单克隆抗体SZ-95亲和色谱纯化人血小板第4因子

目的用单克隆抗体亲和色谱从人血小板破碎液中纯化血小板第 4因子 (PF4 )。方法将单克隆抗体SZ 95 IgG与溴化氰活化的Sepharose 4B凝胶连接成亲和色谱柱SZ 95 IgG Sepharose 4B ,人血小板破碎液经此亲和色谱柱上样后 ,经洗脱获得PF4 ,采用 15 %SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度 ,用点印迹鉴定其免疫活性。结果SZ 95 Sepharose 4B亲和色谱柱的偶联率为 72 % ,每 1ml(约 1× 10 9个血小板 )血小板破碎液中可以纯化到PF4 18μg ,其相对分子量约为 12kD ,经点印迹显示与单抗SZ 95反应显带。结论用SZ 95 Sepharose 4B亲和色谱柱纯化的PF4产品得率高、纯度高、活性好     

免疫增强剂B淋巴细胞刺激因子的研制

目的克隆人B淋巴细胞刺激因子 (BLyS)胞外区 12 8 2 85氨基酸cDNA ,并行高效表达、纯化及功能鉴定。方法提取HL 6 0细胞总RNA ,经RT PCR扩增编码人BLyS胞外区 12 8 2 85氨基酸的cDNA ,行序列测定后 ,构建于高效原核表达载体pQE 80L ,经IPTG诱导表达 ,Ni NTA色谱纯化 ,进而行免疫学活性检测。结果RT PCR扩增得到了 4 77bp的DNA片段 ,序列分析与GenBank中报道的编码BLyS 12 8 2 85的cDNA序列一致 ,并在大肠杆菌中获得了高效表达 ,Ni NTA色谱纯化后 ,活性检测发现它能刺激小鼠脾淋巴细胞增殖。结论成功克隆了人BLyS胞外区cDNA ,并获得了高效表达及纯化 ,纯化产物具有生物学活性     

重组人白介素21的原核表达与体外活性研究的优化

为了构建重组人白介素21(rhIL-21)原核稳定表达和体外活性检测系统,采用Overlap-PCR法合成目的基因;经双酶切整合至pET28,化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)构建pET-28a-rhIL-21 BL21(DE3)原核表达系统;胞内表达的包涵体经镍亲和层析色谱柱纯化后,尿素缓冲液梯度透析复性,最终溶于PBS缓冲液;双抗体夹心法ELISA、Western blotting检测复性蛋白的生物活性;细胞增殖抑制试验(MTT法)研究rhIL-21对Jurkat细胞株和HuT102细胞株的作用。实验成功建立了rhIL-21表达纯化与活性评价体系,为进一步研究IL-21的促免疫性疾病发展和抗肿瘤活性奠定了基础。     

FITC标记胰岛素的合成、纯化及表征

目的以异硫氰酸荧光素(FITC)标记胰岛素(INS)制备荧光探针FITC-INS,并对FITC-INS进行纯化、结构鉴定及活性分析。方法 FITC通过共价结合标记INS分子,投料比为3∶1,采用Sephadex G-25凝胶滤过色谱柱分离和纯化FITC-INS,质谱法进行结构鉴定,通过测定血糖值评价FITC-INS的生物活性。结果荧光标志物FITC-INS纯度较高,与游离INS相比,FITC-INS降血糖效果无显著性差异,保留了INS的生物活性。结论本研究所制备的荧光探针FITC-INS纯度高且生物活性良好。     

舟山眼镜蛇毒细胞毒素的分离纯化及其体外抗肿瘤活性

目的从眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素 F(CTX F)并鉴定其活性。方法应用凝胶过滤、离子交换柱色谱及疏水柱色谱等方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化CTX F ,以SRB法观察CTX F对体外培养癌细胞的杀伤作用。结果眼镜蛇毒粗毒经凝胶过滤获得 4个蛋白峰 ,将CTX所在第Ⅳ峰用阳离子交换柱色谱获A、B、C、D、E、F和G等7个组分 ,其中E、F和G具CTX活性 ,将F组分再经凝胶过滤和疏水色谱进一步纯化得不含磷酯酶A2 (PLA2 )的CTX纯品 ,暂定名为CTX F ,它对多种癌细胞株有杀伤作用。结论应用凝胶过滤、离子交换和疏水色谱等方法可从眼镜蛇毒中获得不含PLA2 的CTX ,其组分F有抗肿瘤活性     

大肠杆菌分泌表达重组人肝再生增强因子的纯化、鉴定与活性研究

目的建立一种大肠杆菌分泌表达型重组人肝再生增强因子(rhALR)的纯化工艺,并对产品进行鉴定和活性研究。方法通过沉淀、色谱等方法的条件优化,建立纯化工艺,通过电泳、HPLC、N-末端氨基酸测序、免疫杂交、同位素掺入、全波长扫描等方法对纯化产品进行鉴定和活性测定。结果建立了rhALR的纯化工艺路线,40%(NH4)2SO4沉淀,Butyl-S FF疏水色谱,CM-S FF离子交换色谱,Superdex-75分子筛色谱纯化,重组蛋白质的纯度大于95%。该蛋白质稳定存在的形式为二聚体,其单体的相对分子质量为15 000。该蛋白质结合辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),对损伤后的肝细胞具有明显的促进作用,明显优于以包涵体形式表达的rhALR。结论从大肠杆菌分泌表达体系能分离纯化得到高纯度、具有生物学功能和活性的rhALR,是潜在的临床治疗肝病药物。     

