溶藻弧菌抗独特型抗体单链抗体基因真核表达载体的构建

目的：构建溶藻弧菌抗独特型抗体的单链抗体（scFv）基因的毕赤酵母分泌型表达载体.方法：从分泌溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株（2F4）中克隆该抗体的重链可变区（VH）基因和轻链可变区（VL）基因（GenBank accession No：DQ011530和 DQ011531）, 并通过基因重组为scFv基因.然后将其克隆入毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K中, 经序列测定后, 电转化入毕赤酵母菌SMD1168中, 将经表型筛选和G418抗性筛选的重组酵母菌株进行PCR鉴定.结果：获得毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K-scFv, 经G418浓度梯度筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株.结论：成功地构建溶藻弧菌抗独特型抗体的scFv基因的真核表达载体, 为进一步研究其生物学活性奠定了基础.     

抗人TNF-α单抗基因的克隆及鉴定

目的克隆抗人ＴＮＦ－α鼠单抗得可变区基因以构建人－鼠嵌合抗体表达载体。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,以前导肽序列的引物从１个分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因（Ｖκ,ＶＨ）,在大肠杆菌中表达Ｆａｂ段核实其功能活性。结果分别得到了２个Ｖκ和２个ＶＨ基因。ＤＮＡ序列测定表明,其中１个轻链可变区基因为骨髓瘤细胞系中固有的无功能基因。１个重链可变区基因经原核系统表达测活表明无抗体活性。另一个轻链和重链可变区基因的成熟蛋白编码部分与从第一骨架区引物所克隆的、可在大肠杆菌表达出抗体活性的Ｖκ、ＶＨ序列相符。将该轻链、重链基因分别克隆到了人－鼠嵌合轻链、重链表达载体中。结论通过原核表达系统核实,获得了抗ＴＮＦ－α单抗的可变区基因     

溶藻弧菌抗独特型抗体单链抗体在毕赤酵母中的表达

目的构建溶藻弧菌抗独特型抗体的单链抗体(scFv)基因的毕赤酵母分泌型表达载体,并对其表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法从分泌溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中克隆该抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因(GenBank accession No:DQ011530和DQ011531),并通过基因重组为scFv基因。然后将其克隆入毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K中,经序列测定后,电转化入毕赤酵母菌SMD1168中,将经表型筛选和G418抗性筛选的重组酵母菌株进行PCR鉴定。以甲醇进行诱导表达,表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定。结果获得毕赤酵母菌分泌型表达载体pPIC9K-scFv,经G418浓度梯度筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株,ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性。结论构建溶藻弧菌抗独特型抗体的scFv基因的真核表达载体并成功表达,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

抗阿尔茨海默病Aβ人-鼠嵌合抗体基因的真核载体构建和表达

目的 通过基因工程抗体技术构建和表达抗β-淀粉样多肽(Aβ)人-鼠嵌合抗体,减低鼠源单克隆抗体在临床应用中引起的人体免疫排斥反应.方法从分泌抗Aβ1-42鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株中提取总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增鼠源性抗体全长基因,并通过Blast对其序列进行分析;利用重组PCR技术拼接重轻链可变区及人IgG1的恒定区基因,并对重链Fc段进行定点突变以降低排斥反应;分别构建人-鼠嵌合基因重轻链表达载体,用脂质体法将其同时导入COS-7细胞中表达,并利用ELISA和免疫组织化学(SP法)对分泌的抗体功能和性质进行初步鉴定.结果 Blast比对分析结果显示克隆的基因序列符合小鼠抗体基因序列,将可变区基因与人IgG1的恒定区基因拼接以及Fc定点突变后,成功构建了嵌合抗体的真核表达载体,并实现真核表达;ELISA和免疫组织化学方法证实了所分泌抗体的人源性和与Aβ的结合特异性.结论成功地构建和表达了抗阿尔茨海默病Aβ人-鼠嵌合抗体,为其在阿尔茨海默病的临床诊治中应用和进一步改造奠定了基础.     

