葡萄MADS-box转录因子家族全基因组鉴定及表达分析

从葡萄基因组中共鉴定出54个MADS-box基因,其中Type-Ⅰ型10个,Type-Ⅱ型44个,分布于15条染色体中,编码的蛋白质序列为62～596个氨基酸,外显子数1～16个。启动子区含有大量光信号、植物激素、胁迫和分生组织等相关功能域。根据实时荧光定量RT-PCR的结果发现,SEP、FUL、FLC、SVP、SOC1和ANR1亚类基因随叶片生长表达水平逐步升高,在成熟叶中最高,衰老叶片中下降;果实第1次膨大期和果实转色期是SEP、SOC1和ANR1亚类基因的两个表达高峰期;单氰胺处理诱导SVP、AGL15、SOC1、AP3/PI、AGL12和FLC亚类基因在休眠过程中表达量持续上升,在休眠解除过程表达量下降。     

建兰花发育相关B、C和E类MADS-box基因的表达分析

开花植物中B、C和E类MADS-box基因控制花雄蕊和雌蕊的合成。以具有高度进化蕊柱（雄蕊和雌蕊合生）的建兰为材料,从已有转录组中搜索到14个B、C和E类基因,包括GLO、DEF、AG、SEP和AGL6类基因,并进行实时荧光定量表达分析,发现CeDEF1和CeAGL6-1在萼片和花瓣中大量表达,唇瓣中微量表达;CeDEF3、CeDEF4和CeAGL6-3则在唇瓣和蕊柱中大量表达,在萼片和花瓣中几乎不表达;CeAG1和CeAG2主要在蕊柱中表达;而且CeDEF3、CeDEF4、CeAG1、CeAG2和CeAGL6-3在蕊柱突变体‘新品梅’的蕊柱状花瓣中的表达量比‘铁骨素’花瓣中高很多,说明这几个基因在建兰蕊柱的形成过程中可能扮演关键角色。     

番茄花柄离区发育基因JOINTLESS及互作蛋白基因的功能研究

 番茄离区发育控制基因JOINTLESS（J）是一个MADS-box家族基因。MADS-box基因是植物花发育过程中一类重要的转录因子,MADS-box蛋白调节高等植物发育过程中往往形成复合体控制基因的转录。为了研究J及其互作蛋白在番茄发育过程中的重要作用,选择7个与JOINTLESS蛋白互作的MADS-box基因进行RNAi功能研究。研究结果表明TAG1基因不仅严重影响番茄雄蕊和雌蕊的形态,还影响果实的育性。同时对J进行了过量表达分析,研究结果表明,J过量表达不但显著增加了番茄花序的分支和花的数量,还改变了果实形状。     

蕙兰B类MADS-box基因的克隆及表达分析

 采用RT-PCR结合RACE技术从蕙兰（Cymbidium faberi）中分离到3个B类MADS-box基因CfGLO、CfDEF1和CfDEF2,分别编码210、222和227个氨基酸。系统进化树分析显示,CfGLO属于PI/GLO类基因,CfDEF1和CfDEF2分别属于PaleoAP3组基因的PeMADS2类基因和PeMADS3类基因。RT-PCR和实时荧光定量表达分析表明,CfDEF1在2、3轮花器官侧瓣、唇瓣和蕊柱中强烈表达,在萼片中不表达;CfDEF2在1、2、3轮花器官中都表达,在营养组织中不表达;而CfGLO在所有组织中都表达,说明3个基因在蕙兰花器官的形成过程中可能扮演着不同的角色。此外,3个基因都在蕙兰幼嫩子房中有表达,显示其可能在蕙兰子房的形成过程中起一定作用。     

毛白杨PtMADS4基因的克隆及序列分析

MADS-box转录因子家族在植物体的发育过程中具有重要的作用.以毛白杨易县雌株休眠花芽总RNA为模板,用PCR扩增的方法获得了1个新的毛白杨的MADS-box基因,命名为PtMADS4.该基因全长1041 bp,编码245个氨基酸,具有典型的MADS-box结构域和完整的K区.系统进化树分析表明PtMADS4与SEP1,SEP2同源性高达78%.     

