RAPD－PCR技术在根结线虫分类鉴定中的应用

采用Ｏｐｅｒｏｎ公司Ａ组的９个引物对３种根结线虫：南方根结线虫１号小种（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｉｎｃｏｇｎｉｔａｒａｃｅ１），爪哇根结线虫（Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ），北方根结线虫（Ｍ.ｈａｐｌａ）的基因组ＤＮＡ进行随机扩增，扩增产物显示了明显的多态性，其中引物ＯＰＡ－０１、ＯＰＡ－０３、ＯＰＡ－０４、ＯＰＡ－０５能区分３种根结线虫，其它５个引物仅能区分１个或２个种。     

转基因烟草植株对南方根结线由的抗性测定

 烟草根结线虫病是烟草的主要病害之一，病原线虫主要为四种常见根结线虫，即南方根结线虫〔Meloidogyne incognita (Kofoid and White) Chirwood]、爪哇根结线虫[M.javanica (Treub) Chitwood]、花生根结线虫〔M.arenaria (Neal) Chirwood]和北方根结线虫(M.hapla Chitwood)，其中，以南方根结线虫危害较普遍，尤其是南方根结线虫1号小种.防治烟草根结线虫病的有效方法之一是利用抗病品种.     

用沙培空心菜繁殖根结线虫效果的研究

【目的】建立操作简便、高效繁殖和长期保存根结线虫的方法。【方法】通过沙培方法,于空心菜(Ipomoea aquatica)、马铃薯（Solanum tuberosum）和番茄（Lycopersicon esculentum）移植30 d时接种南方根结线虫（Meloidogyne incognita）2龄幼虫1 000 条/株,同时用10盆空心菜接种爪哇根结线虫（M.javanica）和花生根结线虫（M.arenaria）,测定在沙培浇灌营养液条件下,3种供试植物的根系生长以及接种繁殖根结线虫的情况。【结果】3种植物在盆钵中沙培30 d后,根系生长量最大的是马铃薯,其次是空心菜,番茄最小;空心菜根系的生长期最长,达10个月。3种植物接种南方根结线虫50 d后,在空心菜根系上形成的根结数、卵囊数和线虫总数分别为866.8,864.4和1 592.2,显著大于在马铃薯和番茄根系上形成的根结数（651.6和222.6）、卵囊数（643.4和234.0）和线虫总数（1 106.0和373.8）。爪哇根结线虫和花生根结线虫在沙培空心菜根系上接种后也能很好地繁殖。【结论】空心菜适应性强,在沙培浇灌营养液条件下生长周期长、易管理,适用于大量繁殖和长期保存根结线虫。     

根结线虫rDNA-ITS片段的克隆与序列分析

用PCR方法扩增了16个不同地区和不同作物上根结线虫群体的ITS片段,并进行了克隆、序列测定分析和比对。结果表明:采自北京密云苦瓜和豇豆、北京通州月季以及山东胶州、烟台、潍坊花生上的6个根结线虫群体为北方根结线虫(Meloidogyne hapla),其ITS片段大小为772 bp;来自云南番茄、成都黄瓜和海南石榴上的3个根结线虫群体为爪哇根结线虫(M.javanica),其ITS片段大小为767 bp;来自河北廊坊番茄、北京海淀番茄和浙江黄瓜上的3个根结线虫则属于花生根结线虫(M.arenaria),其ITS片段大小为768 bp;而安徽和县、宿州的番茄以及太和桔梗上的3个根结线虫则属于南方根结线虫(M.incognita),其ITS片段大小为766 bp;海南胡椒上的根结线虫群体为番禺根结线虫(M.panyuensis),ITS片段大小为869 bp。     

