饲用高产纤维素酶菌株的诱变选育

以里氏木霉40359为出发菌株,对其进行紫外线、亚硝酸钠、硫酸二乙酯诱变,选育纤维素酶高产菌株。经过平皿初筛和摇瓶复筛,得到一株稳定性好的菌株YB40359,FPA酶活力达到57.31 U/mL,较原始菌株提高了87.12%;CMC酶活达到142.60 U/mL,较原始菌株提高了58.66%,且遗传稳定性好,可以用作饲用纤维素酶的降解菌。     

产植酸酶枯草芽孢杆菌诱变选育方法的研究

通过对产植酸酶枯草芽孢杆菌进行不同方法的诱变处理,确定最佳诱变条件.对产植酸酶的枯草芽孢杆菌进行筛选,然后采用紫外(UV)、亚硝基胍(NTG)、UV-NTG和NTG-UV4种方法对其进行诱变.UV诱变(100 s)选育的Z3菌株植酸酶活性最高(71.96 U/mL),比筛选出发菌株提高38.46％.结果表明:UV (100 s)选育方法为最佳的诱变条件.     

产脂肪酶黑曲霉原生质体NTG诱变研究

以黑曲霉Aspergillus niger G27为初始菌株,制备原生质体。用亚硝基胍(NTG)对所制备的原生质体进行诱变,考察诱变效果。收集斜面菌丝体,经复合酶处理制备原生质体,分别于1×10-3mmol/m L NTG溶液中诱变处理0~60 min,考察菌株的死亡率、菌落变异率和产脂肪酶活性等。结果表明,原生质体再生率为7.5%。随着诱变时间增加,原生质体诱变死亡率、菌落变异率增加,并逐渐趋于稳定。初筛结果为随着诱变时间增加,脂肪酶活性标平均值降低,标准偏差值增加,变异系数值增加。NTG诱变时间为20~40 min时,出现比较多的正变菌株。经过复筛和验证试验,得到P316菌株脂肪酶活性为(394.3±12.9)U/m L,比出发菌株发酵酶活高22.9%;P388菌株为(385.1±11.4)U/m L,比出发菌株发酵酶活高20.1%。可见采用NTG诱变菌株的原生质体获得良好的诱变效果,结合筛选获得了2株遗传稳定的高产突变菌株。     

一株高产中性蛋白酶菌株的筛选与诱变

通过牛奶平板初筛、摇瓶复筛，从土壤中筛选出产中性蛋白酶菌株L01，以紫外线和亚硝酸钠为诱变条件，分别利用单因素和复合诱变方法提高菌株的产酶能力，最后对遗传稳定性良好的菌株L01F进行鉴定。结果表明：菌株L01分别经过紫外线照射60 s和亚硝酸钠处理12 min时，其中性蛋白酶酶活力最高，为459.13 U/mL，是原始菌株的2.07倍。在先亚硝酸钠处理12 min后紫外线照射48 s的最适复合诱变条件下，筛选得到的高产中性蛋白酶菌株L01F，酶活力达到577.87 U/mL，是原始菌株L01的2.61倍，且该菌株传代10次后仍具有良好的遗传稳定性。最后经过形态学和分子生物学鉴定，确定筛选出的菌株L01F为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。 [关键词] 中性蛋白酶|诱变|稳定性研究|枯草芽孢杆菌     

纤维素酶高产菌株的选育

从土样中分离筛选出12株产纤维素酶能力较强的菌株。经摇瓶发酵复筛,获得产纤维素酶活较高且稳定的菌株F6,其CMC酶活为887 U/mL,滤纸酶活为210.72 U/mL。以该菌株为出发菌株,经紫外线诱变处理,获得纤维素酶高产菌株4-2-2。将菌株4-2-2摇瓶发酵4 d后,产CMC酶活达3171.598 U/mL,滤纸酶活达1827.372 U/mL,分别比出发菌株提高3.58倍和8.67倍。     

常压室温等离子体结合紫外诱变筛选红霉素高产菌株

利用常压室温等离子体射流诱变(ARTP)和紫外照射对红霉素产生菌进行复合诱变,得到4株产量明显提高的突变菌株,4株菌的平均发酵效价较出发菌株提高25.2%;其中一株(12#菌株)经发酵摇瓶验证,红霉素发酵单位可达10029单位/mL,比出发菌株提高了28.6%,且遗传稳定性良好。实验证明ARTP-UV复合诱变是一种简单高效的筛选方法。     

