新月细柱藻的分离培养及形态和分子鉴定

自胶州湾分离培养2株微藻(MGB0401和MGB0402)。经形态学鉴定为新月细柱藻(Cylindrotheca closterium)。MGB0401和MGB0402的18S核糖体RNA基因(rDNA)扩增片段长度为1775 bp,存在10个碱基差异。MGB0401和MGB0402的rbcL基因扩增片段长度为1190 bp,有45个碱基差异,对应的氨基酸序列存在4个氨基酸残基差异。系统学分析表明,2株微藻与已知新月细柱藻相应序列亲缘关系最近。微藻常用系统学分析用基因的序列不仅是分类鉴定的补充指标,也是不同研究结果相互比较的重要基础。     

黄海西部细弱刚毛藻（刚毛藻目，绿藻门）的表型可塑性与分类——暗示基因序列作为DNA条形码的可行性

由于广泛的形态可塑性，导致刚毛藻属物种的分类仍存在不确定性。作为分布较广的物种之一，细弱刚毛藻已报道了许多变异类型，这为对其鉴定造成了困难。针对这个问题，本研究通过采集于黄海西部相似于细弱刚毛藻的9个样品，分析了它们的形态多样性。一些样品具有明显的可变鉴定特征，难于利用形态分类准确鉴定。因此，采用18S rDNA和 ITS序列对它们进行了分子鉴定。其中，样品的18S rDNA序列相似度为99.6%-100%，而ITS的为98.7% -100%。分子数据强烈地支持了形态可变的样品可准确定位为细弱刚毛藻。通过对样品分类特征的比较分析发现，作为分类标准的分枝方式和密度、藻体颜色、藻体高度和质地受环境影响和藻体成熟度而发生较大变化。此外，作为相对稳定的特征，细胞大小在种内水平上也常发生变化。18S rDNA和ITS序列在本种鉴定上的成功应用，表明以DNA条形码为基础的基因序列分析可作为传统形态分类学强有力的辅助方法。     

利用ITS-5.8S rDNA序列对2株海洋亚历山大藻进行的分子鉴定

扩增2株分离自青岛胶州湾、从形态上初步确定为亚历山大藻属(Alexandrium sp. qd2, Alexandrium sp. qd3)的5.8S 核糖体基因(5.8S rDNA), 转录单元内间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS) 序列、部分18S rDNA和28S rDNA序列.通过blastn比对、系统进化树以及遗传距离分析将A.sp.qd2和A.sp.qd3鉴定为A.catenella,且属于A.catenella 的不同株型.     

新月细柱藻（Cylindrotheca closterium）种复合体研究

研究并建立采自胶州湾的11株大小存在差异的新月细柱藻单克隆培养体系。对其核编码的SSU rDNA基因和叶绿体编码的rbcL基因进行了克隆和测序。序列分析表明，11株C．closterium的SSU rDNA基因和rbcL基因存在很大的序列变异。依据rhcL基因核苷酸序列推导的氨基酸残基变异则明显小于核苷酸变异。分别通过两基因核苷酸序列构建的邻接（Neighbor joining，NJ）系统发育树将11株C．closterium分成相同的6个分支（clade）。通过SSU rDNA基因构建的NJ树将所有的细柱藻聚为一支。SSU rDNA基因NJ树将细柱藻分为2个明显的支系（lineage）：支系Ⅰ由12株C．closterium组成，包括本实验分离到的全部11株C．closterium，该支系中部分节点没有得到较高的支持率（〈50％）；支系Ⅱ包括2株C．closterium和1株C．fusiformis。在rbcL基因NJ树中细柱藻也形成2个支系，11株C．closterium组成1个支系，系统树中每个节点均得到很高的支持率（〉70％）。统计分析表明，支系Ⅰ中株系间的平均遗传距离高于其它微藻种的种内变异程度，差异极显著（P〈0．01）。上述分析结果证实C．closterium实际上是1个种复合体（species complex），可以被细分为若干个种。     

一株桑沟湾赤潮藻的分子鉴定

2011年5月山东荣成桑沟湾近海海域暴发赤潮,其规模在桑沟湾历史上罕见,较严重地影响了该海域水产动物的人工养殖。本文作者分离得到了赤潮暴发过程中海水里的一株优势种,并对其核糖体18S RNA基因(18S rDNA)和转录单元内间隔区(ITS)进行了序列扩增和分析。依据这两种序列构建的系统进化树都显示这株藻与卡罗藻Karlodinium veneficum(=K.micrum)完全聚在一起,因此推断出其应为K.veneficum,是一种常见有害赤潮藻。本文是卡罗藻在桑沟湾海域暴发的首次报道。     

