ERα AF-1区磷酸化位点突变体的构建及对ERα活性的影响

目的：构建雌激素受体(ERα) AF1区丝氨酸（Ser）磷酸化位点104、106、118和167位基酸的4个突变体,并在哺乳动物细胞293T中检测突变后对其活性的影响。方法：以pcDNA3-ERα为模板,用重组PCR的方法扩增出编码这4种突变体的基因片段,再将这些片段以正确相位与pcDNA3-FLAG载体中的FLAG编码序列融合。用Western blotting检测融合蛋白的表达,并在哺乳动物细胞293T中检测这些突变体突变后对ERα活性的影响。结果：成功构建了ERα AF1区丝氨酸磷酸化位点104、106、118和167位氨基酸的4个突变体,并在293T细胞中得到表达。活性测定结果表明,在不加雌激素(E2)的情况下,ERα及其突变体的转录活性分别是空载体pcDNA3的3.40 、3.21 、3.02 、3.00和3.54倍;在雌激素的作用下,104、106位氨基酸的突变体对ERα的活性无影响,而118和167位氨基酸的突变体的活性值是ERα的50%。结论：在104、106、118和167这4个ERα AF1区磷酸化位点中,只有118和167位点的丝氨酸的磷酸化是雌激素调节靶基因转录过程中所必需的。     

应用酵母双杂交方法筛选与鉴定组蛋白乙酰基转移酶hTIP60β相互作用蛋白

目的 克隆人组蛋白乙酰基转移酶TIP60β基因,应用酵母双杂交技术研究筛选与TIP60β发生相互作用的蛋白.方法 运用RT-PCR 方法从人脑组织克隆TIP60β cDNA,构建酵母双杂交BD诱饵载体pGBKT7- TIP60β,以其为诱饵从成人肝cDNA文库中筛选与之相互作用的阳性克隆,并对阳性克隆进行序列测定和相关生物学分析.结果 诱饵载体pGBKT7-TIP60β经双酶切可释放出1 443 bp DNA片段,与理论值大小一致,测序比对分析表明序列正确.以其为诱饵经酵母双杂交筛选共获得32个克隆,进一步验证与测序分析,最终确认HDAC7A、DMD2、CREB1、BD73、PHF17、AR等 9个克隆基因. 结论 以TIP60β为诱饵利用酵母双杂交系统获得9个基因编码的蛋白,它们很可能与TIP60β转录活性调节功能有关.     

PER1与RACK1蛋白作用位点分析

目的 筛选人下丘脑视交叉上核(SCN)区域内与PERIOD1(PER1)相互作用的新蛋白,研究RACK1与PER1的作用特点,明确其结合的关键结构域.方法 采用酵母双杂交方法,筛选得到人SCN区域内与PER1-PAS结构域相互作用的新蛋白,并构建5种表达不同长度RACK1片段的酵母文库质粒与PER1诱饵质粒共转染酵母AH109进行杂交,通过营养缺陷筛选、报告基因检测获得阳性克隆,并采用体外转录、免疫共沉淀实验证实阳性克隆蛋白间的相互作用.结果 酵母双杂交筛选得到人SCN区域内表达RACK1蛋白的克隆,重组RACK1表达质粒与PER-PAS诱饵质粒进行酵母双杂交筛选后得到三个阳性克隆:RACK1(WD1-7)、RACK1(WD4-7)和RACK1 (WD5-7),β-半乳糖苷酶测试阳性证实报告基因表达,免疫共沉淀结果显示阳性克隆与PER1蛋白间存在相互作用.结论 RACK1与PER1存在直接相互作用,RACK1含有7个WD40结构域,本研究发现与PER1结合的最小区域位于Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ三个WD40结构域,提示其碳端序列为其结合的关键部位.     

