RNA干扰内源性一氧化氮合酶基因对舌鳞状细胞癌细胞增殖活性影响的实验研究

目的研究内源性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）对肿瘤细胞凋亡和增殖活性的影响。方法采用RNA干扰技术，将含有iNOS基因的特异性短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）片断的质粒载体转染人Tca8113细胞，免疫组化检测细胞中iNOS的蛋白表达改变情况；流式细胞仪及甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测细胞凋亡率和生长曲线的变化情况。结果质粒转染人Tca8113细胞后，实验组细胞中iNOS蛋白表达显著低于两对照组（P〈0．01）；而凋亡率明显高于两对照组（P〈0．01）；生长曲线显示实验组细胞增殖活性受到一定抑制。结论RNA干扰技术沉默iNOS基因可提高Tca8113细胞的凋亡，并降低细胞的增殖活性。     

siRNA抑制人舌癌细胞VEGF表达对MMP-2、-9及TIMP-1、-2蛋白表达的影响

【摘要】目的利用小干扰RNA （ small interfering RNA ,siRNA） 抑制人舌癌TcaSll3细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF ）表达,观察其对培养细胞和移植瘤基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs ）2、-9及基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinases ,T IMPs）-1、-2蛋白表达的影响。方法以稳定转染携带VEGF．siRNA真核表达载体的Tca8113细胞（VEGF—siRNAl、VEGF—siRNA2）为实验组,以转染空载体的及未转染的Tca8113细胞为实验对照组和空白对照组。将细胞分别接种于裸鼠皮下,用免疫组化法分别测定各组培养细胞和移植瘤VEGF、MMP-2、-9及TIMP．1、-2的蛋白表达。结果各组培养细胞及移植瘤VEGF免疫组化染色：VEGF．siRNAl组、VEGF—siRNA2组与实验和空白对照组相比,平均阳性率降低,平均灰度值增高（P〈0．05）;各组培养细胞均未检测出MMP-2、-9及TIMP-1、-2蛋白的阳性表达。各组移植瘤MMP-9、TIMP-1、-2可见阳性表达,但各组染色平均阳性率及平均灰度值之间的差异无统计学意义（P〉0．05）,而MMP-2未见明显阳性表达。结论以siRNA干扰沉默人舌癌Tca8113细胞VEGF基因,可明显抑制细胞及移植瘤内VEGF蛋白表达,但是对MMP-2、-9及TIMP-1、-2蛋白的表达无明显影响。     

载体携带小干扰RNA抑制Tca8113细胞血管内皮生长因子的表达

目的了解小干扰RNA（siRNA）对人舌癌细胞株Tca8113血管内皮生长因子（VEGF）表达的抑制作用。方法构建2对针对血管内皮生长因子的siRNA真核表达载体（Pu-VEGF-siRNA1，Pu-VEGF-siRNA2），经脂质体Lipofectamine2000转染Tca8113细胞，以空载体组作实验对照组，未转染组作空白对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组化、酶联免疫吸附（ELISA）方法分别检测转染后的Tca8113细胞VEGF mRNA及蛋白表达。结果与实验对照组和空白对照相比较，转染Pu-VEGF-siRNA1和Pu-VEGF-siRNA2后Tca8113细胞的VEGF mRNA 和蛋白表达明显下降。结论通过RNA干扰技术能有效抑制舌癌Tca8113细胞VEGF mRNA和蛋白的表达。     