中国沿海亚历山大藻(Alexandrium)核糖体rDNA部分序列分析及该藻属分子系统进化研究

分析了几株自南海及东海分离的亚历山大藻的rDNA部分序列信息,其中包括核糖体大亚基(LSU)rDNA的5′端D1-D2区序列,以及5.8SrDNA和ITS区序列;同时也对实验室保种的部分来自其它国家和地区的亚历山大藻相关序列进行了测序和分析,并以此作为序列分析中的参考。采用ClustalX及MEGA2软件对所得到的序列信息进行了综合分析与对比。结果表明,分离自南海的塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)和分离自东海的链状亚历山大藻(A.catenella),即便是在ITS区和LSUrDNA等高变区,其序列信息也完全一致。与基因库中搜索到的其它亚历山大藻rDNA序列信息相比较,中国沿海的塔玛/链状亚历山大藻序列更接近于塔玛复合种的“亚洲温带”基因型。对于分离自南海的另外两株未定种的亚历山大藻,通过对比序列信息,发现它们与相关亚历山大藻(A.affine)非常接近。分离于我国台湾地区的微小亚历山大藻(A.minutum)在序列上与分离自新西兰的藻株相似,而与分离自欧洲的微小亚历山大藻藻株相差较大。中国沿海亚历山大藻rDNA序列信息的获得为针对有毒藻种设计特异性核酸探针,发展灵敏快速的生物检测技术奠定了基础。     

鼠尾藻(Sargassum thunbergii)对邻苯二甲酸二甲酯(DMP)胁迫的响应

邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)是近海环境有机污染物之一,不仅对海洋生物造成毒害,且能在生物体内富集和放大,对海洋生态系统形成严重威胁。本文以鼠尾藻(Sargassum thunbergii)为研究对象,通过测定比生长速率、叶绿素a含量、光合和呼吸速率、光合基因rbcL转录水平上的相对表达量等指标,研究了鼠尾藻对不同浓度DMP的响应。结果表明,低浓度的DMP(0.lmg/L)短时间内(≤15d)能促进鼠尾藻的生长和叶绿素a的合成,并使藻体的光合作用增强,诱导光合基因rbcL的表达,而在高浓度DMP(≥0.3mg/L)的作用下,鼠尾藻的生长速率、光合和呼吸速率、rbcL基因的表达量均随着暴露时间的延长呈明显下降趋势,且DMP浓度越高,降幅越大。以上研究结果对了解DMP对鼠尾藻胁迫的影响机制奠定了基础,为保护海洋经济藻类的养殖环境提供了理论依据。     

串珠藻目植物rbcL基因的适应性进化分析

淡水红藻是藻类植物进化中的一个重要类群,其中最主要的类群是串珠藻目。核酮糖1,5二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是一种既负责碳同化又引发光呼吸,在植物光合作用中起重要作用的酶,其催化固定CO_2的活性中心位于Rubisco大亚基,由叶绿体rbcL基因编码。为了探究串珠藻目植物适应特殊生存环境的分子水平机制,本文选取了串珠藻目及一些相近类群淡水红藻的rbcL基因39条,利用PAML4.8软件,运行位点模型、分支模型及分支-位点模型,对选取类群的rbcL基因进行了适应性进化分析。结果表明:(1)通过最大似然法构建的系统发育树显示,所有内类群聚集为6个分支,其中,分支A为暗紫红毛菜,分支B为胶串珠藻,分支C为扁圆串珠藻,后验概率同样为100%,分支D为熊野藻属,分支E为连珠藻属,分支F为弧形西斯藻;(2)分支-位点模型中,在3个分支中分别鉴定出350S、277L和280L为正选择位点;(3)在构建出的Rubisco大亚基的参考三维模型中,277L和280L位于Rubisco大亚基羧基末端保守的8个α螺旋和8个β片层构成的α/β桶状结构域中第7个α螺旋和第7个β片层之间的loop结构上,350S位于羧基末端邻近α/β桶状结构域的一个α螺旋上。研究结果一方面显示了基于ω比值检验基因适应性进化的准确性和有效性,另一方面也揭示了串珠藻目植物rbcL基因确实发生了适应性进化,对串珠藻目适应特殊生存环境产生了有益的作用。     

