Ad5-增强型绿色荧光蛋白和rAAV2-增强型绿色荧光蛋白转染脂肪间充质干细胞的对比*

背景：利用基因转染技术诱导脂肪间充质干细胞成软骨细胞已有报道,但腺病毒和腺相关病毒转染脂肪间充质干细胞各有不同,且腺相关病毒载体能否转染脂肪间充质干细胞众说不一。 目的：观察Ad5-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和rAAV2-EGFP转染脂肪间充质干细胞后增强型绿色荧光蛋白的表达及转染后细胞增殖能力的变化。 方法：脂肪组织来源于6月龄新西兰大白兔颈背部。机械消化和酶消化法分离提取脂肪间充质干细胞,体外培养扩增。分别采用腺病毒载体(Ad5-EGFP)和腺相关病毒载体(rAAV2-EGFP)转染脂肪间充质干细胞,并观察EGFP的表达。rAAV2-EGFP转染后,需加入2 μL丁酸钠(1 mol/L)。采用MTT法检测基因转染对脂肪间充质干细胞增殖能力的影响。 结果与结论：体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平状和长梭形,细胞形态均一,传代稳定。Ad5-EGFP组和rAAV2-EGFP组均能观察到较多荧光细胞,转染效率分别达到88%和83%。腺病毒和腺相关病毒载体均能转染脂肪间充质干细胞,且转染效率很高。腺相关病毒需要借助丁酸钠来提高其基因表达水平。     

脂质体介导EGFP基因转染神经干细胞实验研究

目的用增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)的表达载体pIRES2-EGFP转染神经干细胞(neural stem cells,NSCs),检测该真核表达载体对NSCs的转染效率及EGFP的表达状态,为用NSCs为载体基因治疗中枢神经系统疾病提供实验依据。方法体外扩增、酶切鉴定pIRES2-EGFP质粒;悬浮培养NSCs;阳离子脂质体lipofectam ineTM2000介导增强绿色荧光蛋白质粒转染NSCs;庆大霉素的氨基糖苷(G418)筛选重组子;荧光显微镜观察转染效率及表达情况;免疫细胞化学鉴定重组子。结果转染后6 h,荧光蛋白偶见表达,24 h表达量明显增加,48 h达到最高峰,1个月后抗性细胞有克隆球形成。结论脂质体介导报告基因—pIRES2-EGFP转染NSCs的方法简单、效率高、易成功,是一较为理想的基因转染方法。     

神经营养素3基因转染神经干细胞及其表达☆

背景：应用包括神经营养素3的神经营养因子促进周围神经再生是当今周围神经再生研究的热点之一,但是临床应用上缺乏安全、有效的给药途径。基因转染技术为神经营养因子的临床应用提供了新的思路和途径。 目的：用神经营养素3基因修饰神经干细胞，并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况。 设计：完全随机试验。 单位：广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科和华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科。 材料：实验选用健康SD大鼠3只，鼠龄4个月，雌雄不拘，由华中科技大学同济医学院动物房提供。用于转染神经干细胞的重组腺病毒表达载体由华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室构建,浓度为0.15 g/L。 方法：实验于2002-12/2004-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成。采用阳离子脂质体介入法，将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pAd-神经营养素3转染原代培养的神经干细胞，转染72 h后采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白在神经干细胞上的表达，测定转染率。采用免疫细胞化学染色法和反转录-聚合酶链反应检测转染72 h，1，5周后神经营养素3基因在神经干细胞中的表达和转录情况。 主要观察指标：神经营养素3基因在转染后的神经干细胞内的表达情况。 结果：①重组质粒pAd-神经营养素3转染神经干细胞：转染72h绿色荧光蛋白在部分神经干细胞上有表达，转染率为40%。5周后仍可见绿色荧光蛋白的表达。②神经营养素3基因在神经干细胞中的转录与表达：转染 72 h，1，5周后神经干细胞中均有神经营养素3 mRNA的转录，转染5周后仍有神经营养素3 mRNA的表达。     