产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化

本试验菌源取自肉牛瘤胃液,首先用酪蛋白水解圈法初选出16株产蛋白酶菌株,综合HE值和蛋白酶活性,选出一株蛋白酶活性最高A18作为后续试验菌株,该菌株蛋白酶活为415.82 U/mL,通过形态和分子鉴定确定此菌株为米曲霉菌。单因素试验确定接种量为4%、培养温度为30℃、培养时间为60 h,通过响应面分析法及多次重复试验,得出接种量4%、温度29℃、时间55 h为其最佳产酶条件,最高酶活达527.57 U/mL,比优化之前提高了22.6%。     

响应面优化转透明颤菌血红蛋白基因里氏木霉液体发酵产纤维素酶的培养条件

研究采用响应面法并以滤纸酶活力(filter paper activity,FPA)作为响应值对转透明颤菌血红蛋白基因的里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6-VHb菌株液体发酵产纤维素酶的发酵条件进行优化。根据单因素试验结果设计P-B试验,筛选出影响Tu6-VHb菌株发酵产酶的3个显著因素:吐温-80含量、发酵液体积(250 mL三角瓶发酵)、氮源浓度。用最陡爬坡路径法逼近最大响应值区域,运用响应面B-B试验设计确定3个显著因素之间的交互作用和最佳发酵条件。结果显示,Tu6-VHb产纤维素酶的最佳发酵条件是:吐温-80含量0.39%,发酵液体积61.32mL(250 mL三角瓶发酵),氮源浓度0.87%。经优化后,Tu6-VHb菌株发酵产纤维素酶酶活力达51.72U/mL,与模型预测值51.94U/mL相近,较优化前该菌株酶活力(39.984U/mL)提高了29.35%,是未转入透明颤菌血红蛋白基因的里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6菌株酶活力(35.904U/mL)的1.44倍。     

氮离注入选育β-葡聚糖酶高产为菌株的研究

为获得工业化生产的高产β-葡聚糖酶菌株,试验采用低能氮离子(N )注入诱变筛选的方法,对出发黑曲霉(Aspergillus niger)菌株Y2449进行改良,获得高产菌株SD16.突变株黑曲霉SD16产β-葡聚糖酶酶活由出发菌Y2449的73.00 U/mL提高到493.24 U/mL,产量提高到亲株的7倍,高产菌株SD16经连续5代培养传代,产酶性能稳定.     

缫丝废水发酵产果胶酶的条件优化研究

果胶酶制剂能够有效地提高饲养动物对营养物质的消化吸收率,是一种绿色饲料添加剂。缫丝废水是缫丝厂的主要排放物,是一种无毒、含氮和磷较高的有机废水。本研究以前期选育所得高产果胶酶菌株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)G7-7作为试验菌株,利用缫丝废水为主要发酵原料,对产果胶酶条件进行优化。通过单因素试验和正交试验得出该菌株的最佳产酶条件为:以5%蚕沙为产酶诱导物,发酵液蔗糖添加量1.1%,接种量16%,发酵液初始pH 9.5,36℃发酵84 h。在此条件下菌株的产果胶酶能力可达到21.84 U/mL,是优化前12.39 U/mL的1.76倍,其中发酵液蔗糖添加量对产果胶酶影响达到显著水平。     

西农萨能奶山羊瘤胃产蛋白酶酵母菌的筛选研究

试验旨在从西农萨能奶山羊瘤胃液中分离出产蛋白酶的酵母菌株,并对其产酶能力进行测定。以蛋白酶的活性进行筛选,得到高产蛋白酶酵母菌,对其产酶条件进行优化。经形态学观察及26S rDNA序列分析鉴定出5株产蛋白酶酵母菌,分别对各菌株产酶条件进行优化,在最佳产酶条件下,菌株库德毕赤酵母Y1(时间48 h、接菌量3%、温度30℃、pH值9)产酶活力达229.89 U/mL,东方伊萨酵母Y5(时间48 h、接菌量4%、温度37℃、pH值9)产酶活力达212.63 U/mL,马克斯克鲁维酵母Y16(时间48 h、接菌量3%、温度37℃、pH值9)产酶活力达208.44 U/mL,近平滑假丝酵母Y20(时间48 h、接菌量4%、温度37℃、pH值9)产酶活力达211.74 U/mL,单孢酿酒酵母Y21(时间48 h、接菌量4%、温度30℃、pH值9)产酶活力达209.96 U/mL。同时对五株酵母菌产水解酶的效果进行了探究,发现库德毕赤酵母Y1、马克斯克鲁维酵母Y16、单孢酿酒酵母Y21具有较高的植酸酶活性,达到14.38、15.34、15.63 U/mL;五株菌株均表现出较高的果胶酶活性,其中单孢酿酒酵母Y21显著高于其他菌株(P0.05),达到15.18 U/mL;五株菌株均表现出较高的纤维素酶活性,均超过180 U/mL,其中近平滑假丝酵母Y20显著高于其他菌株(P0.05),达到199.08 U/mL。试验成功分离出5株产蛋白酶菌。库德毕赤酵母Y1、马克斯克鲁维酵母Y16、单孢酿酒酵母Y21具有较高的植酸酶活性。五株菌株均表现出较高的果胶酶活性、纤维素酶活性。     

