聚合酶链反应方法检测该序列,有利于检测和鉴定不能自发返祖的细胞壁缺陷甲型副伤寒沙门菌.     

实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立

目的为实验树鼩微生物检测提供一种快速、简便、灵敏,并且特异性强的空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR检测方法。方法根据空肠弯曲菌的Hip O区域、沙门菌的in V区域和志贺菌的ipa H区域设计特异性引物和探针,并进行单病原定量PCR检测验证;后分析多重PCR的灵敏度和特异性,并使用该多重PCR方法检测实验树鼩样品。结果本研究的PCR要素可用于空肠弯曲菌、沙门氏菌及志贺菌等单种菌的实时荧光定量PCR扩增。多重定量PCR扩增出了空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺氏菌标准扩增曲线;该方法的灵敏度为1×103ng/μL;特异性检测未从其他参考菌株中检出阳性。结论该多重定量PCR方法在实验树鼩微生物检测中具有很好的应用和推广前景。     

沙门菌食物中毒论述

引起食物中毒的沙门菌属主要是鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌和猪霍乱沙门菌。此外，还有纽波特沙门菌、病牛沙门菌、都柏林沙门菌、山夫顿堡沙门菌、汤卜逊沙门菌、凯桑盖沙门菌、德尔卑沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、斯坦利沙门菌、鸭沙门菌、幕尼黑沙门菌等；，沙门菌在温度20～37℃繁殖最快，在水中可生存2—3周，在粪便中可生存1—2个月，在尘埃中可生存80天，在冰冻土壤中可过冬，     

一起由丙型副伤寒沙门菌引起的食物中毒检测分析

目的快速查找食物中毒原因。方法根据临床表现、流行病学调查制定实验室检测项目并作出检测。结果从剩余食物、患者肛拭及粪便中检出丙型副伤寒沙门菌。结论由实验室检测得知,该起食物中毒事件是由丙型副伤寒沙门菌引起。     

改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157：H7

目的建立改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157：H7的快速方法。方法根据GenBank公布O157：H7的rfbE保守序列，设计一对引物和改良分子信标探针，用FAM荧光剂标记探针的5’端，建立改良分子信标实时PCR检测O157：H7的反应体系，应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检测。结果共检测11种细菌。只有大肠杆菌O157：H7有荧光信号，其余10种全无荧光信号，且与其他细菌无交叉反应，DNA灵敏度为64fg，菌液灵敏度为59cfu／ml或2cfu／PCR反应体系。应用改良分子信标实时PCR反应体系检测10株O157：H7均出现特异的荧光信号，无干扰。对89份食品样品进行检测，5份O157：H7实时PCR阳性，其余样品为阴性，检测仅需2h。5份阳性样本，经传统方法培养，有3份检出大肠杆菌O157：H7。结论改良分子信标实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于大肠杆菌O157：H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

2005-2009年贵州省伤寒和副伤寒沙门菌耐药性分析

目的分析贵州省伤寒和甲型副伤寒沙门菌的耐药状况,为临床用药及防控提供依据。方法采用改良K-B法对伤寒、甲型副伤寒沙门菌株进行药物敏感试验。结果贵州省9个市(州、地)26个县(区)的113株伤寒沙门菌和518株甲型副伤寒沙门菌对10种抗生素进行药物敏感性测定。其中伤寒沙门菌除对C IP不耐药,对其余9种抗生素均有不同程度的耐药,甲副沙门菌仅对CFT、NAL、SMZ有不同程度耐药,耐药率达0.88%~95.95%,个别地区出现了对第三代头孢类药的多重耐药株。结论贵州省伤寒、甲副沙门菌耐药情况已较为严重,尤其是多重耐药菌可能会造成伤寒和甲型副伤寒的流行或暴发。加强耐药性监测,指导临床合理用药,对预防控制伤寒和甲型副伤寒具有重要意义。     

丙型副伤寒沙门氏菌噬菌体SPC-P1在不同血清型中的分布及整合位点分析

目的:确定丙型副伤寒沙门氏菌( Salmonella paratyphi C, SPC)噬菌体SPC-P1在其他血清型中是否存在,并确定其在宿主菌基因组中的整合位点. 方法:以丙型副伤寒沙门氏菌RKS4594基因组中SPC-P1为模板,设计6对引物,分别在11株伤寒沙门氏菌、11株甲型副伤寒沙门氏菌、12株乙型副伤寒沙门氏菌和23株丙型副伤寒沙门氏菌中进行SPC-P1片段的扩增. 同时下载美国国立生物技术信息中心( National Center for Biotechnology Informa-tion,NCBI)基因组数据库中全基因组序列完成的100株20个血清型的沙门氏菌全基因组序列,通过Mauve 2. 3. 1软件进行比对,以确定SPC-P1在各个血清型中的分布. 根据SPC-P1在RKS4594基因组中的整合位点,设计引物,对10株SPC-P1阳性的丙型副伤寒沙门氏菌进行扩增,并对产物测序,根据测序结果分析SPC-P1 整合情况. 结果:SPC-P1广泛存在于丙型副伤寒沙门氏菌基因组中,14株能够扩增到所有的6个片段,2株扩增到3~5个片段,所有扩增阳性的片段与预期大小吻合. 在伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌中,6个片段均阴性或仅存在1~2个片段,并且片段均比预期小. Mauve比对结果显示,仅在与丙型副伤寒沙门氏菌进化关系较近的猪霍乱沙门氏菌中存在接近完整SPC-P1的片段,但序列相似性存在差异. SPC-P1在丙型副伤寒沙门氏菌基因组中的整合位点是固定的,位于两个相邻基因 pgtE 和yfdC之间. 结论:SPC-P1是丙型副伤寒沙门氏菌独特的致病因子,其存在可能使得丙型副伤寒沙门氏菌的宿主范围、致病性大小等功能方面有别于其他沙门氏菌.     