4株米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)藻际异养细菌的分离鉴定

采用分子生物学方法,对分离的米氏凯伦藻4株藻际异养细菌进行分子鉴定和功能分析。结果表明,经16S rRNA序列分析,4株藻际异养细菌分别隶属于Formosa、Erythrobacter、Shewanella和Marinobacter四个属,P1菌株与Formosa的16S rRNA核苷酸序列的同源性为95%,P2、P3和P4菌株与Erythrobacter、Shewanella和Marinobacter的同源性在99%以上。通过4株异养细菌及其同源性大的24株细菌构建进化树得出,28株细菌在系统发育树中主要分成4个分支,与同源性分析相符。     

北部湾涠洲岛红色赤潮藻的分子鉴定

为了弄清北部湾涠洲岛6株疑似红色赤潮藻（Akashiwo sanguinea）株的种类，作者采用光学显微镜和荧光显微镜对其进行形态学初步鉴定；并对藻株SSU rDNA、LSU rDNA和ITS序列测序，利用最大似然法构建系统发育树。结果表明，北部湾涠洲岛6株藻与红色赤潮藻形态特征基本符合；3种序列系统发育树分析均发现北部湾涠洲岛6株藻与不同海域来源的红色赤潮藻聚在同一大分支上，自展值高达99、100、100；与来自亚洲海域的韩国安山株、新加坡株、中国厦门港株序列差异最小，亲缘关系最近，而与其他地理来源的红色赤潮藻序列差异大，亲缘关系较远。红色赤潮藻SSU、LSU、ITS种内遗传距离分别为0.001~0.008、0.003~0.025和0.045~0.406，明显小于该藻与其他裸甲藻科（Gymnodiniaceae）藻属下的种间遗传距离0.032~0.072、0.165~0.222和0.589~1.559，因此可确定北部湾涠洲岛6株藻均为红色赤潮藻。研究结果将为北部湾海域赤潮生物来源与组成、赤潮的发生与管理提供基础信息。     

10种蟹类18S rDNA 和COⅠ基因序列分析及其分子系统发育研究

应用分子系统发育学的方法,以蟹类18S rDNA和线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(COⅠ)基因序列片段为分子标记,结合形态学特征对10种蟹类的分类地位进行探讨。实验共获得10 条18S rDNA序列,长度为1780~1787 bp,其中A、T, G,C平均含量分别为23.72%, 24.58%,24.52%和27.17%;通过序列对比,发现18S rDNA序列相对保守,只含有1个从88 bp 到130 bp 约 50 bp的高可变区;物种间碱基距离比较小,从0.001到0.017。18S rDNA系统发育树为方蟹总科、沙蟹总科和梭子蟹总科起源于同-海洋蟹类祖先提供了分于生物q证惦,开上火亚N内尔量分别为26.88%.弓蟹科。获得的5条CO Ⅰ基因序列,长度均为709 bp,A、T,G、C平均含量分别为26.88%,37.62%,17.50%和18.00%;COⅠ基因片段变异性高,物种间碱基距离从0.016到0.138。COⅠ基因系统发育树真实地反映了住属各物种之间的进化关系,和传统分类非常吻合,为形态特征相似的姆类鉴定提供了-种快速准确的方法。     

基于16S rDNA和看家基因序列分析技术的鲍鱼养殖水体弧菌种类的鉴定

采用TCBS选择性培养基从厦门某鲍鱼养殖场的养殖水体中分离到19株细菌.经16S rDNA序列分析,所有菌株均属于弧菌属（Vibrio）,且与最近似的弧菌模式种的同源性都在98.99%以上.由于弧菌种间16S rDNA序列相似度极高,无法仅靠16S rDNA序列比对来鉴定这些菌株到种的水平.16S rDNA序列的系统发育分析也显示,大多数菌株与弧菌模式种无法归为一簇,表明16S rDNA基因在弧菌种的分类鉴定上分辨率不高.进一步采用基于4种看家基因（rpo A、pyr H、gap A和top A）的多位点序列分析技术（MLSA）对分离到的弧菌菌株进行分类鉴定,结果显示19株海洋弧菌归于溶藻弧菌（Vibrio alginalyticus）与魔鬼弧菌（Vibrio diabolicus）2个种,表明这两种弧菌是该鲍鱼养殖场水体环境中的优势弧菌种,在鲍鱼养殖弧菌病害防治方面需要重点关注.此外,看家基因与16S rDNA基因的多态性分析表明,4种看家基因的多态位点比率均高于16S rDNA.4种看家基因串联后的多态位点比率高达41.1%,远高于16S r DNA基因的13.4%,表明看家基因相较于16S rDNA基因有着更高的分辨率,更适合于海洋弧菌的分类鉴定.     