热放疗对舌鳞癌Tca8113细胞及其耐药细胞株耐药性的影响

目的：探讨热放疗对舌鳞癌Tca 8113细胞和耐药的Tca 8113／CBDEA细胞耐药性的影响。方法：实时定量逆转录PCR（RT—PCR）检测热放疗对Tca 8113细胞和耐药的Tca 8113／CBDEA细胞多药耐药基因1（MDR1）、多药耐药相关蛋白1基因（MRP1）和谷胱甘肽硫-转移酶π基因（GST-π）表达的影响和检测热放疗对细胞内阿霉素浓度的影响。结果：Tca 8113／CBDEA和Tca 8113细胞热放疗后耐药基因MDR1的表达在4h和24h无明显改变（P〉0．05）。MRP1基因的表达在4h和24h组均有明显下降（P〈0．05），GST-π基因表达在4h组Tca 8113和Tca 8113／CBDEA的表达无明显改变（P〉0．05），在24h组有明显下降（P〈0．05）．热放疗以后肿瘤细胞内阿霉素（ADM）浓度有明显上升。结论：热放疗联合应用抑制了放疗造成的耐药基因表达上升，增加了细胞内的药物浓度，热放疗联用不会促使肿瘤细胞产生MDR。     

缺氧条件下缺氧诱导因子-1α对人舌鳞癌细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的探讨缺氧条件下缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）对人舌鳞癌细胞株Tca8113细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响。方法采用RT—PCR技术半定量检测人Tca8113细胞常氧和缺氧培养0．5、1、3、6、12和24h HIF-1α、VEGF基因的表达。结果缺氧条件下HIF—1α基因的表达呈先升后降的趋势，在缺氧6、12h表达显著高于常氧组（P〈0．05）；VEGF的表达在缺氧培养0．5、1、3、12及24h均高于常氧组（P〈0．05）；VEGF基因的表达在缺氧初始阶段随HIF—1α基因表达的增强而升高，但Spearman相关分析显示两者在缺氧24h内相关性不明显（rs=0．5750，P〉0．05）。结论缺氧条件下Tca8113细胞中VEGF的高表达受HIF—1α的调控和影响，是多种因素作用的结果。     

RNA干扰TEAD基因对舌癌细胞系Tca8113增殖和侵袭的影响

目的：应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113中内源TEAD基因的水平,观察TEAD基因对舌癌细胞生物学行为的影响。方法：构建针对TEAD基因特异性siRNA真核表达载体,将其转染至Tea8113,采用RT—PCR法检测转染后的Tca8113细胞中TEAD基因的表达。采用CCK8技术检测细胞的增殖情况,采用Transwell法检测细胞的迁移情况。实验数据采用SPSSl3．0软件包进行单因素方差分析。结果：siRNA干扰Tea8113细胞后,TEAD基因的表达水平显著下降（P〈0．05）,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降。结论：通过RNA干扰技术阻断TEAD的表达,可抑制,rca8113细胞的生长、增殖、迁移,提示TEAD基因在舌癌的发生、发展过程中起着重要作用。     

VEGF靶向RNA干扰质粒构建及其对人舌鳞癌Tca8113细胞的影响

目的：用RNA干扰技术阻断人舌鳞癌系Tca8113细胞中VEGF基因的表达,观察细胞增殖及凋亡特征。方法：检测人舌鳞癌系Tca8113细胞中血管内皮生长因子VEGF表达水平;采用真核转录质粒pRNA-U6.1/Neo构建针对VEGF基因的重组转染质粒。将4种不同序列的VEGF-shRNAV1、VEGF-shRNAV2、VEGF-shRNAV3、VEGF-shRNAV4质粒以及含与VEGF无关序列的VEGF-shRNAVc和空白质粒VEGF-shRNAU6分别转染Tca8113细胞,48h后检测其VEGF表达水平,筛选稳定转染RNAi-VEGF的细胞;CCK8检测其增殖能力;流式细胞仪检测其细胞周期;Anexin-V-PI检测其凋亡特征。结果：RT-PCR和Western blot检测：Tca8113细胞阳性表达VEGF;用Lipofectamine 2000成功将不同VEGF片段的质粒转染入Tca8113细胞;RT-PCR发现,VEGF-shR-NAV2组细胞VEGF表达被显著抑制,用400ng/mLG418压力筛选获得VEGF稳定被抑制的细胞系;CCK8检测各组Tca8113细胞增殖见VEGF-shRNAV2组增殖能力小于VEGF-shRNAVc组和VEGF-shRNAU6组;转染VEGF-shRNAV2的Tca8113细胞G0-G1期细胞较VEGF-shRNAVc组和VEGF-shRNAU6组高,且细胞凋亡多。结论：用RNA靶向干扰能明显降低人舌鳞癌Tca8113细胞内VEGF的表达并抑制肿瘤细胞增殖及促进凋亡。     