板栗雌雄花发育相关的MADS-box基因发掘与表达分析

为筛选板栗混合花序中雌雄花形成与发育关键基因,基于板栗雌雄花表达谱测序结果,从差异表达基因中分离到17个MADS-box基因。通过序列结构分析,发现其中2个基因缺少半保守的K盒,为Ⅰ型MADS-box基因,另外15个基因为Ⅱ型MADS-box基因。系统进化关系分析显示,13个包含完整读码框的MADS-box基因中有2个B类基因,1个C/D类基因和3个E类基因。荧光定量PCR结果证实这些MADS-box基因在板栗早期混合花序中的雌雄花之间表达差异显著（变化倍数 > 2）,且部分B、C/D和E类基因在板栗幼叶、纯雄花和雌花中的表达变化趋势相似,推测这些MADS-box基因在板栗雌雄花形成和发育中起重要调控作用。     

辣椒花器官发育MADS-box基因的克隆与表达分析

采用RACE技术从辣椒（Capsicum annuum L.）花药中获得了一个控制辣椒花器官发育的MADS-box基因,命名为PPI（GenBank登录号：GU812276）。该基因全长952 bp,编码215个氨基酸,具有典型的MADS结构域和K结构域,与番茄花器官发育MADS-box基因TPI高度同源,同源性达88%。系统进化树分析表明,PPI基因属于花器官发育B类基因。RT-PCR表达分析表明,该基因在辣椒花瓣中的表达高于在花药、萼片以及子房等花器官中的表达,在营养器官叶片中没有表达。     

甜樱桃DELLA蛋白基因PaGAI的克隆与表达分析

 利用RT-PCR和RACE技术从甜樱桃（Prunus avium L.）嫩叶中克隆了赤霉素信号转导途径中的关键负调控因子DELLA蛋白基因cDNA全序列,将其命名为PaGAI。该基因cDNA全长2 310 bp,开放阅读框ORF为1 788 bp,推测其编码一个含有595个氨基酸残基的多肽链,蛋白质分子量约64 kD。生物信息学分析结果表明,PaGAI编码蛋白具有DELLA蛋白保守结构域,其N端存在两个非常保守的酸性结构域DELLA和VHYNP作为信号感知区域,C端有VHIID、RVER 和SAW结构域作为阻遏区域。PaGAI与其它植物的DELLA蛋白具有较高的同源性,其中与苹果MdRGL2b蛋白同源性最高,达到84%。构建pGEX-4T-1/PaGAI原核表达体系,并转化E. coli BL21,经0.5 mmol · L-1 IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测获得了分子质量为91 kD的融合蛋白,半定量RT-PCR分析表明,PaGAI在花、果实、叶片、韧皮部中普遍表达,在花与韧皮部中的表达远远强于在果实与叶片中的表达。     

PpMADS2与PpMADS3协同调控黄肉桃果实类胡萝卜素积累机制的研究

为探究黄肉桃果实中MADS-box家族转录因子对类胡萝卜素代谢的调控作用，从黄肉桃果实中克隆得到两个MADS基因，分别命名为Pp MADS2(PRUPE＿5G208500)和Pp MADS3(PRUPE＿5G208400)。PpMADS2开放阅读框为768bp，编码255个氨基酸；PpMADS3开放阅读框为756bp，编码251个氨基酸。生物信息分析显示二者蛋白的N端均含有MADS-box家族典型的特征结构域。亚细胞定位分析显示PpMADS2和PpMADS3定位于细胞核。荧光定量PCR结果表明PpMADS2、Pp MADS3以及类胡萝卜素合成基因PpPSY和PpCHYB在黄肉桃果实成熟过程中表达量呈上升趋势，与果实成熟期间类胡萝卜素的含量增加一致。酵母双杂交试验结果表明PpMADS2和PpMADS3蛋白存在相互作用。双荧光素酶试验结果表明PpMADS2和PpMADS3可以协同激活PpPSY和PpCHYB启动子。因此推测PpMADS2和PpMADS3可通过转录激活PpPSY和PpCHYB促进桃果实类胡萝卜素的积累。     