腺相关病毒-2介导增强型绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究

目的探讨血清2型腺相关病毒(rAAV2)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染神经干细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达规律及转染对神经干细胞生物学特性的影响.方法应用荧光显微镜观察转染神经干细胞的绿色荧光蛋白表达情况.传代后第10天,比较转染组和对照组子代细胞形成的神经球数;分化后第14天行免疫组织化学检查,比较转染组和对照组神经元和胶质细胞的比例.结果转染后第3天,可观察到神经球发出绿色荧光,强度逐渐增强,并在第9天达到稳定状态(90%的神经球发出强弱不等的荧光).传代后第10天,转染组子代细胞每井形成的神经球数为(17.83±1.35)个,与对照组比较无显著性差别(P＞0.05).分化后第14天,转染组神经元、胶质细胞的胞体与纤细突起均可见绿色荧光,转染组神经元与胶质细胞比例分别为35.3%±3.1%和55.4%±7.3%,与对照组比较无显著性差别(P＞0.05).结论rAAV2-EGFP可以稳定、高效转染神经干细胞,且不影响神经干细胞的生物学特性,是神经干细胞理想的基因标记方法.     

非病毒载体介导脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞：脂质体及电穿孔转染法的比较

背景：基因转染细胞有病毒及非病毒载体法，因病毒载体面临安全性、免疫排斥等问题，实验探讨脂质体及电穿孔转染法。 目的：比较脂质体及电穿孔法介导人脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞的细胞转染特性和体外表达情况，建立基因工程细胞。 方法：①脂质体法：取体外分离、培养的第3代豚鼠骨髓间充质干细胞，将质粒-脂质体混合物加入含细胞的培养基中培养6 h，再加入胎牛血清的培养基，孵育48 h 后行免疫组织化学检测，即为瞬时表达。48 h后加入含G418培养基筛选。②电穿孔法：取骨髓间充质干细胞，胰酶消化，用无血清培养基重悬细胞，将细胞悬液加入电转化池中，加入质粒，将电转化池移至电极间放电转导。转染48 h后，检测目的基因瞬时表达。48 h后加入含G418培养基筛选。用免疫组织化学及RT-PCR检测两种方法脑源性神经营养因子基因表达情况。 结果与结论：免疫组织化学显示脂质体介导转染的脑源性神经营养因子瞬时表达率约为5.80%，电穿孔法约为24.29%。脂质体法转染筛选14 d后细胞几乎全部死亡；电穿孔法转染后筛选并扩大培养建立工程细胞，免疫组织化学显示工程细胞脑源性神经营养因子阳性表达率达90%以上，RT-PCR扩增产物电泳证实目的基因阳性条带。结果表明，用电穿孔法可成功建立脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞的工程细胞，并用免疫组织化学和RT-PCR方法证实细胞体外表达目的基因。     

腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因体外转染人羊膜上皮细胞☆

背景：人羊膜上皮细胞易于获得，采集简单，是细胞移植和组织修复的理想种子细胞，目前国内外尚无关于标记、示踪体外培养的人羊膜上皮细胞的报道。 目的：探讨腺相关病毒载体介导绿色荧光蛋白基因对体外培养的人羊膜上皮细胞的转染效果。 方法：取人羊膜标本，以胰蛋白酶消化法分离培养人羊膜上皮细胞，采用含绿色荧光蛋白的腺相关病毒进行转染，检测其转染效率。 结果与结论：人羊膜上皮细胞可成功地在体外进行原代和传代培养，经含绿色荧光蛋白的腺相关病毒颗粒转染后，可稳定高效表达绿色荧光蛋白，转染效率达58%。     

携带增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体感染人脂肪源性干细胞的有效性**☆

背景：细胞移植前,将目的基因转染干细胞可增强细胞治疗效果。但要实现目的基因的高效转移并适度表达,载体系统的选择是关键。 目的：将携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体感染人脂肪源性干细胞,检测病毒感染效率及感染后的细胞活力。 方法：利用脂质体转染法获取慢病毒原液。设定不同感染复数(1,5,10,15,20),将带有增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体感染人脂肪源性干细胞。荧光显微镜下观察病毒转染后人脂肪源性干细胞内增强绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪测定病毒感染效率。茜素红染色及油红O染色鉴定病毒转染后人脂肪源性干细胞的多向分化潜能。MTT法检测转染后人脂肪源性干细胞的增殖情况。 结果与结论：随病毒感染时间及感染复数值的增加,人脂肪源性干细胞内绿色荧光表达明显增强,感染后第3天,感染复数为20时人脂肪源性干细胞内可见明显绿色荧光表达,病毒感染效率为60%;第5~7天,病毒感染效率可达90%~95%。转染后人脂肪源性干细胞经成骨及成脂诱导液培养后,茜素红染色及油红O染色阳性,表明病毒感染未影响人脂肪源性干细胞的多向分化能力。病毒感染后,人脂肪源性干细胞的增殖能力未受明显影响。说明携带增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体可以有效感染人脂肪源性干细胞。     