BRCA2与LIM结构域蛋白FHL2的相互作用

目的：应用酵母双杂交方法筛选BRCA2相互作用蛋白编码基因，验证其相互作用并研究其功能联系。方法：以BRCA2基因3′端片段构建酵母双杂交质粒，筛选正常人乳腺上皮细胞cDNA库，获得编码相互作用蛋白的基因，采用免疫共沉淀、哺乳细胞双杂交和荧光酶测定等方法进一步验证蛋白间相互作用和功能联系．结果：采用酵母双杂交系统筛选，获得了多个编码BRCA2相互作用蛋白的基因，其中包括已知的FHL2蛋白；免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交试验显示BRCA2和FHL2在体内特异性结合，并证实FHL2在体内形成同源二聚体；转录活性分析发现BRCA2与FHL2有协同转录激活作用。结论：发现BRCA2与FHL2蛋白间相互作用和功能联系，为BRCA2功能研究提供了新的方向。     

乳腺癌组织中ERα与ERβ的表达及诊断意义

目的 探讨乳腺癌组织中雌激素α受体(ERα)和雌激素β受体(ERβ)蛋白表达对乳腺癌诊断的意义.方法 用免疫组化SP法检测85例乳腺癌组织和32例癌旁正常组织中ERα和ERβ蛋白的表达情况.结果 乳腺癌组ERα蛋白阳性表达率(75.3%)高于癌旁正常组(28.1%),P=0.001;乳腺癌组ERβ阳性表达率(52.9%)低于癌旁正常组织(78.1%),P=0.013;ERα和ERβ阳性表达均与组织学分级有关,高分化组ERα阳性表达率高于中、低分化组,P=0.035,而高分化组ERβ阳性表达率明显低于中、低分化组,P=0.042;但ERα和ERβ阳性表达均与肿瘤大小、临床分期、有无淋巴结转移无关(P＞0.05).结论 ERα在乳腺癌的发生、发展过程中发挥着重要作用,ERβ随细胞恶变发生改变,联合检测ERα和ERβ对乳腺癌的诊断、治疗及预后判断有一定意义.     

ERβ与其变异体对三阴性乳腺癌细胞株生长的影响

目的通过对三阴性乳腺癌细胞转染雌激素受体β(ERβ)及其5-8外显子缺失异构体ERβ△5-8(文中简称ERβ△),试图了解ERβ单独表达对癌细胞生长的影响,及对雌激素、三苯氧胺(tamoxifen)作用的反应性;探讨ERβ是否有可能成为三阴性乳腺癌内分泌治疗的预测因子和新的治疗靶点。方法①构建真核细胞表达克隆pReceiver-M72-ERβ及其剪切体pReceiver-M72-ERβ△。②脂质体法转染人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231,设ERβ组、ERβ△组、空载体组及空白对照四组。③转染后荧光显微镜检,免疫荧光、免疫细胞化学、WesternBlot等方法验证蛋白表达。按实验设计分别加入不同药物浓度的三苯氧胺、雌激素。④流式细胞术观察细胞周期情况。MTT法检测细胞相对活性。结果①以IRES2-EGFP为蓝本改造的pReceiver-M72-ERβ及其剪切体pReceiver-M72-ERβ△成功构建。②转染ERβ后细胞生长速度加快,细胞周期中G1期比例减少,S期比例增加,克隆形成能力增强;转染ERβ△后细胞系相对活性及细胞周期未见明显改变;雌激素及tamoxifen对转染ERβ及其剪切体ERβ△的细胞生长无明显影响。结论 ERβ单独表达促进MDA-MB-231细胞生长,增加细胞相对活性及克隆形成能力;转染ERβ的三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中对雌激素及雌激素抑制剂tamoxifen无明显反应。     

乳腺癌组织中ERα与ERβ的表达及诊断意义

目的探讨乳腺癌组织中雌激素α受体（ERα）和雌激素β受体（ERβ）蛋白表达对乳腺癌诊断的意义。方法用免疫组化SP法检测85例乳腺癌组织和32例癌旁正常组织中ERα和ERβ蛋白的表达情况。结果乳腺癌组织ERα蛋白阳性表达率（75．3％）高于癌旁正常组织（28．1％）（P=0．001）;乳腺癌组织ERβ阳性表达率（52．9％）低于癌旁正常组织（78．1％）（P=0．013）;ERα和ERβ阳性表达均与组织学分级有关,高分化组ERα阳性表达率高于中、低分化组（P=0．035）,而高分化组ERβ阳性表达率明显低于中、低分化组（P=0．042）;但ERα和ERβ阳性表达均与肿瘤大小、临床分期、有无淋巴结转移无关（P〉0．05）。结论ERα在乳腺癌的发生、发展过程中发挥着重要作用,ERβ随细胞恶变发生改变,联合检测ERα和ERβ对乳腺癌的诊断、治疗及预后判断有一定意义。     