复合诱变选育高产β-葡聚糖酶菌株

以黑曲霉SD16为出发菌株,经紫外线和N 注入诱变处理,选育高产β-萄聚糖酶菌株.结果表明:紫外线的最佳照射时间为10min,N 最佳注入剂量为70×2.6×1012 N /cm2;突变高产菌株AN1的β-葡聚糖酶酶活由出发菌株SD16的493.2 U/mL提高到902.5 U/mL.且突变菌株AN1经传5代培养,产酶性能稳定.     

链霉素抗性突变选育那西肽高产菌株

通过对那西肽产生菌N106的孢子进行紫外诱变处理(15 W,253.7 nm,距离30 cm),再利用链霉素抗性突变作为筛选模型(链霉素最低抑制浓度为3 u/mL)获得了链霉素抗性基因突变的高产菌株NUS146和NUS182,摇瓶发酵水平分别达到3233和3452 u/mL,比出发菌株N106的摇瓶水平2502 u/mL分别提高了29.22％和37.97％.传代试验表明,该两突变株遗传特性相对稳定.     

缫丝废水发酵产蛋白酶的菌种筛选及发酵工艺优化

试验旨在研究筛选菌株发酵缫丝废水生产蛋白酶。试验从自然环境取样,筛选得到能利用缫丝废水发酵产蛋白酶的菌株Z416,形态学观察和分子生物学鉴定该菌株为硝基愈创木胶类节杆菌(Paenarthrobacter nitroguajacolicus),并通过单因素和正交设计试验优化了该菌株的产酶条件组合。结果显示,发酵液乳糖添加量4%、发酵培养基初始pH值7.5、接种量16%、摇床转速180 r/min、发酵温度33 ℃、发酵时间84 h为最优发酵方案。在此条件下,菌株Z416酶活力达到17.89 U/mL,是优化前酶活(3.21 U/mL)的5.57倍。研究表明,该蛋白酶具有应用到禽和猪饲料中的潜力,可以改善畜禽的生长性能。     

高压电场选育高产酸性木聚糖酶菌株的研究

为获得适用于动物饲料的木聚糖酶高产菌株,并验证高压电场诱变方法的有效性,于农田土壤中筛选出高产菌株,在高压电场中进行诱变,筛选最佳的突变菌株。出发菌株初步鉴定为沙福芽孢杆菌,命名为Bacillus safensis B16。该菌株所产木聚糖酶在pH 5、60℃下酶活性为217.34 U/mL,且60℃时的半衰期为229 min,热稳定性良好。在6～24 kV、极间距为3 cm的高压电晕电场中处理0～10 min,最终在10 kV下处理6 min选育出一株木聚糖酶高产菌株B16106-2,酶活性达到256.73 U/mL,较出发菌株提升了18.12%,且传代7次后菌株的产酶能力基本不变,具有良好的遗传稳定性。突变菌株所产木聚糖酶的最适酶反应条件不变。研究证明,高压电晕电场是一种有效的诱变方式,且筛选出的菌株B16106-2性能良好。     

拟康氏木霉固态发酵产纤维素酶系的研究

以稻草秸秆为主要原料,利用拟康氏木霉3.3002(Trichoderma pseudokoningii 3.3002)固态发酵生产纤维素酶,对培养条件进行了优化,并系统地测定了各种纤维素酶的酶活.结果表明,最优产酶培养基组成为:稻草秸秆和麸皮的混合比例为4:1,最佳氮源为2.5%(NH4)2SO4,最佳发酵时间120 h,培养温度35℃,接种量15%,pH 5.0,培养基含水率50%.在此条件下,该菌株产纤维素酶系中羧甲基纤维素酶(Cx)酶活力达4700 U/mL,葡聚糖外切酶(Cb)酶活力达3440 U/mL,葡萄糖内切酶(C1)酶活力达到1620 U/mL,滤纸酶(FPA)酶活力达到1935 U/mL.     