舌鳞状细胞癌顺铂耐药细胞系细胞周期蛋白D1RNA干扰的体外研究

目的 用人工合成的耐药相关基因细胞周期蛋白D1（cyclin D1）的小分子干扰RNA（siRNA）处理人舌鳞癌顺铂耐药细胞系（Tca8113-CDDP），探讨对靶基因转录调控的作用效果以及剂量和时间效应关系，为耐药性逆转提供实验依据。方法 CY^3荧光素标记阳性对照基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）siRNA，分别于转染后4、24、48、72h在激光共聚焦显微镜下观察瞬时转染率，优化转染条件。用SYBR绿色荧光染料法、实时定量PCR技术分析目的基因mRNA的表达情况，同时采用蛋白印迹（Western blot）检测目的基因蛋白水平的表达。四甲基偶氮唑盐法检测cyclin D1 siRNA处理后细胞对顺铂敏感性的影响。结果 优化转染条件后，Tca8113-CDDP细胞中CY^3的GAPDH siRNA转染率达90％以上。转染cyclin D1 siRNA后24、48hmRNA表达的抑制率为81．6％、80．7％，72h最为明显，为94．3％。在低于100nmol／L浓度下，RNA干扰抑制与剂量大小有关；当剂量进一步加大时，抑制效应则维持在“平台期”。转染24、48和72h后，cyclin D1蛋白的表达也明显下降。siRNA干扰组和对照组细胞在顺铂作用后细胞生长抑制率分别为58．4％、34．8％。结论 化学合成的cyclin D1 siRNA在体外实验中，对Tca8113-CDDP细胞中目的基因的沉默提高了细胞对顺铂敏感性，并呈现剂量和时间依赖效应。     

人肿瘤坏死因子-α基因转染对舌癌细胞的抑制作用

目的：探讨人肿瘤坏死因子－α（hTNF-α)基因转染对舌癌细胞生长的影响。方法：制备和纯化含hTNF-α基因穿梭质粒，用DOSPER阳离子脂质体介导转染Tca8113舌癌细胞，对照组只给予等量的脂质体，不加入质粒；转染基因，24，48，72，92h后用ELISA法检测细胞培养上清液中hTNF-α的浓度，并用MTT法检测细胞的存活率。结果：基因转染24，48，72，96h后转染组与对照组细胞培养上清液中hTNF-α浓度之间的差异均有显著性（P＜0．05），转染组各个时期浓度均高于对照组；MTT法检测相应各时期转染组与对照组平均OD之间的差异均有显著性（P＜0．05），转染组各个时期平均OD值均低于对照组，转染细胞的存活率降低，生长受抑制。结论：阳离子脂质体介导的hTNF-α基因体外转染可在Tca8113舌癌细胞中高表达并抑制舌癌细胞的生长。     