反义肽核酸逆转人神经母细胞瘤多药耐药性的实验研究

目的 探讨反义肽核酸(PNA)的细胞转染方法及对体外培养的神经母细胞瘤多药耐药性(MDR)的逆转作用。方法 以人MDR-1基因mRNA为靶点设计合成两反义PNA序列，利用PNA-DNA杂交，阳离子脂质体介导转染神经母细胞瘤耐药细胞株SK-N-SH。应用流式细胞术、RT-PCR、MTT等方法分别检测反义PNA的转染效率、转染前后细胞P-糖蛋白(P-gp)、MDR-1基因mRNA的表达以及对化疗药物的敏感性。结果 荧光标记的反义PNA转染肿瘤细胞后，细胞平均荧光强度显著增强，且呈浓度依赖性。两反义PNA均使SK-N-SH细胞P-gp表达明显降低，阿霉素和长春新碱对细胞的半数抑制浓度值明显下降，MDR-1 mRNA表达轻度降低。而PNA1转染对照组C6／adr细胞后，上述变化不明显。结论 PNA-DNA杂交阳离子脂质体转染法可有效增加细胞对PNA的摄取．特异序列的反义PNA可有效逆转神经母细胞瘤的MDR特性。     

转化生长因子β3基因转染兔骨髓间充质干细胞诱导其向软骨表型的分化

背景：内源性诱导软骨分为就是通过一定的载体将目的基因整合入干细胞内,使其自行分泌诱导因子诱导自身进行分化。 目的：观察将转化生长因子β3通过腺相关病毒载体转染诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨表型转化的能力。 方法：取体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行重组腺相关病毒转染,将转染后3,6,9,12 d细胞裂解提取蛋白进行酶联免疫检测目的蛋白转化生长因子β3的体外表达。RT-PCR,免疫印迹western blot分别从基因和蛋白水平上检测1,2周Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺蓝染色检测1,2周蛋白多糖的表达。 结果与结论：重组腺相关病毒转染后,骨髓间充质干细胞可以较稳定的表达目的蛋白转化生长因子β3,并且转染成功的骨髓间充质干细胞较阴性对照组能够更好的向软骨表型转化。证实转化生长因子β3可以腺相关病毒为载体转染骨髓间充质干细胞并诱导其向软骨表型分化。     

人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒体外诱导成骨的比较

背景：由于骨形成蛋白的释放速度与新骨生长速度不匹配，单纯应用骨形成蛋白的效果尚不理想，因此，应有合适的载体来调节骨形成蛋白的释放速度。 目的：观察重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用。 方法：全骨髓法培养兔骨髓间充质干细胞，分别应用人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒载体及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒转染兔骨髓间充质干细胞，设定感染复数值为5×104，观察两组细胞形态改变，分别行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、茜素红染色及碱性磷酸酶含量测定，比较两组成骨活性差异。 结果与结论：人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组转染骨髓间充质干细胞后，细胞形态呈现典型的成骨改变，碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色、茜素红染色均出现成骨的特征性改变。绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组未观察到上述改变。人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组碱性磷酸酶含量高于绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组(P < 0.01)。提示人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞表现出更加明显的成骨活性改变。     

阳离子脂质体转染Hela细胞的实验

背景：基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体。 目的：评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件。 设计、时间及地点：以Hela细胞为观察对象,分组设计。实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委－教育部重点实验室完成。 材料：质粒pGFP-N2购自Clontech公司,Hela细胞由大连民族学院的实验室保存。 方法：首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,最后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性。 主要观察指标：采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine 2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因（绿色荧光蛋白基因pGFP-N2）,分析阳离子脂质体Lipofectamine 2000和DOTAP转染Hela细胞转染效率和细胞毒性。 结果：Lipofectamine 2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine 2000转染率较高;当Lipofectamine 2000与DNA质量比为3∶1时,转染效率最高,约72%,是DOTAP转染细胞最高活性的2.5倍;在最佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine 2000的毒性相对较小。 结论：对Hela细胞而言,Lipofectamine 2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性。     

Improving the transfection efficiency of post-mitotic neurons.