抗人小细胞肺癌单抗2F7人-鼠嵌合Fab片段基因的构建和表达

目的：通过基因工程抗体改造获得具有与人小细胞肺癌有特异性反应的人－鼠嵌合抗体2F7 Fab片段，方法：采用RT－PCR技术从抗人小细胞肺癌单克隆抗体2F7杂交瘤中克隆该抗体的重，轻链可变区基因，将2F7单抗的重，轻链可变区基因装入带有人恒定区基因的表达载体pSW1-Fab中，构建得到pSW1-2F7 Fab，转化受体菌E.coil XL1-Blue,IPTG诱导表达，经Western blot和ELISA鉴定表达蛋白的活性。结果：从抗人小细胞肺癌单克隆抗体2F7杂交瘤中克隆获得了抗体重、轻链可变区基因，测序证实2F7单抗的重链（VH）可变区基因全长362bp，编码120个氨基酸，轻链（VL）可变区基因全长319bp，编码105个氨基酸，构建的2F7人－鼠嵌合Fab表达载体诱导后获得了目的蛋白的表达，主要分泌在菌液的上清中，表达量较高且稳定，具有与NCI－H128细胞特异性结合的活性。结论：构建和表达了抗人小细胞肺癌单抗2F7人－鼠嵌合Fab片段，表达产物具有与抗原结合的特异性，为进一步研究和应用打下了基础。     

抗VEGF165的嵌合抗体在小鼠骨髓瘤细胞中的表达

目的减少鼠源性单抗的免疫原性,获得抗人血管内皮生长因子１６５（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１６５,ＶＥＧＦ１６５）的人／鼠嵌合抗体。方法 将抗ＶＥＧＦ１６５鼠单抗ＶｍＤ１１鼠单抗ＶｍＤ１１的轻链可变区基因ＶＬ和重链可变区基因ＶＨ分别克隆到带有人ＩｇＧ１轻链恒定区基因ＣＫ,重链恒定区基因Ｃγ１的真核表达载体ｐＡｃｙｃ－ｎｅｏ－Ｃｋ和ｐｓｖ２－Ｃγ１上,构建了真     

抗TNF-α人-鼠嵌合抗体的构建及表达

目的：构建和表达抗ＴＮＦ－α人－鼠嵌合抗体。方法：将抗ＴＮＦ－α鼠单抗Ｚ８的轻、重链可变区基因插入到含有人ｋ链和ＩｇＧ１重链恒定区基因的真核细胞表达载体中,分别构建轻、重链分开表达和共同表达的人－鼠嵌合抗体真核表达载体转染真核细胞,通过ＥＬＩＳＡ,ＲＴ－ＰＣＲ、免疫印迹检测ＴＮＦ－α的活性。用Ｌ９２９细胞检测嵌合抗体体外中和ＴＮＦ－α的活性。结果：ＥＬＩＳＡ鉴定结果表明该嵌合抗体与ＴＮＦ－α特异性     

抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的: 构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性噬菌体抗体库, 搭建人源性抗体制备的技术平台, 为小儿呼吸道合胞病毒感染发病机制的研究、诊断、治疗和预防提供新的有效途径.方法: 从52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞中提取总RNA, 并逆转录为cDNA.用PCR扩增轻链和重链Fd段(即重链的可变区和第一恒定区)基因, 并将扩增的轻链和重链基因片段克隆于pComb3x噬粒载体, 电转化XL1-Blue大肠杆菌, 经辅助噬菌体M13K07超感染后构建成Fab段噬菌体抗体库.对此抗体库双酶切进行鉴定, 并用呼吸道合胞病毒颗粒作抗原进行初步筛选.结果: 经过重轻链基因的重组, 成功构建一免疫噬菌体抗体基因库, 共有2.6×106个不同的克隆菌, 其中70%的克隆均含有轻链和重链Fd 基因.因此, 所构建的噬菌体抗体库的库容量为1.8×106, 经初步筛选, 抗体库得到了不同程度的富集.结论: 利用基因重组技术和噬菌体展示技术, 成功构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性免疫噬菌体抗体库, 为进一步的研究奠定了基础.     