茄子单性结实候选基因的表达分析

对茄子单性结实抑制差减文库中的1 248个差异表达unigenes在GeneBank数据库中进行BLAST比对分析,结果表明1 109个unigenes具有同源序列,其编码的蛋白包括甲硫氨酸亚砜还原酶、MADS-box转录因子、组蛋白和隐花色素等,涉及到果实发育的多个方面,139个unigenes没有同源序列,可能为新基因。利用荧光定量PCR研究10个差异表达unigenes在茄子单性结实果实和非单性结实果实发育过程中的表达模式,分析表明,在低温条件下,unigenes Z569和Z707在单性结实果实发育中特异表达,可能与单性结实果实的形成有关,可作为研究单性结实的候选基因。     

蝴蝶兰PhSVP的克隆及其在花发育过程中的表达分析

从蝴蝶兰杂交品种‘大辣椒’中克隆到SVP同源MADS-box基因PhSVP，使用RACE方法获得PhSVP全长，其开放阅读框为687 bp，编码228个氨基酸。蛋白序列多重比对表明PhSVP蛋白包含一个高度保守的MEF2-like MADS结构域和一个中度保守的K-box结构域，且与兰科的SVP/AGL24同源蛋白相似度高，进化树分析也表明PhSVP蛋白与其他兰科植物的SVP/AGL24同源蛋白亲缘关系最近。PhSVP的空间表达模式表明其在营养器官表达量高，在萼片、侧瓣和唇瓣等生殖器官表达量低。进一步对PhSVP在成花转换和花发育过程中花序顶端的表达进行分析，表明PhSVP的转录水平在营养分生组织向花序分生组织过渡的过程中无显著变化，仅在花序分生组织阶段有少量上升，但在花发育早期花分生组织阶段中的表达水平显著升高，而在花发育后期的萼片原基、花瓣原基和合蕊柱原基阶段持续下降。此外还发现A类基因PhAP1在花发育过程中的花序顶端的表达模式与PhSVP相似，而B类基因PhPI和C类基因PhAG在花瓣原基和合蕊柱原基阶段的表达量最高。检测了PhSVP在抽葶期、花蕾期和盛花期的根、叶和花葶中的转录水平，结果表明PhSVP在花蕾期的根中的表达量稍高于其他时期，在不同阶段的叶中的表达水平无显著差异，而在抽葶期花葶中的表达量显著高于花蕾期和盛花期。试验结果暗示蝴蝶兰PhSVP可能起到调控花分生组织状态的维持、避免花器官原基过早分化的作用。     

葡萄MADS-box家族基因保守片段的克隆与序列分析

MADS-box转录因子在多种植物的发育过程特别是花器官和果实发育过程中发挥重要的作用。为了从葡萄中克隆出新的MADS-box基因,研究在葡萄花及果实发育中的作用,根据多种植物MADS-box基因保守区序列,设计简并引物,应用RT-PCR技术从红富士葡萄花序中分离出34条MADS-box基因cDNA片段。序列分析表明,这些片段长度在138～152bp之间,包含基因起始密码子。推导的氨基酸序列与已登录的欧洲葡萄及其它物种的MADS-box基因同源性超过83%。用推导的氨基酸序列与已知的欧洲葡萄和拟南芥MADS-box家族基因进行系统发育分析,可将这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,证明葡萄中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因。     

甜樱桃MADS box基因的克隆与表达分析

 以甜樱桃‘拉宾斯’（Prunus avium L.‘Lapins’）为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个与花发育相关的MADS box基因,命名为PaMADS3,其在GenBank中的登录号为HQ229605。PaMADS3基因全长1 095 bp,包含1个723 bp的开放阅读框,推断其编码240个氨基酸。序列分析表明：PaMADS3蛋白与拟南芥中的SEP蛋白高度同源。组织特异性表达显示PaMADS3基因在花瓣、雄蕊、心皮中表达。实时定量RT-PCR分析表明,花芽露绿期的离体枝条经过15和25 ℃处理后,其雌蕊中PaMADS3基因在25 ℃的表达量高于在15 ℃的表达量。     