中国北方稻田及其周边环境中根结线虫种类鉴定

【目的】了解我国北方稻田及其周边环境中根结线虫的种类，为进一步制定水稻根结线虫病的防治策略提供参考。【方法】2020和2021年春季从我国河南、山东、宁夏、北京、吉林、黑龙江、新疆、甘肃、河北、辽宁、山西、陕西和内蒙古13个省（直辖市/自治区）的连片稻田、周围田埂、旱地等采集了1 032份土样，每份土样与灭菌河沙混合后平均分成3等份分别放入花盆中，盆中一半播水稻一半播番茄，50 d后检测水稻或番茄根系是否有根结产生。挑取阳性样品根结中的雌成虫，制作会阴花纹玻片，对根结线虫种类进行形态鉴定；同时利用我国常见6种根结线虫特异性引物对土样中的根结线虫种类进行分子鉴定。【结果】生物测定结果显示，有119 份土样能够引起水稻或番茄幼苗产生根结，总检出率为11.53%，其中宁夏回族自治区土样检出率最高，为33.33%。在根结线虫种类鉴定中发现，拟禾谷根结线虫（Meloidogyne graminicola）为北方水稻产区优势种，占鉴定样品的96.83%；花生根结线虫（M.arenaria）、北方根结线虫（M.hapla）、南方根结线虫（M.incognita）、象耳豆根结线虫（M.enterolobii）和爪哇根结线虫（M.javanica）分别占鉴定样品的84.13%，52.38%，31.75%，15.87%和3.17%。受1，2，3，4，5和6种根结线虫侵染的土样比例分别为11.11%，28.57%，28.57%，28.57%，3.18%和0%。其中最常见的为拟禾谷根结线虫、南方根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫混合侵染（23.81%），其次为拟禾谷根结线虫和花生根结线虫混合侵染（22.22%），再次为拟禾谷根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫混合侵染（15.87%），其他不同种类根结线虫混合侵染的田块比例不超过10.00%。【结论】根结线虫广泛分布于我国北方稻田及其周边环境中，其中拟禾谷根结线虫为优势种，象耳豆根结线虫也已适应低温由南向北扩散，今后应加大研究根结线虫在北方露地低温环境下的适应能力及扩散和危害风险，制定相应的防治措施。     

稻瘟病菌无毒基因的分子标记

 使用 RAPD对稻瘟病菌 631 5组合的 42个子囊孢子菌株及亲本菌株 94- 84c( MAT1 -1 ) ,95- 2 3- 4a( MAT1 - 2 )进行分析。通过对 1 2 0个引物及 2 80种引物组合进行筛选 ,发现 OPA-1 5,OPT- 4,OPT- 6,OPT- 8等 41个 ( 34.2 % )单引物及 OPA- 1 1 /OPT- 6,OPT- 2 0 /OPA- 2 0等 63种双引物组合 ( 2 2 .5% )能在 2个亲本菌株之间扩增出有多态性的带型 ,扩增片段的大小主要分布在 0 .5～ 3.5kb的范围内。 3个标记与一个无毒基因位点 Avr- Xiu连锁 ,其中 OPT- 686 0 与AVR- XIU的遗传距离为 1 .4c M,可作为染色体步行的起点。     

三七病原根结线虫核糖体基因ITS区段的克隆测序及其在检测中的应用

根据NCBI基因库中根结线虫属rDNA序列,设计通用引物M18s/M28s,对采自云南文山、砚山、马关、蒙自等地的4个三七病原根结线虫种群(Meloidogyne hapla)rDNA区段进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,并将扩增到的目的片段克隆到pGEM-T载体上。对重组克隆进行测序和序列分析,结果表明:4个种群rDNA同源性为100%,ITS区序列长度为479 bp,其中ITS1序列长度为213 bp,5.8S序列长度为159 bp,ITS2序列长度为107 bp。根据此序列设计-对特异性寡聚核苷酸引物Mhf/Mhr,应用PCR技术,以北方根结线虫(Meloidogynehapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)和爪哇根结线虫(Meloido-gyne javanica)全基因组DNA为对照,对三七病原根结线虫全基因组DNA进行特异性扩增。结果表明,该对引物能从供试的北方根结线虫和三七病原根结线虫种群全基因组DNA中扩增到462 bp长度的分子片段,而南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫则无扩增产物。该引物可用于三七病原根结线虫的检测。     

厚垣轮枝菌菌株V10的生物学特性研究

 厚垣轮枝菌(Verticillium chlamydosporium)能寄生南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、大豆孢囊线虫 (Heterodera glycines)的卵和雌虫,是一种重要的线虫生防菌.1994年本研究室从香港大屿山的丝瓜根结线虫(M.incognita已鉴定)的卵上分离得到1株厚垣轮枝菌菌株 (V₁₀).为了更加有效地培养和利用该菌株,作者对该菌株的部分生物学特性进行了测定.     

陕西设施蔬菜根结线虫的种类鉴定及分布

根结线虫病是陕西棚室蔬菜最重要的病害之一,以其雌虫的形态特征和测量值为主要依据,对采自20个市县的330份根结线虫样本进行会阴花纹鉴定,并对其种类分布以及危害进行调查,表明,陕西省根结线虫有南方根结线虫(M. incognita)、北方根结线虫(M. hapla)、花生根结线虫(M. arenaria)和爪哇根结线虫(M. javanica)4类。南方根结线虫发生率占采集点的97.27%,是保护地蔬菜的绝对优势种群,以葫芦科受害较重。根结线虫在延安、渭南、铜川及商洛大部分地区发病率达70%以上,以延安地区南部和渭南大部分地区发病最重,病情指数70以上;榆林地区发病率最低,发病率20%~30%,病情指数30以下。     

