Wistar大鼠热休克蛋白70基因重组腺病毒质粒的构建及病毒制备

目的构建Wistar大鼠热休克蛋白(Heat shock protein 70,HSP70)基因重组腺病毒质粒,并制备重组腺病毒。方法利用RT-PCR技术从Wistar大鼠脾脏组织中扩增HSP70基因序列,并克隆至pMD18-T载体中,测序鉴定后,将克隆的HSP70基因编码阅读框亚克隆至穿梭载体pShuttle-CMV中,并利用Ⅰ-CeuⅠ与Ⅰ-SceⅠ将重组穿梭质粒上的HSP70基因的表达框切下,连接到携带腺病毒骨架载体pAdxsi上。重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后,转染至293(R)细胞进行病毒的包装,获得重组腺病毒pAd-CMV-HSP70,收集病毒上清,感染BRL细胞,Western blot检测BRL细胞中HSP70的表达。病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后,检测重组腺病毒纯度、颗粒滴度及感染性滴度。结果克隆质粒、穿梭质粒经PCR及酶切鉴定,均可见2 269 bp的目的基因条带,测序结果与GenBank登录的序列一致;XhoⅠ酶切结果显示,HSP70基因已正确克隆至腺病毒质粒中;重组腺病毒感染BRL细胞后,细胞中HSP70的表达量显著升高(P<0.01);重组腺病毒纯化后纯度为1.29,颗粒滴度为5.31×1012VP/ml,感染性滴度达1×1011pfu/ml。结论已成功构建Wistar大鼠HSP70基因重组腺病毒质粒,并制备出高滴度的重组腺病毒颗粒,为进一步研究HSP70的生物学活性及作用机制奠定了基础。     

大鼠活化STAT蛋白抑制剂1基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠活化STAT蛋白抑制剂1(Protein inhibitor of activated STAT1,PIAS1)基因重组腺病毒质粒,并进行鉴定。方法应用RT-PCR法从大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞株中扩增全长PIAS1基因,经T-A克隆后,亚克隆至穿梭质粒pDC316中,利用同源重组将腺病毒骨架质粒Nad5/F35和穿梭质粒pDC316-PIAS1共转染293细胞,获得重组腺病毒质粒Ad5/F35-PIAS1,经包装和扩增后,获得重组腺病毒。RT-PCR检测PIAS1基因的表达;荧光显微镜观察病毒感染情况;Western blot检测PIAS1蛋白的表达;并计算重组腺病毒的滴度。结果从AR42J细胞中扩增出1 956 bp的PIAS1基因片段,重组腺病毒质粒Ad5/F35-PIAS1经双酶切鉴定证明构建正确。RT-PCR及Western blot分析显示,PIAS1基因和蛋白已在293细胞中表达;荧光显微镜观察显示,重组腺病毒的感染率达90%;病毒滴度为4.45×1010 PFU/ml。结论已成功构建了大鼠PIAS1基因重组腺病毒质粒,为进一步研究PIAS1基因在相关疾病中的作用及其临床应用奠定了基础。     

PLCε基因shRNA重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的构建携带绿色荧光蛋白(GFP)标签的表达PLCε基因shRNA的重组腺病毒质粒Ad-U6-PLCε,为应用基因沉默技术研究膀胱癌的基因治疗奠定基础。方法将干扰质粒pGenesil-PLCε及阴性对照质粒pGenesil-NP的表达启动子U6及shRNA序列克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的穿梭质粒pAdTrack,经酶切及测序鉴定正确后,将重组穿梭质粒经PmeI线性化,转化感受态AdEasier。重组pAdEasy-U6-PLCε质粒经PacI线性化后,转染HEK-293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-PLCε,经大量扩增后测定病毒滴度,RT-PCR及Western blot检测T24细胞内PLCε的表达情况。结果酶切及测序鉴定证实pAdTrack-U6-PLCε及重组pAdEasy-U6-PLCε质粒构建正确,并成功转染至HEK-293细胞,重组腺病毒Ad-U6-PLCε滴度达1.5×1012,经重组腺病毒感染的T24细胞内PLCεmRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论已成功构建针对PLCε基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-PLCε,为应用基因沉默技术研究PLCε对膀胱癌发生发展的作用奠定了基础。     