The transfection of post-mitotic cells, including primary cortical and hippocampal neurons, has proven for the most part to be inefficient. Methods such as DNA/Ca++ phosphate co-precipitation, electroporation, cationic lipids and micro-injection are often toxic to the cell and rarely give a transfection efficiency exceeding 3% of the surviving culture. Virus transfection methods using modified viruses such as adeno and semliki-forest virus have been shown to be more efficient but the procedures are often time consuming and virus infections may interfere with protein processing. In this study, we evaluated the transfection efficiency of cells from E18 rat embryonic cortical and hippocampal tissues using three cationic lipids: LIPOFECTAMINE, LIPOFECTAMINE Plus, and LIPOFECTAMINE 2000. The method of transfection was by a traditional reporter gene beta-galactosidase (pCMV.SPORT-beta-gal). Results show that out of the three cationic lipids tested, LIPOFECTAMINE 2000 allows for a significantly higher transfection efficiency. Transfection efficiency with LIPOFECTAMINE or LIPOFECT-AMINE Plus was <3%. In contrast, transfection efficiency with LIPOFECT-AMINE 2000 was approximately 20-25% with the cortical neurons and 25-30% with the hippocampal neurons.     

慢病毒转染海马神经元的模型建立

目的建立一种简单易行的体外慢病毒转染海马神经元的实验方法。方法取怀孕的SD大鼠,分离体内胎鼠的海马后,经Accutase消化后接种,采用无血清培养海马神经元,选择合适的时间将慢病毒加入神经元内,于不同的时间在倒置荧光显微镜下观察细胞内GFP的显影效果。结果慢病毒转染海马神经元后,在第3天时观察,细胞内GFP在倒置荧光显微镜下显影达到80%以上。结论此方法简单易行,慢病毒转染神经元的成功率高,为慢病毒转染海马神经元后的后续实验奠定了实验基础。     

反转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞☆

背景：为方便、准确检测外源细胞在体内的存活情况,需在外源细胞转移标记基因。 目的：观察多种细胞因子联合刺激下反转录病毒载体对BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因转移效率的影响。 方法：以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3细胞测定病毒滴度后,取经过干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介素6预培养刺激后的BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞,实验组实施基因转移,流式细胞仪及PCR方法测定基因转移效率。阴性对照组不做基因转移。阳性对照组为PA317-GCGPXSN细胞株。 结果与结论：①病毒滴度为1.9×108 CFU/L。②对照组BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞测定的荧光强度数值为0.63%,实验组为76.04%,两组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断,结果证实细胞因子预刺激后实施基因转移,可有效地将外源基因转移进入BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因组中。     

An improved method of preparing microcarriers for biolistic transfection

The hand-held gene gun uses a pulse of helium to fire small gold particles coated with desiccated DNA (microcarriers) at target cells. This method of biolistic transfection is becoming increasingly popular as an effective means of rapid gene delivery into mammalian tissue. Current methods of microcarrier preparation, however, are slow (up to 2 days) and can result in variations in transfection efficiency due to a number of problems including shearing of DNA, agglomeration and adhesion of gold particles. Here we describe an improved, more rapid method of microcarrier preparation. To evaluate the new procedure we have used DNA encoding yellow fluorescent protein (EYFP), a modified version of the green fluorescent protein, which we have transfected into HEK293 cells. The data show that transfection by the new method results in high levels of transfection efficiency and low variability compared to an alternative method.     

High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques

Transfection of cells by electroporation is a widely used and efficient method. Recently, it has been shown that single neurons in brain slice cultures can be transfected using micropipettes loaded with plasmid DNA expression constructs. However, the transfection efficiencies were very low. Routine employment of single-cell electroporation (SCE) for transfection of neurons requires high and reliable efficiency together with good cell survival. Here, we describe the modification of electrophysiology techniques for SCE leading to very simple and efficient (up to 80%) transfection of neurons in organotypic rat hippocampus and mouse cortex slice cultures. Electroporation-mediated transfection was visualized in real-time by two-photon microscopy at the cellular level using fluorescently labeled oligonucleotides and plasmid DNA. Small oligonucleotides enter the cell immediately during pulse application while large plasmids remain localized for more than 10 min at the cell membrane before they enter the cell by an, as yet, unknown process. SCE does not affect the electrophysiology of transgene-expressing cells. Expression of several neuronal green fluorescent protein-tagged proteins demonstrates that the method can be employed to analyze subcellular trafficking and targeting in single living neurons.     