苹果MADS-box转录因子的生物信息学及其在不同组织中的表达

正目的:分析已知苹果(Malus×domestica)MADSbox基因基本信息,研究其在不同组织中表达情况。方法:利用NCBI数据库查询并获得苹果MADS-box基因,采用CLC Combined Workbench version 6、WebLogo3、MEGA4.1、MapInspect和MEME等软件对其蛋白序列进行生物信息学分析。采用RTPCR技术研究MdMADS基因在不同组织中的表达情况。结果:共得到26个苹果MADS-box基因。MADS-box结构域分析显示,氨基酸10(I)、16-19(RQVT)、22-23(KR)、29-31(KKA)、33(E)、37-     

建兰AGL6基因的表达及功能分析

采用文库稀释池法从建兰花器官全长均一化cDNA文库中筛选出1个AGL6类MADS-box基因CeAGL6,对其进行了信息学分析,并通过表达模式、互作蛋白和烟草的遗传转化研究其功能。研究结果发现,CeAGL6含有MADS结构域和K结构域,并具有AGL6类蛋白的典型基序。CeAGL6在建兰萼片中高水平表达,其次是花梗,在花瓣、唇瓣和合蕊柱中表达水平较低,不在叶片和根中表达。转CeAGL6烟草花期略微提前,出现四瓣花、六瓣花、雄蕊瓣化和多种不规则的五瓣花等表型。CeAGL6与CeAP1、CePI1、CeAG1和CeSEP3能互作,但自身不能形成同源二聚体。试验结果表明Ce AGL6参与了建兰成花诱导和花器官发育。     

甜樱桃成花相关MADS-box基因的克隆及表达分析

【目的】克隆甜樱桃中可能参与成花途径的MADS基因,分析其基本信息,研究其在不同组织中的表达情况。【方法】以甜樱桃‘萨米特’(‘Summit’)为试材,结合桃基因组分析,克隆得到14个可能参与成花的MADS基因,分别命名为PaSOC1、PaAG、PaAP1、PaAP1-2、PaAP3、PaPI、PaSVP、PaAGL24、PaSEP1、PaSEP2、PaSEP3、PaSEP4、PaSEP5、PaFLC,通过DNAMAN、SMART、protein BLAST和MEGA5等软件分析14个甜樱桃的MADS基因结构、氨基酸结构域及其进化关系,RT-PCR检测其在樱桃根、叶芽、叶、花芽、花、韧皮部中的表达模式。【结果】14个甜樱桃MADS成员大小为612~765 bp,均含有典型的MADS结构域和K-box结构域,含有6~8个内含子。分属7个亚组,PaSEP1、PaSEP2、PaSEP3、PaSEP4、PaSEP5属于SEP亚组,PaAP1、PaAP1-2属于AP1亚组,PaAG属于AG亚组,PaSOC1属于SOC1亚组,PaAP3和PaPI属于AP3/PI亚组,PaSVP属于SVP亚组,PaAGL24属于AGL24亚组,PaFLC并未聚到FLC亚组中。RT-PCR分析显示,14个MADS基因在花芽或花中均有不同程度的表达,此外,除PaAP3、PaSEP1、PaSEP4及PaSEP5之外,其他几个基因在韧皮部中也有不同程度的表达。【结论】获得的甜樱桃MADS-box基因结构高度保守,参与调控成花及花发育过程。     

'玛瑙红'樱桃生长素响应因子CpARF7基因克隆及表达分析

以'玛瑙红'樱桃根系为试材,采用RT-PCR技术,克隆了'玛瑙红'樱桃CpARF7基因,并对其进行生物信息学分析和表达分析,以期为进一步研究'玛瑙红'樱桃CpARF7基因调控及生长发育提供参考依据.结果 表明:CpARF7的开放阅读框为3498 bp,编码1165个氨基酸,包含B3、Auxin-resp和AUX_ IAA 3个结构域,是结构域完整的ARF转录因子;系统进化树分析表明CpARF7与甜樱桃同源蛋白的亲缘关系最近.荧光定量PCR结果显示,CpARF7基因在不同组织中均有表达,且在根、花芽、成熟果实组织中的表达量最高;200 mg·L-1 IAA处理下,CpARF7在花芽中的转录水平受到诱导,6、24 h时最高;而在200 mg·L-1 ABA处理下,花芽中CpARF7转录水平受到抑制.推测CpARF7可能是与'玛瑙红'樱桃根系、花芽、果实生长发育相关的转录因子,参与调控'玛瑙红'樱桃IAA、ABA激素信号转导的过程.     