分子信标探针技术检测沙门菌invA基因

目的 研究沙门菌的分子信标基因检测方法。方法 在PCR反应体系中加入分子信标探针，探针的5’端标记6-fluorescine(6-FAM)，3，端标记4-(dimethylaminophenylazo)benzoicacid(DABCYL)，对沙门菌invA基因PCR产物进行荧光检测。结果 肠炎沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌“H”、伤寒沙门菌和肠侵袋型大肠杆菌的荧光值分别为161.6、104．5、85．9、83．1、94．8、46，1，Ax值(样本荧光值-空白对照荧光值)分别为121．3、64．2、45.6、42．8、54．5、5.8,沙门菌的Ax值均大于21，结果阳性，与琼脂糖电泳分析结果一致。结论 分子信标探针技术可以准确、快速、简便进行沙门菌invA基因检测。     

分子信标探针技术检测沙门菌invA基因

目的 研究沙门菌的分子信标基因检测方法。方法 在PCR反应体系中加入分子信标探针,探针的5’端标记6-fluorescine(6-FAM),3’端标记4-(dimethylaminophenylazo)benzoic acid (DABCYL),对沙门菌invA基因PCR产物进行荧光检测。结果 肠炎沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌“H”、伤寒沙门菌和肠侵袭型大肠杆菌的荧光值分别为161.6、104.5、85.9、83.1、94.8、46.1,Ax值(样本荧光值-空白对照荧光值)分别为121.3、64.2、45.6、42.8、54.5、5.8,沙门菌的Ax值均大于21,结果阳性,与琼脂糖电泳分析结果一致。结论 分子信标探针技术可以准确、快速、简便进行沙门菌invA基因检测。     

分子信标荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌方法的初步研究

目的建立分子信标荧光定量PCR快速检测结核杆菌方法,为临床结核病的诊断提供特异性强、灵敏度高、可标准化、自动化的检测方法。方法根据GenBank数据库公布的结核分枝杆菌IS6110基因的保守序列,设计引物与分子信标探针,建立结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法;以10种细菌作对照分析该方法的特异性与灵敏度;应用已建立的方法检测结核分枝杆菌,评价其应用价值。结果所建立的分子信标荧光定量PCR检测10种细菌,只有结核分枝杆菌有荧光信号,与其他细菌无交叉反应,4拷贝/PCR反应体系的结核分枝杆菌都能有效检出。对100株结核分枝杆菌的检测结果为阳性,单一检测时间仅需2h。结论分子信标荧光定量PCR检测方法快速、灵敏度高、特异性强,可用于快速诊断结核病,为结核病的诊断与治疗提供新的检测手段。     

实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7

目的建立改良分子信标一双重实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌0157：H7,应用于细菌性食物中毒的快速诊断。方法根据GeneBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因序列和大肠杆菌O157：H7rfbE基因序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标一双重实时PCR检测体系。结果双重荧光PCR反应体系检测151株金黄色葡萄球菌和27株大肠杆菌O157：H7,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对8762份大便、食品等标本进行检测,315份标本金黄色葡萄球菌实时荧光PCR阳性,其中286份金黄色葡萄球菌培养阳性;31份标本大肠杆菌O157：H7实时荧光PCR阳性,其中26份大肠杆菌O157：H7培养阳性。从样品处理到检测结果仅需要时间2h～1d。结论改良分子信标-多重实时荧光PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7食物中毒的快速诊断和肠道传染病的初筛,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

生物素-亲和素酶联免疫吸附试验系统检测兔抗伤寒杆菌抗体的实验研究

以国产生物素(B)及亲和素(A)试剂,初步建立了检测免疫血清中抗伤寒杆菌H及O抗体水平的BA—ELISA系统。检出抗H及抗O抗体的敏感性(以GMT计),较常规ELISA高6～7倍;较传统的肥达氏试验高11～22倍。除与副伤寒甲、乙及伤寒Vi血清有轻度交叉反应外,与其他各种菌的抗血清均呈阴性.丁不同天对8份阳性血清经6次重复试验,所得变异系数均<11％,提示本试验系统稳定性良好。