弗氏链霉菌双拷贝串联基因tylF、tylE和tylCV工程菌的构建

为提高弗氏链霉菌对泰乐菌素的产素能力,构建了弗氏链霉菌双拷贝串联基因tylF、tylE和tylCV基因工程菌。本研究以弗氏链霉菌作为出发菌株,并以其全基因组DNA为模板分别扩增tylF和tylE以及tylCV基因、以质粒pSET152为模板扩增强启动子基因permE,采用重叠延伸PCR技术和EcoRV、XbaI双酶切结合的连接方法,构建弗氏链霉菌表达载体pSET152-permE-tylF-tylE-tylCV,并转化至大肠杆菌ET12567,利用大肠-链霉菌属间接合转移技术获得工程菌株。研究结果表明,工程菌株摇瓶效价(14580 u/mL)比出发菌株(11318 u/mL)提高了29%;液相色谱结果显示,工程菌株的泰乐菌素A和泰乐菌素C相对峰面积显著(P≤0.05)高于出发菌株。增加弗氏链霉菌tylF、tylE和tylCV的拷贝数可有效提高泰乐菌素的产量,以及优化组分,为泰乐菌素生产菌的遗传改造提供参考。     

纤维素酶产生菌灰白青霉HML0233的分离及系统分类研究

通过滤纸纤维素平板及发酵产酶鉴定,从腐木下土壤中分离出一株分解纤维素能力较强的真茵HM10233.该菌株的CMC酶活为31.04 U/mL,β-葡萄糖苷酶酶活为47.66 U/mL,滤纸酶活为5.28 U/mL.根据形态特征观察初步推测该菌株属于青霉属;经5.8S rDNA基因两侧的内转录间隙ITS序列同源性分析及构建系统进化树分析.该菌株和Penicillium canescens NKRL 35656同源性很高,推测该菌株为灰白青霉(Penicilliumcanescens).     

利用梯度平板法结合紫外诱变、抗性筛选选育土霉素高产菌株

以龟裂链霉素TMSⅠ12-66为出发菌株,通过紫外-氯化锂诱变处理,并结合梯度平板法、氯化锂和四环素复合抗性平板上筛选土霉素高产菌株。通过对致死率的考察,确定了紫外的最佳诱变剂量为90 s。在分离培养基上层加入氯化锂和底层加入四环素进行正突变株的定向筛选。经过选育得到一株土霉素的高产菌株TMSⅠ14-180,摇瓶发酵验证效价达22985 mg/mL,较出发菌株提高22.36%,经传代试验考察,该菌株遗传性状稳定。     

适用于制备对虾发酵饲料的益生芽孢杆菌复配组合的筛选和评价

为克服芽孢杆菌单株菌株在水产动物发酵饲料应用上的局限性和优化对虾颗粒饲料发酵条件,本试验通过对优选芽孢杆菌菌株进行配伍组合,使用福林酚法、3,5-二硝基水杨酸法和DNS法分别进行蛋白酶、淀粉酶以及纤维素酶活性的定量测定,将选出的酶活性较高的菌株,通过16S rDNA序列信息鉴定定种,并将各菌株进行配伍,以3种酶活性为指标优选最优组合。制备发酵对虾饲料,以酶活性为指标优化加水量、接种量、颗粒大小以及通气量。结果表明:在9种芽孢杆菌组合中,蛋白酶活性最高的组合为8-Z,酶活性为(28.58±0.34)U/mL、淀粉酶活性最高的组合为3-Z,酶活性为(5.58±1.10)U/mL、纤维素酶活最高的组合为3-Z,酶活性为(34.53±7.41)U/mL。菌株组合8-Z(包含解淀粉芽孢杆菌1-D、枯草芽孢杆菌3-D和枯草芽孢杆菌9-D)制备对虾发酵饲料的适宜参数为:加水量1 mL/g,接种量0.5×107～1.5×107 cfu/g,充气量20 mL/g,发酵时间24 h,在此条件下发酵后活菌数为6.48×108 cfu/g。