Gβ，Gβγ与腺苷酸环化酶Ⅱ在酵母双杂交和三杂交系统中的相互作用

目的 探讨G蛋白β和γ亚基在Gβγ与效应器相互作用中的地位,特别是γ亚基在此相互关系中的作用。方法 利用酵母双杂交和自行构建的酵母三杂系统分别研究Gβ1和Gβγ2与腺苷酸环化酶Ⅱ（ACⅡ）的相互作用。结果 发现酵母三杂交系统中AD－β、γ2和BD－ACⅡ间的朴素作用明显强于双杂交系统中AD－β、和BD－ACⅡ的相互作用。对BD－ACⅡQ和AD－β、在酵母双杂交系统和三杂交系统中的表达进行免疫印迹杂交分析,发现其表达水平与β、兰乳糖苷酶活力大小无关,即酵母三杂交系统和双杂交系统中相互作用的显著差别不是由BD－ACⅡQ和AB－β1蛋白表达水平的差异所造成。结论 β亚基对维持Gβγ与ACⅡ的相互作用十分重要,而γ亚基的存在显著增强了β亚基与ACⅡ的相互作用,对维持Gβγ与ACⅡ的高亲和性很重要。     

卵巢癌组织中EphA2与ERβ的表达

目的:探讨卵巢癌组织中EphA2与雌激素受体ERβ的表达及相关性。方法:应用免疫组化法对118例卵巢癌组织进行EphA2、ERβ检测,对其中10例EphA2及ERβ阳性表达的冰冻组织标本,应用激光捕获显微切割技术(LCM)捕获卵巢癌细胞,应用Western印迹分析方法检测其中EphA2及ERβ蛋白表达水平。结果:卵巢癌组织中ERβ及EphA2阳性率分别为99.2%(117/118)和90.7%(107/118);EphA2表达与卵巢癌患者的年龄、组织学类型及残余肿瘤大小无关(P>0.05),而与FIGO分期、组织分化程度有关(P<0.05);ERβ表达与卵巢癌患者的年龄、组织学类型、FIGO分期、残余肿瘤大小无关(P>0.05),与组织分化程度有关(P<0.05);ERβ与EphA2的表达有相关性(rs=0.184,P<0.05)。Western印迹分析,EphA2蛋白和ERβ蛋白条带强度一致。结论:ERβ与E-phA2蛋白可能与卵巢癌的进展有关。     

ERβ在乳腺癌中的研究进展

雌激素受体亚型ERβ可能与ERα共同参与和调节乳腺癌的发生与发展,并影响其激素治疗的敏感性和预后。对ERβ的研究将为乳腺癌预后推测,指导临床更精确更有效个体化内分泌治疗提供可能。     

利用酵母双杂交筛选与DAT1的LIM2相互作用的蛋白质

目的利用酵母双杂交系统筛选人胎脑组织中能与多巴胺相关转录因子DAT1的LIM2相互作用的蛋白质,以初步了解DAT1的功能.方法构建酵母双杂交诱饵质粒pLexA-LIM2,筛选人胎脑cDNA文库,并用酵母交配试验初步验证.结果获得3个能与DAT1的第2个LIM结构域LIM2结合的相互作用蛋白,通过酵母结合试验证实了它们在酵母中的结合.结论DAT1的第2个LIM结构域LIM2可与唐氏综合征关键区基因2(Similar to Down syndrome critical region gene2,DSCR2)、钙-整合素结合蛋白(calcium and integrin binding protein,CIB)、和HSPC170(CD34 hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs)结合.     

GPER、ERα及 ERβ 在甲状腺乳头状癌中的表达与临床特征关系

目的探讨新型雌激素受体-G蛋白偶联受体与ERα、ERβ在甲状腺癌组织中的表达特征及其与患者临床资料的相关性。方法选取2014年2月～2017年9月我院普通外科85例甲状腺乳头状腺癌组织标本,平均年龄38.7(23～77)岁,对组织标本进行免疫组化染色,分析甲状腺癌组织中G蛋白偶联受体、ERα及ERβ的表达特征。结果甲状腺乳头状癌组织中GPER、ERα及ERβ阳性表达率分别为63.5%、71.8%、67.1%,呈高表达状态;但这三种雌激素受体表达的阳性率与患者年龄、性别、肿瘤分期、淋巴结转移状态、肿瘤大小等无明显相关;GPER与ERα及ERβ的表达呈正相关。结论三种雌激素受体包括G蛋白偶联受体、ERα及ERβ均与甲状腺癌的发生、发展密切相关,是极具研究价值的潜在治疗靶点。     