中华猕猴桃全基因组MADS-box基因家族鉴定及表达分析

【目的】鉴定并分析中华猕猴桃MADS-box基因家族成员，探明MADS-box基因家族成员在果实生长发育及芽休眠中的表达模式。【方法】基于中华猕猴桃红阳V3基因组数据库，利用生物信息学方法对中华猕猴桃MADS-box全基因组进行鉴定，分析其家族成员的理化性质、系统进化树、保守基序、顺式作用元件，并对其在果实生长发育及不同组织中的表达模式进行分析。【结果】在中华猕猴桃红阳基因组中鉴定到了68个AcMADS-box基因，共包含11个亚家族，不均匀地分布于22条染色体上，成员间共存在32对共线性基因对；在基因家族上游启动子区域发现与光响应、激素响应、逆境胁迫响应等相关的顺式元件；17个AcMADS-box基因在组织间高表达且有表达特异性，推测是参与调控中华猕猴桃生长发育的关键基因。【结论】初步鉴定并提供了AcMADS-box家族成员信息，16个AcMADS-box家族成员在根、枝、茎、叶、花中高表达，8个家族成员在花芽中高表达。结果为进一步研究AcMADS-box参与中华猕猴桃的生长发育调控机制提供参考。     

苹果愈伤组织超表达MdNAC029促进花青苷积累

以‘光辉’海棠(Malus spectabilis‘Guanghui’)与‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)杂交后代中分离出来的红肉苹果果实为试验材料,克隆得到1个NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子基因,命名为MdNAC029。该基因开放阅读框(ORF)为843 bp,编码含有280个氨基酸的蛋白。保守结构域分析显示,MdNAC029蛋白在N端包含1个保守的NAC结构域。基因表达分析显示该基因在红肉苹果果实中表达量较非红肉果实高。在‘王林’苹果愈伤组织中超表达MdNAC029,其花青苷积累显著增加,表明MdNAC029在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对MdMYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含1个MdNAC029转录因子的结合位点。同时,烟草瞬时表达试验显示,MdNAC029能够激活MdMYB1基因的表达。由此推测,MdNAC029可能通过直接促进MdMYB1基因的表达,正向调节花青苷的积累。     

葡萄转录因子数据库中17个MADS-box成员在果实发育成熟过程中的表达特征分析

【目的】了解17个MADS-box转录因子成员在葡萄果实发育成熟过程中的调控作用。【方法】利用Plantcare软件分析了葡萄类型转录因子的启动子元件,预测其与果实发育、成熟过程相关的潜在作用;以二倍体欧亚种葡萄品种‘魏可’为试材,采用qRT-PCR技术分析了17个MADS-box成员在葡萄果实发育成熟过程中8个重要时期的时空表达模式,初步鉴定参与葡萄果实发育成熟调控的重要成员;果实转色前7 d通过ABA、NAA处理进一步验证其在葡萄果实发育与成熟中的作用。【结果】MADS-box成员的启动子均含有与果实发育、成熟相关的motif作用元件,且其含有的元件个数存在差异,表明其可能在调控葡萄果实发育与成熟过程中功能存在冗余,同时各自的作用可能存在一定的差异;qRT-PCR分析显示,所有成员均在葡萄果实发育成熟过程中表达,且在不同时期呈现差异表达;其中,VvAG和Vv FBP24在果实硬核期高表达,而在果实转色和成熟中几乎不表达,表明其可能参与果实生长发育的正调控;而VvMADS1、VvMADS9、VvSVP-like1和Vv AP3只在果实转色与成熟过程中高表达,说明它们可能促进了果实的转色与成熟;ABA在果实转色特定时期上调了MADS-box家族6个成员的表达,而NAA下调其表达;另一方面,NAA上调了MADS-box家族8个成员的表达,相反ABA下调其表达,表明这些成员可能响应ABA/NAA调控葡萄果实发育与成熟过程。【结论】葡萄转录因子MADS-box的17个成员均参与了果实发育过程的调控。其中,6个成员可能参与了葡萄果实的成熟过程的正调控,而另外8个成员可能促进了葡萄果实的生长发育从而抑制了果实的转色与成熟过程。