泰国近海习见有毒立方水母和钵水母的遗传分析

本研究利用线粒体16S rDNA和核基因18S rDNA片段,对泰国沿海常见的有毒水母进行遗传分析,并比较了2个基因片段作为通用分子标记,在研究水母类多个纲的遗传多样性中的应用。研究发现,泰国近海的有毒水母存在较高的遗传多样性,所获得的32个样品可以分为9个种,包括4种钵水母、4种立方水母和1种水螅水母。然而,完全确定各种的分类地位,还需要更多的形态、生活史等方面信息。两个基因片段均能明确区分各种类,但核基因18S序列比线粒体基因片段更为保守。根据16S基因片段序列计算水母种内和种间的K2P(Kimura 2-parameter)遗传距离,发现所研究的9个水母种类,种内遗传距离在0~0.050之间,其中94%的种内遗传距离小于0.040,同纲种间的遗传距离为0.204~0.474,其中91%的种间遗传距离大于0.250;而利用18S基因,种内距离在0~0.002之间,同纲种间距离为0.008~0.066(平均为0.038,SE=0.006)。16S的AT碱基含量明显高于核基因18S,且16S的碱基含量在不同纲之间有显著差异,进一步表明水母线粒体16S基因的突变率相对较高,适合研究水母较低分类阶元以及种下的遗传差异。     

胶州湾浮游桡足类18S核糖体RNA基因(18S rDNA)扩增及序列变异初步研究

采用PCR扩增、文库构建、限制性片段长度多态性分析、序列分析和系统学分析等方法，初步研究了夏季胶州湾上层海水浮游桡足类核糖体小亚基RNA基因(18S rDNA)约1．5kb片段的序列变异。从浮游生物混合DNA中选择性扩增桡足类18S rDNA，建立桡足类18S rDNA变异类型文库，并从文库中随机挑选的30个克隆进行分析。结果表明，Vsp Ⅰ限制性内切酶能将这些克隆分成频率分别为0．17、0．23和0．6的3种操作分类单元(OTUs)，遗传多样性指数达到0．95。3条OTU代表克隆序列与甲壳纲桡足亚纲核苷酸差异数在75．4—97．8之间，而与其他亚纲的差异都高于100。3条OTU代表克隆序列均属于桡足亚纲，其中，AY437861和AY437862属于哲水蚤目。3条OTU代表克隆序列可分为2个高变异区和3个相对保守区，其GC％分别为47．37％、48．16％和48．57％。研究结果表明，混合DNA提取方法简单，设计的引物可选择性地扩增浮游桡足类18S rDNA，根据18S rDNA序列序列变异描述浮游桡足类多样性是可行的。研究结果也为在浮游桡足类分类中引入18S rDNA序列奠定了基础。     

基于18S和ITS-5.8S rDNA基因序列的白色霞水母(Cyanea nozakii)的分子鉴定与检测

采用通用引物PCR扩增法,测定了辽东湾海域的白色霞水母(Cyanea nozakii)螅状体、碟状体及水母体的18S以及ITS-5.8S r DNA序列,同时利用Gene Bank数据库中已有同源序列对其进行序列分析及系统分析。结果显示,白色霞水母3个个体的18S和ITS-5.8S r DNA序列完全一致。白色霞水母样品的ITS-5.8S r DNA序列与Gen Bank中未知真核生物的序列高度相似(≥99%),推测该物种可能是早期发育阶段(卵、浮浪幼虫或碟状体)的白色霞水母样品。霞水母属不同种间18S r DNA序列经比对后同源序列长度为1709bp,多态位点数33个;比对后ITS1同源序列长度为368bp,其中变异位点203个,简约信息位点数178个,单变异位点21个。基于18S r DNA基因序列的霞水母属种内和种间平均遗传距离分别为0、0.008,而基于ITS1序列的霞水母属种内和种间平均遗传距离分别为0.019、0.284。基于ITS1的种间遗传距离是种内遗传距离的15倍,适合于进行物种鉴定。NJ系统树的结果也表明同种的不同个体各自聚枝,其聚类结果大致与形态分类吻合。研究表明,ITS基因片段在霞水母不同种间变异较大,更适于大型水母种类鉴定、检测及属内种间水平的系统进化研究。     