Neuropeptide Y gene transfection inhibits post-epileptic hippocampal synaptic reconstruction

Exogenous neuropeptide Y has antiepileptic effects; however, the underlying mechanism and optimal administration method for neuropeptide Y are still unresolved. Previous studies have used intracerebroventricular injection of neuropeptide Y into animal models of epilepsy. In this study, a recombinant adeno-associated virus expression vector carrying the neuropeptide Y gene was injected into the lateral ventricle of rats, while the ipsilateral hippocampus was injected with kainic acid to establish the epileptic model. After transfection of neuropeptide Y gene, mossy fiber sprouting in the hippocampal CA3 region of epileptic rats was significantly suppressed, hippocampal synaptophysin (p38) mRNA and protein expression were inhibited, and epileptic seizures were reduced. These experimental findings indicate that a recombinant adeno-associated virus expression vector carrying the neuropeptide Y gene reduces mossy fiber sprouting and inhibits abnormal synaptophysin expression, thereby suppressing post-epileptic synaptic reconstruction.     

pH dependent high transfection efficiency of mouse neuroblastomas using TransFectin

Mouse neuroblastoma cell lines are often used in lieu of mouse primary neurons in ex vivo experiments, as they provide an easier platform for transfection, compared to the latter. A well-known inherent problem with this strategy is the relatively low transfection efficiency (15-30%) of mouse neuroblastoma cell lines such as neuro-2A and N1E-115. We were able to improve the transfection efficiency of these cell lines by using the cationic lipid reagent, TransFectin (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to optimise the transfection conditions. Our results, based on fluorescence intensity determinations and Western blotting for enhanced green fluorescence protein (EGFP) over-expression in neuro-2A, demonstrated that pH is a crucial factor in determining the transfection efficiency. Under pH-optimised transfection conditions, flow cytometric analysis revealed high EGFP transfection efficiencies of 76.4 +/- 0.5 and 60.9 +/- 0.6% for neuro-2A and N1E-115, respectively. Notably, the optimised TransFectin-based transfection system did not result in any detectable cytotoxicity to the mouse neuroblastomas. The resultant optimised system is economical, easy to use and does not require any specialised equipment.     

聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的表面修饰和转染研究

目的：比较不同物质修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒的物理化学性质,并考察它们体外基因转染活性,以寻求一种新的非病毒基因载体递送系统。方法：用乳化聚合法制备不同物质修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒,透射电镜观察表面修饰对纳米粒粒径大小、粒子形态的影响;利用体外转染实验考察表面修饰对纳米粒转染活性的影响;用倒置荧光显微镜观察并用流式细胞仪测定转染结果。结果：经壳聚糖表面修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒带有很强的正电荷,能够转染人肝癌细胞HepG2细胞,并且转染效率高于葡聚糖和mPEG-NH2修饰的纳米粒,也能防止DNase I酶的降解。结论：壳聚糖修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒能有效地将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达。因此,壳聚糖修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒用做基因递送的载体系统值得进一步的研究。     

Electroporation-based gene transfer for efficient transfection of neural precursor cells

Transplantation of neural precursor cells (NPCs) is a potential tool to replace dysfunctional or degenerated neuronal or glial cell types in the central nervous system. Furthermore, transplantation of genetically engineered neural precursor cells might provide a strategy to target therapeutic gene products to the diseased nervous system. Here, we describe a novel and highly efficient electroporation-based transfection protocol for mitogen-expanded mouse NPCs. Transfection of NPCs with the reporter gene enhanced green fluorescent protein (EGFP) or the neural adhesion molecule L1 revealed transfection efficacies of more than 70% as estimated by the number of EGFP-positive or L1-immunoreactive cells 1 day after transfection in vitro. The percentage of EGFP- or L1-positive cells decreased with increasing time in culture. Positive cells were detectable for up to 3 weeks after transfection. When EGFP- or L1-transfected NPCs were grafted into the retina of adult wild-type or L1-deficient mice, they differentiated into glial cells some of which expressed EGFP and L1 for up to 2 and 3 weeks, respectively, the longest post-transplantation periods investigated.