诱导毕赤酵母分泌表达致倦库蚊防御素Defensin成熟肽

目的诱导毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达表达致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)防御素(defensin)成熟肽,为进一步研究致倦库蚊defensin的抗病原作用、机理及其应用奠定基础。方法利用生物信息和RT-PCR技术克隆了编码致倦库蚊防御素的成熟肽全基因序列,并克隆到毕赤酵母甲醇诱导型分泌表达载体pPICZα-A的α-factor信号肽序列的下游,构建成pPICZα-A-defensin重组表达载体,表达载体经SacⅠ线性化处理后电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞,转化子经Zeocin抗性筛选,菌落PCR,Mut表型鉴定和Tricine-SDS-PAGE分析,成功获得了能够有效表达重组defensin的pPICZα-A-Defensin/X-33甲醇利用表型工程菌。结果在甲醇诱导24 h后pPICZα-A-Defensin/X-33的工程菌分泌表达了预期Mr8 200大小的致倦库蚊防御素成熟重组肽。结论致倦库蚊防御素可以在毕赤酵母中诱导分泌表达。     

抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)的构建和表达

目的：构建抗CD71人-鼠嵌合抗体的真核细胞表达载体并在真核细胞中表达嵌合抗体。方法：将鼠源性抗CD71单抗(7579)重、轻链可变区基因(VB和VL)分别克隆至含有人IgG轻、重链恒定区的表达载体pγ-Expr和pκ-Expr中；将嵌合表达载体(Chi7579-pγ-Expr和Chi7579-pκ-Expr)经电转染技术共转染至真核细胞(SP2／0)中。结果：经ELISA法检验阳性转染瘤细胞培养上清，证明其表达蛋白产物中同时具有人IgG重链恒定区(pγ)和轻链恒定区(Cκ)蛋白；通过间接免疫荧光流式细胞术(FCM)和间接免疫荧光显微技术，证明该表达产物能够特异性识别和结合表达于靶细胞表面的CC71分子。结论：抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)在体外真核细胞表达成功。     

应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建动脉粥样硬化抗体库

目的:利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建动脉粥样硬化(As)抗体细胞库,以寻找动脉粥样硬化治疗性抗体。方法:将载体pcDNA5/FRT改造成双表达载体pcDNA-DHL。分离动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞,提取总RNA,逆转录为cDNA。PCR扩增抗体重链可变区和Kappa型轻链全长,连接至双表达载体pcDNA-DHL,即动脉粥样硬化抗体基因库pDHL-As,将其转染Flp-In~(TM)-CHO细胞(FCHO),流式细胞术检测重组抗体在细胞表面的表达。加入潮霉素筛选出成功转染pDHL-As载体的细胞,即为动脉粥样硬化全长抗体细胞库。结果:成功构建双表达载体pcDNA-DHL。构建的重、轻链初库容量分别达1.79×10~5和1.80×10~5,理论上抗体库多样性为2.32×10~(10)。动脉粥样硬化抗体库pDHL-As可成功展示在细胞表面,并分选出45个表达抗氧化型低密度脂蛋白抗体的FCHO细胞。结论:本研究成功构建了一个动脉粥样硬化全长人源抗体细胞库。     

抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体单链抗体ScFv的构建和表达

目的：克隆抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体ScFv。方法：从分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株（2F4）中提取总RNA，利用RT-PCR技术，克隆该抗体重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL），通过基因重组构建VH-VL的表达载体pTAT-ALI，转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。结果：VH基因序列全长369碱基对，编码123个氨基酸，VL基因序列全长339碱基对，编码113个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FRs）、3个抗原互补决定区（CDRs）及抗体特征性的两个半胱氨酸残基。ELISA测定显示基因工程抗体ScFv与原代抗体一样，具有较高的抗原亲和力。结论：成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体ScFv基因并表达于细菌壁膜间隙和包涵体中，为溶藻弧菌独特型抗体单链抗体ScFv成为新一代基因工程疫苗奠定了初步基础。     