外源性p53基因增强卵巢癌细胞对化疗和放疗的敏感性

目的 探讨外源性p53基因转染对人卵巢癌细胞系的化疗、放疗敏感性的影响。方法 用分子克隆技术构建人野生型 p53基因与真核细胞表达载体 pcDNA3的重组体（pcDNA-p53）,并用脂质体介导的转染技术,将其导入不表达p53的卵巢癌SKOV-3细胞中,经 G418筛选,Northern blot及Western blot鉴定后,观察p53基因转染对顺铂或X线放射作用的SKOV-3细胞的集落形成的影响。结果 成功地构建了人野生型p53基因与真核细胞表达载体的重组体。外源性 p53基因在转染细胞中有效表达,增强了顺铂或X线放射对 SKOV-3细胞集落形成的抑制作用。结论 外源性p53基因能增强卵巢癌细胞对顺铂或放射的敏感性,p53基因治疗与化疗或放疗联合作用能更大程度地杀灭肿瘤细胞。     

重组hTRAIL腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达hTRAIL基因的重组腺病毒载体。方法以重组质粒pThioHisA-TRAIL中提取的TRAIL基因为模板,采用PCR法扩增基因片段。将扩增的基因片段插入穿梭质粒pShuttle-CMV,并转化大肠肝菌DH5α。筛选重组质粒pShuttle-CMV-TRAIL,电转化已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞。筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-TRAIL,用Lipofectamine转染293细胞,制备携带人全长TRAIL基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-TRAIL)。氯化铯密度梯度离心法纯化Ad-TRAIL病毒颗粒,并测定病毒滴度。采用RT-PCR法检测TRAIL基因在293细胞中的转录。以Ad-TRAIL转染YTMLC细胞,采用免疫荧光法和流式细胞术检测TRAIL基因的表达。结果纯化后的Ad-TRAIL病毒颗粒数为2.77×1012VP/ml,感染性滴度为109.5(3.2×109)CCID50/ml。经RT-PCR扩增出约843bp的基因片段,与目的片段大小一致。流式细胞术和免疫荧光法均检测到TRAIL在YTMLC细胞中的表达,表达产物主要存在于细胞质中。结论已成功构建了表达hTRAIL重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了依据。     

禽呼肠孤病毒σC蛋白重组腺病毒载体的构建及其对肝癌细胞增殖的影响

目的 构建表达禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)σC蛋白的重组腺病毒载体pAd-σC,并检测其对肝癌细胞增殖的影响,为新型抗肿瘤疫苗的研发奠定基础。方法 采用PCR法扩增ARVσC基因,构建重组穿梭载体pShuttle-σC,随后转化含有腺病毒载体pAdessy-1的BJ5183感受态细胞,通过同源重组获得重组腺病毒载体pAd-σC,在HEK293细胞内包装病毒,TCID50法检测病毒滴度,Western blot和ELISA法检测σC蛋白的表达,CCK-8法检测病毒对人肝癌细胞SMMC7721增殖的影响。结果 重组穿梭载体pShuttle-σC经双酶切及测序鉴定证明构建正确,重组腺病毒载体pAd-σC经菌落PCR鉴定证明构建正确;σC蛋白在肝癌细胞SMMC7721中可成功表达;重组腺病毒Ad-σC效价为10^7.5/0.1 mL,可抑制肝癌细胞SMMC7721增殖。结论 成功构建了含有ARV σC基因的重组腺病毒载体pAd-σC,初步分析其对肿瘤细胞增殖具有抑制作用,为揭示ARV溶瘤效应的分子机制及进一步研发新型抗肿瘤生物制剂奠定了基础。     

重组腺病毒Ad-NLS-RARα的构建及其在K562细胞中的表达

目的构建含NLS-RARα基因的重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并检测其在K562细胞中的表达。方法以质粒pGBKT7-PML-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,与穿梭质粒dTrace-TO4连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TO4-NLS-RARα,经PmeⅠ酶切线性化后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒pAd-NLS-RARα,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-NLS-RARα,经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度,并进行PCR及测序鉴定;将重组腺病毒感染K562细胞,采用流式细胞术测定感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NLS-RARα在K562细胞中的转录及表达水平。结果重组腺病毒Ad-NLS-RARα经4轮扩增后,滴度可达6.9×108pfu/ml,PCR及测序鉴定证明构建正确,对K562细胞的感染效率可达70%左右;重组腺病毒Ad-NLS-RARα携带的NLS-RARα基因可在K562细胞中高效表达。结论已成功构建了重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并在K562细胞中高效表达了NLS-RARα基因。     