应用酵母双杂交系统筛选新基因AngRem104相关蛋白

目的：应用酵母双杂交系统筛选与新基因AngRem104相互作用的蛋白，为该基因的功能研究提供线索。方法：构建AngRem104的真核表达载体AngRem104-pGBKT7／c—myc，转化酵母菌AH109，Western blot证实蛋白表达，进行毒性和自激活检验，与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合，筛选与AngRem104相互作用的蛋白。结果：AngRem104蛋白能在酵母中正常表达，对酵母细胞无毒性，不存在自激活现象。筛选出的蛋白包括真核翻译延伸因子1α1、糖皮质激素受体AF-1特异延伸因子、β2-微球蛋白、巴戴-比德尔综合征2蛋白及4个与细胞代谢有关的蛋白。结论：AngRem104可能影响细胞内某些转录因子活性和细胞代谢，并与某些免疫相关疾病和遗传病发病有关。酵母双杂交结果为AngRem104的功能研究提供了重要线索。     

ERα和ERβ在不同类型乳腺组织的表达及其意义

目的 探讨乳腺正常组织经良性病变至癌变过程中雌激素受体(ER)亚型ERα和ERβ表达的变化及其意义.方法 用免疫组化EnVision两步法检测94例女性浸润性乳腺癌、乳腺原位癌、良性病变和正常乳腺组织的雌激素受体亚型表达.结果 ERα局限表达于乳腺腺上皮细胞核,相反ERβ广泛表达于腺上皮细胞、间质细胞、肌上皮细胞、内皮细胞和淋巴细胞,且多见细胞质、细胞核同时表达.正常乳腺组织和乳腺良性病变组织的上皮细胞ERα、ERβ染色结果相似;浸润性乳腺癌和乳腺原位癌的ERα表达明显降低;浸润性乳腺癌ERβ表达明显降低;浸润性乳腺癌和乳腺原位癌ERα、ERβ的共表达明显降低.结论 ERβ广泛表达于间质细胞可能与其旁分泌作用有关.ERβ可能与乳腺癌的发生有关,而在乳腺癌中ERβ可能减弱对ERα的调节作用.     

运用酵母双杂交系统筛选肌营养不良相关蛋白2(DRP2)相互作用蛋白

目的应用酵母双杂交系统筛选小鼠、大鼠、人类大脑文库中与DRP2相互作用的蛋白,分析中枢神经系统中DRP2分子复合体的组成成分。方法设计3个含有DRP2不同蛋白结构域的诱饵质粒,在完成诱饵质粒的自激活性的鉴定后,对小鼠、大鼠、人类脑MATCHMAKER cDNA文库进行筛选。结果运用DRP2蛋白N-Bait筛选大鼠脑MATCHMAKER cDNA文库,笔者获得了一个阳性文库质粒。该质粒的插入子编码一种SNAP25相互作用的蛋白质Scoilin。Scoilin又被命名为Zwint-1蛋白。同时笔者还确定了这两种相互作用蛋白质的精确结构域:DRP2蛋白以其含有两个Spectrin重复和一个WW蛋白结构域的氨基端与Scoilin(Zwint-1)全蛋白相互作用。结论应用酵母双杂交,笔者于大鼠大脑中找到了DRP2的相互作用的蛋白质Scoilin(Zwint-1),并且确定了这两种相互作用蛋白质的精确结构域。     

酵母双杂交研究肾癌中Wnt/Frizzled信号通路的传导

目的 为研究肾癌中Wnt／Frizzled信号通路的传导,尤其是TCF4(T Cell Factor)的作用。方法 构建肾癌酵母双杂交文库及hTCF4酵母双杂交表达载体;通过酵母双杂交技术,以hTCF4为诱饵蛋白,自肾癌酵母双杂交文库中钓出与hTCF4相互作用的蛋白。结果 共钓出与hTCF4相互作用的阳性克隆67个,其中包括β-连环蛋白,TCF4,转录激活因子5,锌指蛋白和人类基冈组文库克隆1980等。结论肾癌中存在Wnt／Frizzled信号通路,其重要信号分子hTCF4与β-连环蛋白相互作用,尚可以自身相互作用形成同源二聚体或同源共聚体,从而发挥其转录因子的作用。     