米尔比霉素肟化物ScFv噬菌体展示抗体库的构建

目的构建具16元大环内酯共性结构小分子物质的特异性抗体库。方法免疫原MILO-BSA免疫小鼠后从脾细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增得到全套抗体重链可变区基因(VH)及轻链可变区基因(VL),SOE-PCR将VH、VL片段拼接扩增得到单链抗体可变区基因片段(ScFv)。将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化感受态大肠杆菌,辅助噬菌体超感染得到上清液即为噬菌体抗体库。结果RT-PCR扩增出长360bp左右的抗体重链可变区基因(VH)及340bp左右的轻链可变区基因(VL),SOE-PCR扩增得到750bp左右的ScFv基因片段,成功构建了库容量为2.4×106,滴度为2.0×1012pfu/mL的噬菌体单链抗体库。结论构建的抗体库目的片段连接率较高,多样性较好,为下一步16元大环内酯类小分子物质高特异性抗体的筛选奠了基础。     

Raji 细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系噬菌体抗体库并从中筛选出特异性的抗体。方法以Raji细胞免疫BALB/c小鼠,RT-PCR法从脾淋巴细胞中扩增抗体轻链к和重链Fd基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Raji细胞为抗原进行筛选,获得抗Raji细胞的抗体,通过ELISA法进行抗原结合活性的测定,并对所得阳性克隆进行基因测序分析。结果构建了容量为2.18×107的抗人B细胞淋巴瘤Raji细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Raji细胞系特异性识别结合的8株阳性克隆。对其中两个阳性克隆进行基因序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与免疫球蛋白基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区序列具有高度同源性。结论成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Raji细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础。     

嵌合抗CD20抗体Fab片段在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的：构建抗ＣＤ２０嵌合抗体Ｆａｂ片段表达载体,并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达。结果：利用ＰＣＲ方法从抗ＣＤ２０单链抗体（ＳｃＦｖ）表达载体上扩增抗ＣＤ２０抗体轻链可变区基因（ＶＬ）、重链可变区基因（ＶＨ）,然后将ＶＨ、ＶＬ基因重组到Ｆａｂ表达载体ｐＹＺＦ中,构建抗ＣＤ２０Ｆａｂ表达载体ｐＹＺＦ１ｃｄ２０,并在２７Ｃ７菌中高效表达。结果：经Ｆａｂ表达载体转化的２７Ｃ７菌株,进行表达培养,经分     

抗人黑色素瘤嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的：构建嵌合型抗人黑色素瘤抗体的真核表达载体，并实现真核表达。方法：从3株杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因，插入含有抗人Tac抗原信号肽以及人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因和γ1重链恒定区基因的真核表达载体pMH-CA中，转染293T细胞，进行嵌合抗体表达，并用RT-PCR、ELISA、Westem blot免疫印迹等对抗体表达鉴定。结果：成功构建了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体，并实现其真核表达。RT-PCR证实了该抗体在mRNA水平上的表达，ELISA和Westemblot证实了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体的表达。结论：成功表达了抗人黑色素瘤人-鼠嵌合抗体。     

抗癌胚抗原鼠人嵌合抗体重、轻链基因在昆虫细胞中的表达

本文采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf_9,秋粘虫细胞)中表达了抗癌胚抗原(CEA)鼠-人嵌合抗体重、轻链基因.将鼠源性单抗杂交瘤细胞中已克隆到的重、轻链可变区(V_H、Vk)基因分别与人免疫球蛋白恒定区基因Cr_3、Ck相拼接,构建鼠人嵌合抗体基因.含嵌合抗体基因的转移载体与线性化病毒DNA共转染Sf_9细胞,并通过点杂交、PCR扩增和Southern blot分析获得重组病毒.Western blot分析表明以重组病毒感染的Sf_9细胞分别表达了嵌合重链和轻链,放射免疫分析法(RIA)和间接ELISA测定的结果表明嵌合重、轻链基因表达产物具有与CEA结合的能力.     