陕南蔬菜根结线虫种类的同工酶酶谱鉴定

在形态学鉴定的基础上,运用同工酶电泳技术,对采自陕南3市18县区的37个为害蔬菜的根结线虫种群进行鉴定。结果表明:在所鉴定的种群中,32个种群为南方根结线虫(Meloidogyne incognita),2个种群为花生根结线虫(M.arenaria),1个种群为北方根结线虫(M.hapla),1个种群为南方根结线虫和花生根结线虫的混合群体,1个种群为南方根结线虫和北方根结线虫的混合群体;其中南方根结线虫是陕南为害蔬菜的主要根结线虫。     

滇西北部分悬钩子属植物亲缘关系的ISSR分析

利用ISSR分子标记研究滇西北39种悬钩子属植物的亲缘关系,从100个引物中筛选出12个能扩增出清晰带型并具多态性的引物,共扩增出166条DNA片段,片段大小为259～2 300 bp,平均每条引物扩增出13.83 条DNA片段,多态性比率为95.78%.利用NTSYS-pc软件计算39种悬钩子属植物种间的Nei's距离,并用UPGMA 法构建系统树.结果表明,39份供试材料明显聚为5大类:即空心莓组、木莓组、刺毛莓组、矮生莓组和葡匐莓组,与形态学的分类结果基本一致.39个悬钩子属植物种间的遗传距离为0.452 8～0.941 1,说明滇西北悬钩子植物在DNA分子水平上具有丰富的遗传多样性.另外,UPGMA聚类结果表明,形态学分类上的同组不同种间具有较近的亲缘关系,不同组的种间具有复杂的遗传差异.     

柔嫩艾美耳球虫杨陵株3-1E基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的鸡柔嫩艾美耳球虫(Ei meriatenella)3-1E基因的ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从E.tenella杨陵(YL)株总RNA中扩增3-1E基因,并将扩增产物与pMD18-T easy载体进行连接并测序,用DNAstar 5.0软件对测序结果进行分析。结果表明,2009年分离的E.tenellaYL株3-1E基因与其他虫株相比,核苷酸有9个位点发生变化,其中7个位点的变化引起了相应氨基酸位点的改变,其他2个位点的变化未引起氨基酸的改变。对2006年和2009年分离的YL株3-1E基因的核苷酸进行了比对,结果发现,有两个核苷酸位点发生了变化。系统发育树分析表明,E.tenellaYL株3-1E基因同种间与E.tenella甘肃株遗传关系最近,同属间与E.acervulina法国株遗传关系最近。     

甘肃党参中花生茎线虫的鉴定与记述

【目的】明确甘肃省渭源县党参Codonopsis pilosula病样中的茎线虫种类。【方法】采用形态学特征、ITS-rDNA与28S-rDNA序列系统发育分析、特异性引物PCR扩增、PCR-ITS-RFLP相结合的方法进行种类鉴定。【结果】甘肃省党参茎线虫群体形态特征与花生茎线虫Ditylenchus arachis相似,形态测量均值虽存在差异,但是范围值基本一致;系统发育分析显示,该线虫与花生茎线虫聚为一支,特异性引物PCR扩增片段、PCR-ITS-RFLP图谱均与花生茎线虫相同。【结论】结合形态特征与分子特征分析,将甘肃党参茎线虫群体鉴定为花生茎线虫,表明该线虫已在甘肃发生分布。     

应用单核苷酸多态性(SNP)标记鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚

为了快速区分长江流域各水体中的鲚属鱼类,利用单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)标记对短颌鲚(Coilia brachygnathus)、湖鲚(C. nasus taihuensis)和刀鲚(C. nasus)进行物种鉴定。从120个在短颌鲚和刀鲚之间分化指数(Fst)为1的SNP位点中随机挑选出20个用于引物设计,从21个在湖鲚和刀鲚之间分化指数较高的SNP位点中随机挑选出10个设计引物。随机挑20尾短颌鲚、20尾湖鲚和12尾刀鲚用设计的引物扩增、测序。结果表明:洞庭湖和鄱阳湖的短颌鲚与刀鲚可以使用以上19个SNP分子标记中的任何一个完全分开,剩下1个SNP标记在所扩增的样本中没有发现多样性变异而被弃用。用于区分湖鲚与刀鲚的10个SNP分子标记中有8个在所测样本中可以扩增并用于物种鉴定。其中单独使用Ct-Cn_wtap位点时,湖鲚和刀鲚的基因频率相差最大,当使用Ct-Cn_wtap和Ct-Cn_eif2b4位点时,对湖鲚和刀鲚的鉴别准确率可以达到100%。本研究提供了稳定、高效和低成本识别短颌鲚和刀鲚、湖鲚和刀鲚的方法,为今后鲚属鱼类的物种鉴定和资源保护提供了有效的工具。     