长臂缨鲆核糖体RNA基因序列多态性特征分析

为了解鲽形目Pleuronectiformes鲆科Bothidae长臂缨鲆Crossorhombus kobensis (Jordan & Starks, 1906) 核糖体RNA基因的序列多态性特征, 本研究共获得该鱼类包括18S、5.8S、ITS1和ITS2全长及28S部分序列的128条克隆序列。经序列比对、聚类分析以及重组检测, 结果显示5.8S (158bp) 无长度变异, 而其他4个基因片段则表现出较高的长度多态性, 并可分为不同序列类型: 18S (1856~1893 bp) 有4种序列类型A、B、C和R; 28S (967~974bp) 和ITS1 (407~ 505bp) 均有3种类型A、B和R; ITS2 (423~447 bp)存在2种类型A和B。此外5个基因片段在碱基组成中均表现出GC偏倚, 并且ITS2 (71.14%)>ITS1 (65.37%)>28S (62.22%)>5.8S (57.67%)>18S (54.95%)。对具有不同序列类型的18S、28S和ITS进行真、假基因推断时, 通常的判别特征不足以提供有力依据, 因此增加了与4种鲆科近缘鱼类长冠羊舌鲆Arnoglossus macrolophus、青缨鲆Crossorhombus azureus、大鳞短额鲆Engyprosopon grandisquama以及冠毛鲆Lophonectes gallus相应基因片段的比对。各基因片段的插入/缺失以及特异性碱基差异位点比对结果显示: 18S和28S的短序列类型A与4种鲆科鱼类序列一致, 而其他序列类型则不同; ITS1序列类型A与4种鲆科鱼类在类型B的缺失位点均无缺失, 因此推测18S、28S和ITS1的A类型为真基因, 而其他类型为假基因。ITS2的A和B类型在差异位点上与4个鲆科鱼类不存在一致性, 没有足够的依据对两个类型做出真、假基因的推断。长臂缨鲆核糖体RNA基因中, 5.8S序列最为保守遵循协同进化的方式, 而其他4个基因片段为非协同进化的方式。     

三株赤潮硅藻5.8SrDNA及转录间隔区(ITS)的克隆及序列分析

对引发赤潮的3株硅藻——1株尖刺拟菱形藻(Pseudo-nitzshia pungens)和2株中肋骨条藻(Skeletonema costatum)的5.8SrDNA和ITS(internal transcribed spacers)序列进行了PCR扩增、克隆和序列测定,并分析了硅藻门10株赤潮藻(7株从GenBank获得)的系统进化关系.研究结果表明,尖刺拟菱形藻的ITS和5.8SrDNA的长度为693bp,SK-1(分离自东海赤潮暴发区)测序得到715bp,除ITS和5.8SrDNA外,还包含部分18SrDNA和28SrDNA;SK-2(分离自青岛养殖场)的ITS和5.8SrDNA的长度为331bp,尖刺拟菱形藻与从GenBank中获得的2株尖刺拟菱形藻相似程度最高,为100%,与该属的多列拟菱形藻相似程度稍低,为82.9%.SK-2的ITS序列与SK-1的相似程度很低,只有51%,但与拟中肋骨条藻的ITS序列相似程度高,为95.5%.SK-1的ITS序列与拟中肋骨条藻的相似程度也低,为56.7%.系统进化树反映的结果与相似性反映的结果一致.研究的该株尖刺拟菱形藻从根据ITS序列研究的结果与形态鉴定的结果看是一致的;SK-2可能属于拟中肋骨条藻;SK-1比较特殊,有待于用其他的方法进一步研究确定其分类地位.     

线纹舌鳎(Cynoglossus lineolatus)18S rRNA基因长片段复制:不等交换模型(unequal crossing over model)罕见的分子证据

尽管18S rRNA基因序列极其保守,但是在一些种类中仍然发现其存在序列多态性。本研究在线纹舌鳎18S rRNA基因中发现了3种差异显著的序列类型（Type A,B和C）,说明其为非协同进化,而不是严格遵循协同进化方式。基于以上三种类型序列GC含量、二级结构、最小自由能等差异,我们推测Type A和B可能是假基因类型。此外,在Type A类型中还发现了一段长达189 bp的重复序列。据我们所知,如此长的重复序列,这在硬骨鱼类核糖体基因中还是首次报道。通过比较分析产生重复序列常见的模型,我们认为不等交换模型最有可能解释该重复序列的形成。本研究结果不仅为不等交换模型提供了罕见的分子证据,而且为鱼类18S rRNA基因研究奠定了很好的基础。