菌株SIPI-2013406的次级代谢产物分离纯化与菌种鉴定

利用阴离子交换色谱和反相C18色谱柱纯化菌株SIPI-2013406的代谢产物,获得纯度高于98％的化合物样品.采用质谱和核磁共振鉴定结构,推测该产物为富马酰-L-丙氨酸.产生菌经过形态和分子特征鉴定,确定菌株SIPI-2013406为产黄青霉种(Penicillium chrysogenum).     

流动相中加SDS测定rhIL-2(Ⅰ)纯度

目的建立在流动相中加十二烷基硫酸钠(SDS)测定rhIL-2(Ⅰ)纯度的分析方法,用于rhIL-2(Ⅰ)的质量控制.方法 Protein-Pak色谱柱,流动相为0.1mol·L-1磷酸盐-0.1mol·L-1氯化钠缓冲液,pH7.0(含0.02%SDS),检测波长为280nm.结果理论板数为2810,精密度RSD为1.13%.结论本方法精密度高,重复性和耐用性好,可用rhIL-2(Ⅰ)的质量控制.     

一种快速分离纯化金葡萄球菌肠毒素C2的方法

目的 建立一种简单快捷的方法,用来从金黄色葡萄球菌的发酵液(以下简称金葡液)中纯化分离肠毒素C2(staphylococcal enterotoxin C2,SEC2).方法 金葡液首先经超滤浓缩,之后再分别经阳离子交换层析和阴离子交换层析进行选择性分离SEC2,用SDS-PAGE电泳、HPLC法检测纯度及相对分子质量,飞行质谱测定精确分子质量,对其进行N -端氨基酸序列分析.结果 分离得到的SEC2电泳纯及色谱分析纯度均达到质量分数98%以上,经各项理化指标检测均与文献一致,在等电点上表现出微不均匀性,等电点pI 为7.49和6.74,该蛋白的分子质量为27.58 ku,N -端氨基酸序列分析与文献报道的SEC2序列一致(ESQPDPTPDELHKSS),最大吸收波长为277.5 nm.结论 用该方法得到的SEC2纯度高,回收率质量分数高达50%,适宜于大批量制备SEC2.     

B43-12侧孢短芽孢杆菌A60菌株产新型抗菌肽的分离纯化及其特性

侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus)A60菌株产一种新型抗菌肽,分子量为1 602.046 9,从种植芒果的土壤中分离纯化而得。经过硫酸铵沉淀、HiTrap SP HP柱阳离子交换色谱、TLC和HPLC这4步分离步骤,得到一个抗菌活性多肽,命名为BL-A60。该肽的完整氨基酸序列测定结果显示该肽含有11个氨基酸残基:亮氨酰-酪氨酰-赖氨酰-亮氨酰-缬氨酰-赖     

重组人白细胞介素-15包涵体离子交换柱复性与稀释复性的比较

目的比较重组人白细胞介素-15 (rhIL-15 )包涵体蛋白稀释复性法与离子交换柱复性法的效果。方法采用离子交换柱吸附变性包涵体蛋白,用含有复性剂的洗脱液洗脱复性,所得蛋白质比活和稀释复性法所得比活比较。结果两种方法所得目的蛋白质比活相近,但离子交换柱复性法目的蛋白质回收率高,试剂消耗少。结论对于rhIL-15包涵体,离子交换柱复性法用于生产,可大幅降低生产成本     

重组人白细胞介素-18的高浓度复性、纯化和活性检测

目的摸索大规模生产重组人白细胞介素 18(rhIL 18)高效简便、成本低廉的生产工艺。优化rhIL 18高浓度下最优复性、纯化方案 ,建立快速准确的活性检测方法。方法采用液相色谱和光谱学方法检测复性效率 ,筛选确定rhIL 18最优复性条件 ,再用SepheroseFFANX阴离子交换柱结合分子筛HiPrepSephacrylS 10 0进行纯化。采用3 H 掺入法检测rhIL 18产品对人外周血单个核细胞的促增殖作用 ,用流式细胞术检测其促γ 干扰素生成能力。结果建立了一套rhIL 18复性、纯化、活性检测方案。结论液相色谱和光谱学方法相结合 ,可用于检测rhIL 18的复性效率 ,流式细胞术也可用于检测rhIL 18的生物活性。     

Purification of PEGylated Protein Using Membrane Chromatography

N-terminus-specific PEGylation was used to produce mono-PEGylated lysozyme. However, some di- and tri-PEGylated proteins were also produced due to side chain reaction. The reaction products were characterized by chromatographic and electrophoretic methods. Commercial cation exchange membrane Sartobind S was used for chromatographic purification of PEGylated lysozyme, the basis of separation being the shielding of protein charge by PEG. Using the membrane chromatographic method, lysozyme and mono-, di-, and tri-PEGylated lysozyme could be resolved into separate peaks. Increasing the superficial velocity during chromatographic separation from 24 cm/h to 240 cm/h increased both protein binding capacity and resolution due to enhancement of protein mass transfer coefficient.     