抗体轻链可变区基因真核表达框架及抗CD3鼠/人嵌合轻链基因的构建

利用抗乙肝表面抗原的单抗２Ｈ１的轻链可变区基因的一部分，以核酸定点突变法引入ＭｌｕＩ限制性内切酶识别位点，构建了含有启动子、前导肽序列以及剪接供体信号等真核表达元件和“ＥｃｏＲＶ－Ｍｌｕ Ｉ”外显子克隆“匣”的通用的抗体轻链可变区基因真核表达框架ｐＧＥＭ－ＬＰＣＲ。从分泌ＣＤ３单抗的杂交瘤细胞中提取基因组ＤＮＡ，通过ＰＣＲ扩增及序列分析证实获得了ＣＤ３单抗轻链可变区基因的外显子。将其克隆到ｐＧＥＭ－ＬＰＣＲ中，切下完整的真核转录单位，与带有人Ｋａｐｐａ链恒定区基因及选择标记基因的表达载体相连接，成功地构建了抗ＣＤ３鼠／人嵌合轻链基因。此表达框架可用于多种抗体轻链可变区基因外显子的克隆及其真核转录单位的制备，大大简化了基因工程抗体的研制。     

抗Aβ鼠源单克隆抗体的人源化改造及其表达鉴定

目的 将前期构建的抗Aβ人-鼠嵌合抗体进行可变区人源化改造,为抗Aβ抗体在临床人体中应用奠定基础。方法 采用模板替换法对已构建的人-鼠嵌合抗体基因中的重、轻链可变区框架区进行人源化改造,构建抗Aβ人源化抗体的真核表达载体。用脂质体法将重、轻链共转染CHO细胞进行表达,采用ELISA法检测表达产物效价、表达量;同时用SDS-PAGE及Western Blot检测表达产物分子量;免疫组化法鉴定其生物活性。结果 重组改造后的抗Aβ人源化抗体基因重链约为1500bp,轻链约为750bp,与预期一致。转染CHO细胞后获得表达,表达量为1.11mg/L,抗体重链相对分子量约为51ku,轻链约为25 ku。ELISA结果显示能与Aβ特异性结合（细胞培养上清A值：2.24）,与改造前的嵌合抗体比较效价基本相同。抗体人源化检测显示,只能被羊抗人抗体识别,不能被羊抗鼠抗体识别。免疫组化显示表达产物有结合Aβ抗原的活性。结论 将抗Aβ人-鼠嵌合抗体进行可变区人源化改造后,基本保持了原嵌合抗体的生物学特性,为其今后应用于临床提供了可能性。     

细胞因子受体-嵌合抗体真核表达载体的构建

目的：构建细胞因子受体-抗人AFP嵌合抗体基因真核表达载体。方法：用RT-PCR方法从人胚肝组织中扩增EpoR胞外区基因及gp130跨膜区基因，并用限制性酶切连接方法拼接。用PCR方法从抗人AFP单链抗体表达载体中扩增VL、VH基因，分别与人kappa轻链和人gammal重链恒定区基因重组，获得人鼠嵌合轻链和重链，再将EpoR-gp130与嵌合重链连接，最后将嵌合轻链和H—EpoR-gp130分别连接到质粒pVITRO上，构建pVITRO-E-g-Ig载体。结果：获得EpoR胞外区基因750bp，gp130跨膜区基因900bp。重组真核表达载体经限制性酶切鉴定示EpoR、gp130基因、嵌合重链基因和嵌合轻链基因正确连接到载体pVITRO。结论：成功构建细胞因子受体-抗人AFP嵌合抗体基因表达载体。