酵母双杂交研究小鼠肝脏再生TGF-β调控通路中相关转录因子的相互作用

目的采用酵母双杂交系统研究肝脏再生调控途径转化生长因子β(TGF-β)信号通路中4种转录因子的相互作用。方法经CCl4腹腔注射诱导建立小鼠肝损伤再生模型,提取模型小鼠肝脏组织总RNA作为模板,经RT-PCR获得cDNA。经肝脏再生基因芯片检测显示差异表达且与TGF-β信号通路相关的激活转录因子3(ATF3)、DNA结合抑制因子3(ID3)、DNA损伤诱导的转录因子3(DDIT3)和LIM蛋白家族成员FHL2(FHL2)作为候选基因,进行基因克隆和载体构建,PCR及DNA测序鉴定。采用酵母双杂交系统进行自激活检测实验和酵母双杂交实验,观察ATF3、FHL2、DDIT3和ID3之间的相互作用。结果 PCR及DNA测序鉴定表明,ATF3、FHL2、DDIT3、ID3基因克隆与载体构建成功。自激活检测显示ATF3、FHL2、DDIT3和ID3不存在自激活现象;酵母双杂交实验发现7对蛋白互作,分别为ID3/ATF3、FHL2/ATF3、ATF3/ATF3、FHL2/FHL2、ID3/FHL2、ID3/ID3和ID3/DDIT3。结论 ATF3、FHL2和ID3间的蛋白互作可能对TGF-β信号通路具有调控作用;蛋白互作网...     

ERBIN蛋白PDZ结构域结合蛋白的筛选和鉴定

目的 筛选和鉴定ERBIN蛋白的PDZ结构域结合蛋白。方法 以ERBIN蛋白的PDZ结构域为诱饵,采用酵母双杂交系统从人淋巴细胞白血病细胞系的MATCHMAKERcDNA文库中筛选ERBINPDZ结合蛋白,使用β-半乳糖苷酶（LacZ）活性的定性分析和免疫共沉淀技术鉴定所获结合蛋白识别和结合ERBINPDZ结构域的结合特性。结果 TAX1蛋白能选择性与ERBIN蛋白的PDZ结构域发生特异性结合。结论 TAX1蛋白是ERBIN结合蛋白家族中的一个新成员。     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A/Guangdong/7028/2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性;酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5.22%,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾/钠ATP酶β1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体γ亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

酵母双杂交研究小鼠肝脏再生TGF-β调控通路中相关转录因子的相互作用

目的 采用酵母双杂交系统研究肝脏再生调控途径转化生长因子β(TGF-β)信号通路中4种转录因子的相互作用.方法 经CCl4腹腔注射诱导建立小鼠肝损伤再生模型,提取模型小鼠肝脏组织总RNA作为模板,经RT-PCR获得cDNA.经肝脏再生基因芯片检测显示差异表达且与TGF-β信号通路相关的激活转录因子3(ATF3)、DNA结合抑制因子3(ID3)、DNA损伤诱导的转录因子3(DDIT3)和LIM蛋白家族成员FHL2(FHL2)作为候选基因,进行基因克隆和载体构建,PCR及DNA测序鉴定.采用酵母双杂交系统进行自激活检测实验和酵母双杂交实验,观察ATF3、FHL2、DDIT3和ID3之间的相互作用.结果 PCR及DNA测序鉴定表明,ATF3、FHL2、DDIT3、ID3基因克隆与载体构建成功.自激活检测显示ATF3、FHL2、DDIT3和ID3不存在自激活现象;酵母双杂交实验发现7对蛋白互作,分别为ID3/ATF3、FHL2/ATF3、ATF3/ATF3、FHL2/FHL2、ID3/FHL2、ID3/ID3和ID3/DDIT3.结论 ATF3、FHL2和ID3间的蛋白互作可能对TGF-β信号通路具有调控作用;蛋白互作网络可作为肝损伤再生机制研究的途径之一.