蛋白质的吸附色谱分离和应用技术

就蛋白质的大规模色谱分离技术及其介质的特点结合蛋白质分子性质作了介绍，并阐述了为蛋白质纯化选用最佳色谱分离技术与介质的基本准则。     

果菠萝蛋白酶用TiO2多孔陶瓷柱层析结合超滤法纯化的研究

将TiO2、粘土、SiO2、CaCO3及活性炭混合，经高温烧结，制得可用于柱层析的TiO2多孔陶瓷。以陶瓷柱层析结合超滤法纯化果菠锣蛋白酶，产品比活力937u/mg蛋白，活力回收率48％，纯化倍8。     

The isolation of a toxin from the dahlia sea anemone, Tealia felina L

Gel chromatography with Dyematrex blue B gel and ion exchange chromatography with a methylcellulose cation exchange column have been used to isolate a toxin present in partially purified saline extracts of the dahlia sea anemone Tealia felina. Toxin activity was assessed by its histaminolytic activity. A ten-fold increase in activity per mg protein was achieved in these two steps. Final purification on a Sephacryl column yielded an apparently pure protein with a molecular weight of 7800. The amino acid composition of this compound was determined.     

重组人源白介素-1β发酵条件的优化及其产品的纯化

目的初步建立重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的培养体系;进一步优化大规模培养重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的条件;探讨大规模纯化重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母表达产物的条件;鉴定酵母表达产物及纯化样品。方法在菌体湿重达190g.L-1左右时开始甲醇诱导表达;选用了SP Sepharose XL阳离子交换层析和反相疏水柱层析进行纯化。结果在pH4.5的含0.5%蛋白胨的FM21培养基中发酵时,放罐时间在30h较为适宜;经过纯化蛋白纯度即可达95%以上。结论最终经过鉴定,表达和纯化的样品就是我们想要得到的IL-1β。     

离子交换法分离纯化酶反应液中5-氟尿苷的研究

为开发从酶反应液中分离纯化5-氟尿苷的方法,研究了利用阴离子交换树脂以及硅胶柱色谱实现转化产物分离纯化的工艺;实验采用HPLC为检测方法,以5-氟尿苷含量为考察指标,从吸附量,洗脱率,回收率的角度考察了各种条件的影响。最终确定以D301树脂为吸附剂;最佳吸附条件为动态吸附,温度25℃,pH 8;动态洗脱,洗脱剂5%NaCl溶液,体积流量为3BV/h;再利用硅胶柱色谱,采用200～300目硅胶,以正己烷∶乙酸乙酯=12∶88作为洗脱剂,洗脱后结晶可得到5-氟尿苷纯品,色谱纯,最终收率72.4%。     

不吸水链霉菌中沉默基因簇的激活和产物结构鉴定

不吸水链霉菌S.ahygroscopicus S91(CGMCC4.7082)的次级代谢产物中含有多种抗真菌组分，目前已发现的组分有四霉素、制霉菌素、丰加霉素、白诺菌素和茴香霉素。通过生物信息学分析，不吸水链霉菌S91基因组中含有云南霉素和谷氏菌素的生物合成基因簇，但目前在该菌株发酵产物中并没有检测到这两种抗生素的存在。对四霉素、制霉菌素、丰加霉素生物合成阻断株Streptomyces ahygroscopicus ΔttmS1ΔnysBΔtymH进行发酵培养，发现其发酵液中具有水溶性的抑制黑曲霉的活性组分。以抑菌活性跟踪目标未知抑菌化合物，发酵液经离心、草酸酸化后，上清液经大孔吸附树脂DM-2脱色，脱色液经732阳离子交换、中性氧化铝柱柱层析和Sephadex LH-20色谱分离，最终得到两个具有抗真菌的化合物A和B。化合物经紫外、质谱和核磁进行结构鉴定，化合物A为云南霉素，B为谷氏菌素或宁南霉素。生物信息学分析与分离纯化技术相结合，进一步证实该菌株具有产生云南霉素和谷氏菌素抗生素的能力。     

Effective on-line purification for cationic compounds in rat bile using a column-switching LC technique

An on-line purification method for cationic compounds and their metabolites in rat bile was investigated using a column-switching technique. 8-Hydroxyquinoline and its glucuronide were used as test compounds. Bile samples were injected directly into the system and successful on-line extraction with high purification efficiency for analytes was achieved using two-dimensional extraction LC; that is, reversed-phase chromatography followed by cation-exchange chromatography. After removal of the endogenous component by extraction LC, chromatographic separation of the target analyte was performed on an analytical ODS column, followed by identification using UV detection. The quantitative ability of the method was evaluated on the basis of injection repeatability, linearity and accuracy. This novel method was also applied to LC/MS analysis in order to characterise the pharmacokinetics of propranolol in rats, and the metabolites were successfully identified.