1种鉴别草地贪夜蛾性别的分子标记引物的开发

目的 开发用于草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda性别鉴定的分子标记引物。方法 依据草地贪夜蛾雌、雄虫性信息素结合蛋白(Pheromone-binding protein, PBP)基因片段序列的差异设计特异性性别鉴定引物;利用引物对经过形态学鉴定的草地贪夜蛾雌、雄样本进行PCR验证。结果 2对引物分别对对应的雌、雄虫样本均扩增出450 bp左右的特异性条带。结论 开发的分子标记引物可以快速有效地对各个时期的草地贪夜蛾进行性别鉴定,为研究草地贪夜蛾雌、雄个体差异提供一种有效工具。为制定基于性别鉴定的草地贪夜蛾的有效治理防控策略提供参考。     

Detection of Eperythrozoon wenyoni by PCR assay

The objective of this research was to develop a detection method for Eperythrozoon wenyoni infection using polymerase chain reaction (PCR) assay technique. A pair of primers was designed and synthesized according to the conservative sequence 16S rRNA. The PCR assay was performed with the primers. A 985-bp fragment was amplified by using PCR. The amplified fragments with the expected size were identified by EcoR I restriction digestion. The crossing-reaction, specific-reaction and duplicate-reaction indicated that the PCR method is a specific, sensitive, fast and effective method for diagnosing E. wenyoni infection at group level.     

57株镰孢菌ISSR分子标记及其遗传多样性分析

为明确美丽组尖孢镰孢菌和李瑟组镰孢菌种间和种内的差异与亲缘关系,以采自不同寄主的57株镰孢菌(Fusarium)为研究对象,采用ISSR-PCR标记技术对其进行遗传多样性分析,结果表明:利用11条引物对供试的3种菌株进行ISSR-PCR扩增,共扩增出121条条带,其中多态性位点为117个,多态性比例为96.7%,平均每条引物产生条带为11条。说明镰孢菌基因组DNA的SSR区域具有明显的多态性,镰孢菌的遗传多样性采用ISSR技术是可行的分析。聚类分析结果表明:57个菌株间的遗传相似系数为0.568～0.992,当相似系数为0.568时,供试菌株可明显分为两大类群,第一类群IG-I为1～35,全部为美丽组尖孢镰孢菌,第二类群IG-II为36～57,全部为李瑟组镰孢菌;第二类群又可以分为两大亚类群,第一亚类为轮枝镰孢菌,第二亚类为层生镰孢菌。ISSR类群划分与镰孢菌菌种分类之间具有一定的相关性,而与其地理来源无相关性。本研究镰孢菌种间与种内均表现出明显的遗传差异。     

甘肃省胡萝卜根结线虫病病原鉴定

为了明确根结线虫种类，采用形态学和分子生物学方法，对甘肃省临洮县胡萝卜上的根结线虫进行鉴定，并测定其致病性。结果表明，该群体雌虫虫体梨形或柠檬形，乳白色，口针粗壮，中食道球近圆形。雌虫会阴花纹呈卵圆形，背弓较平缓，肛门处有刻点。雄虫虫体细长，尾部钝圆，交合刺针状，成对。2龄幼虫虫体细长，呈蠕虫形，唇区无明显缢缩，口针发达，口针基部球小而圆，尾部透明区明显，尾尖钝圆。利用特异性引物Mh-R/Mh-F扩增得到大小为462 bp的特异性片段，与北方根结线虫（Meloidogyne hapla）一致。基于根结线虫属rDNA ITS和28S-rDNA D2D3区序列构建系统发育树，发现该群体均与北方根结线虫序列聚为一支。将该线虫接种胡萝卜，其症状与田间发病症状一致，35 d后分离线虫，其形态特征与北方根结线虫相符。综上，形态学特征结合分子生物学方法，将该病原鉴定为北方根结线虫（M.hapla），这是甘肃省首次报道北方根结线虫危害胡萝卜类蔬菜作物。     

Research of Genetic Diversity in Seven Kobresia by AFLP in Tibetan Plateau

This work analyzed the genetic diversity of Kobresia accessions at the molecular level, and further obtained the necessary information for breeding and germplasm evaluation. Genomic DNA of Kobresia was amplified with four E＋3 and M＋3 primer combinations with AFLP （amplified fragment length polymorphism）. AFLP analysis produced 164 scorable bands, of which 154 （93.96%） were polymorphic. The mean Nei＇s gene diversity index （H） was 0.2430, and the Shannon＇s information index （I） was 0.4012, indicating the abundant genetic diversity of Kobresia. The 11 Kobresia accessions from Tibetan Plateau, China, can be classified into five groups after cluster analysis based on the UPGMA （unweigbted pair group method arithmetic average） method. In general, there was abundant genetic diversity among Kobresia accessions resources, and the genetic coefficient was unrelated to their geographic latitude. Natural habitats influenced genetic differentiation of Kobresia.