重组丙型肝炎病毒腺病毒载体疫苗rAd/E2的构建及鉴定

目的构建含丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)E2基因的复制缺陷型重组腺病毒载体疫苗,并进行鉴定。方法以含HCV(1a亚型)E2基因的质粒pEGFP-HCV/E1E2为模板,PCR扩增E2基因,扩增产物与pGEM-T载体连接,测序正确后双酶切亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2,Pme I酶切线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd/E2,PacⅠ酶切线性化后,脂质体LipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒rAd/E2,在HEK293细胞内扩增,利用报告基因GFP的表达监测病毒包装及感染效率,PCR、RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,并测定各代病毒的滴度。结果测序结果证明HCV E2基因序列正确;重组腺病毒质粒pAd/E2经酶切证明重组成功;PCR、RT-PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒rAd/E2构建正确;第4代重组腺病毒的滴度为7.5×108 pfu/ml。结论已成功构建了重组HCV腺病毒rAd/E2,为丙型肝炎疫苗的研制提供了新的途径。     

嵌合泛素连接酶TrCP-CC及其突变体△F-CC重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建嵌合泛素连接酶TrCP-CC及其突变体△F-CC的重组腺病毒,并检测其表达。方法采用PCR和重叠PCR法构建真核表达质粒Migr1-TrCP-CC-HA和Migr1-△F-CC-HA,以此为模板,通过PCR将其克隆至穿梭质粒pAd-Track-CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-TrCP-CC和pAdTrack-△F-CC,再与骨架载体pAdeasy-1经同源重组得到重组腺病毒质粒pAd-TrCP-CC和pAd-△F-CC,转染HEK293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒Ad-TrCP-CC和Ad-△F-CC,测定其滴度,并经RT-PCR检测目的基因的转录水平。结果经酶切和测序证实重组腺病毒质粒pAd-TrCP-CC和pAd-△F-CC构建正确,经HEK293细胞包装后显微镜下可观察到绿色荧光,病毒滴度分别为2.5×109和1.0×109pfu/L,经RT-PCR检测目的基因可有效表达。结论已成功构建重组腺病毒Ad-TrCP-CC和Ad-△F-CC,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步研究其靶向融合蛋白Bcr-Abl泛素化和降解的机制奠定了基础。     

嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB~*的构建与鉴定

目的构建携带FLAG-3NLS-FRB*融合基因的嵌合腺病毒,并检测其在AD-293细胞中的表达。方法将FLAG标记的3段核定位信号(FLAG-3NLS)与突变修饰的雷帕霉素靶FRB结构域(FRB*)基因通过重叠PCR技术拼接成FLAG-3NLS-FRB*,定向克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pAd5F35在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,感染AD-293细胞进行包装、扩增。采用基因转移单位(Gene transfer unit,GTU)法测定病毒滴度;RT-PCR及Western blot检测FLAG-3NLS-FRB*在AD-293细胞中的转录及表达。结果腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-FLAG-3NLS-FRB*经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;FLAG-3NLS-FRB*正确克隆至腺病毒骨架质粒中;在AD-293细胞中包装、扩增获得了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,病毒滴度为2.0×1013GTU/ml;嵌合腺病毒感染AD-293细胞后36 h,在细胞中可检测到FLAG-3NLS-FRB*基因的转录和蛋白的表达。结论成功构建了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,并在AD-293细胞中成功表达了FLAG-3NLS-FRB*融合蛋白。     

hepaCAM基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建表达肝细胞黏附分子(Hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)基因的重组腺病毒质粒,并进行鉴定。方法以质粒pEGFP-N2-hepaCAM为模板,PCR扩增hepaCAM基因,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将重组腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-hepaCAM经PmeⅠ线性化,转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM经PmeⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,包装重组腺病毒AdI-hepaCAM,经大量扩增后,检测病毒滴度。RT-qPCR及Westernblot检测感染的BIU-87细胞内hepaCAM的表达。结果酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM构建正确,重组腺病毒AdI-hepaCAM滴度可达1.6×1012pfu/ml,与空载体腺病毒组比较,经重组腺病毒感染的BIU-87细胞中hepaCAM mRNA及蛋白的表达均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带hepaCAM的重组腺病毒载体AdI-hepaCAM,为研究hepaCAM基因对膀胱癌细胞增殖的调控提供依据。     

Pre-miR-10a重组腺病毒质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的构建pre-miR-10a(miR-10a前体)重组腺病毒表达质粒,感染K562细胞,并检测其基因表达水平。方法化学合成pre-miR-10a基因序列,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,将构建正确的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV pre-miR-10a与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183感受态细胞,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,经4轮扩增后检测病毒滴度。收集病毒后,以100 MOI感染K562细胞,RT-PCR法检测miR-10a基因的转录水平。结果重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a经PacⅠ酶切,证明带有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中,4轮扩增后腺病毒滴度为1.5×1011pfu/ml,可高效感染K562细胞,感染效率达90%以上;重组腺病毒Ad-pre-miR-10a感染的K562细胞中miR-10a基因转录水平明显升高,过表达率为150.82%。结论已成功构建重组腺病毒表达质粒pAd-pre-miR-10a,并可在K562细胞中高效表达,为进一步从体内和体外水平研究其抗白血病效应奠定了基础。     

人GINS2基因重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的利用AdEasy系统构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,并进行鉴定。方法以pcDNA3.1-GINS2质粒为模板,PCR扩增GINS2基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2,经双酶切及测序鉴定正确的阳性质粒与骨架质粒pAdEasy-1同时转化感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdE-GINS2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-GINS2,大量扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。Western blot法检测重组腺病毒感染的人HL60细胞中GINS2蛋白的表达,MTT法检测重组腺病毒感染对HL60细胞增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2经双酶切及测序证明构建正确;经酶切鉴定证明重组腺病毒质粒pAdE-GINS2构建正确;经PCR鉴定证明重组腺病毒Ad-GINS2包装成功,经3轮扩增后病毒滴度可达1.35×1012IU/ml;与空载体感染及未感染的HL60细胞相比,重组腺病毒感染的HL60细胞内GINS2蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,感染人HL60细胞后可促进其增殖,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

抗菌肽PR-39重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的构建抗菌肽PR-39(Proline-arginine rich 39-amino acid peptide,PR-39)重组腺病毒表达质粒。方法从含抗菌肽PR-39核心编码区的质粒中扩增PR-39基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组穿梭质粒,经PmeⅠ酶切线性化后,转化感受态AdEasier细胞,构建重组腺病毒质粒,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度检测。将重组腺病毒感染鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2,通过荧光显微镜观察红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)的表达,RT-PCR法检测PR-39基因的转录水平。结果重组腺病毒穿梭质粒pAd-Trace-TO4-PR-39经KpnⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组腺病毒质粒pAdPR-39经PacⅠ酶切鉴定,证明目的基因已整合到腺病毒基因组中;第4代重组腺病毒AdPR-39的病毒滴度为1010IU/ml;感染重组腺病毒AdPR-39的C3H10T1/2细胞可表达RFP;PR-39基因在C3H10T1/2细胞内成功转录。结论已成功构建携带RFP的PR-39重组腺病毒表达质粒,在鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中可高效表达。     

重组腺病毒Ad5/F35-HF2S的构建及其鉴定

目的构建携带HA标签的重组腺病毒Ad5F35-HF2S。方法体外合成HA标签DNA双链,以K562细胞cDNA为模板,分别扩增FKBP1、FKBP2和SH2基因,依次亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV-HA中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAd5/F35在Ad5/F35-BJ5183感受态细胞中同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5/F35-HF2S,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD-293细胞进行包装、扩增,获得重组腺病毒Ad5/F35-HF2S,经2轮扩增后,测定病毒滴度;采用PCR及Western blot法检测感染细胞中HF2S基因的转录及蛋白的表达。结果重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S及重组腺病毒质粒pAd5/F35-HF2S经鉴定均构建正确;经包装及2轮扩增后,重组腺病毒Ad5/F35-HF2S病毒滴度可达1013IU/ml;经PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的HF2S基因能够在AD-293细胞中表达。结论已成功构建了表达HF2S基因的重组腺病毒Ad5/F35-HF2S,为研究Grb2-SH2结构域在CML中的基因治疗和作用机制奠定了基础。