Skp2靶向RNA干扰质粒的构建及其对人舌鳞癌Tca8113细胞的影响

目的运用RNA干扰技术阻断人舌鳞状细胞癌Tea8113细胞中Skp2基因的表达，观察Skp2基因沉默后对Tea8113细胞的影响。方法采用真核转录质粒pRNAT-U6．1／Neo构建针对Skp2基因的重组转染质粒。经聚乙烯亚胺法将其转染Tea8113细胞，通过反转录聚合酶链反应（reverse transcrip-tase polymerase chain reaction，RT-PCR）、Western blot检测Skp2、p27表达的变化；流式细胞仪、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl terrazolium，MTT）法检测转染后Tea8113细胞的细胞周期、生长速度的变化。结果转染重组质粒Skp2shRNA-2、Skp2shRNA-3后，Tea8113细胞内Skp2基因在mRNA和蛋白水平上均下调表达（P〈0．01），p27基因蛋白水平上调表达（P〈0．01）；而各重组质粒转染后p27基因的mRNA水平无明显变化。重组质粒Skp2shRNA-2、Skp2shRNA-3转染Tea8113细胞后，与对照组相比，G1～G0期细胞增加了约22％（P〈0．01），G2～M期和S期细胞减少了约10％和12％（P〈0．01），细胞的生长速度明显变慢（P〈0．01）。结论初步证明了Skp2、p27基因在口腔鳞状细胞癌细胞分化增殖中所扮演的重要角色；筛选出了高效RNA干扰重组质粒Skp2shRNA-2、Skp2shRNA-3，为进一步研究以Skp2基因为靶点的人舌鳞状细胞癌基因治疗奠定了基础。     

短发卡RNA介导的表皮生长因子受体基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响

目的 研究短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响,为治疗舌鳞状细胞癌提供依据.方法 构建靶向人EGFR的shRNA真核表达载体并瞬时转染人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113细胞,用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法检测转染前后EGFR的mRNA和蛋白的变化,用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖活性,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 转染后Tca8113细胞的EGFR mRNA和蛋白的表达(0.217±0.047)和(0.324±0.059)均明显下调(P＜0.05),细胞增殖活性(0.340±0.009)明显降低(P＜0.05),细胞凋亡率(39.4±7.7)%显著增高(P＜0.05).结论 shRNA介导的EGFR基因沉默可抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖并诱导其凋亡.     

核因子-κB传导通路与舌癌细胞平阳霉素化疗敏感性的关系

的 探讨核因子-κB（NF-κB）/p65信号传导通路与Tca8113细胞平阳霉素化疗敏感性的关系。方法 以脂质体为载体,转染2 mg/L的p65反义寡核苷酸于Tca8113细胞 后,8 mg/L的平阳霉素处理细胞,3 h、6 h后免疫组化、Western blot法检测细胞核内p65形态和含量变化,48 h后MTT法检测细胞抑制率。结果 平阳霉素能激活细胞内的NF-κB/p65信号传导通路,而p65反义寡核苷酸转染能明显抑制该信号通路,在6 h时胞核内p65含量显著减少（P<0.05）,48 h时细胞抑制率明显提高（P<0.05）。结论 抑制NF-κB/p65信号传导通路能够提高Tca8113细胞平阳霉素化疗敏感性。     

人肿瘤坏死因子-α基因转染与干扰素-γ联合应用对舌癌细胞生长的影响

目的:探讨干扰素-γ( IFN-γ) 与人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α) 基因转染联合应用对舌癌细胞生长的影响。方法:将培养细胞分为2 组,其中一组转染hTNF-α基因,另一组不转染;再将每一组又分为5 个小组,每一小组分别加入IFN-γ,使其终浓度分别为0、1、10、100、1000 U/ ml ,培养48 h 后,用MTT法测定Tca8113 细胞的存活率,用免疫细胞化学染色法观察hTNF-α的表达。结果:单纯加入IFN-γ对舌癌细胞的活性无影响;hTNF-α基因转染与IFN-γ联合应用时,不同浓度的IFN-γ均有协同hTNF-α基因转染杀伤舌癌细胞的作用,而且其抑瘤效应与IFN-γ的浓度呈正相关( r = 01867 , P < 0101) ;与未转染组相比,转染组细胞hTNF-α呈明显的高表达。结论:联合应用IFN-γ能增强hTNF-基因转染对Tca8113 舌癌细胞的抑制作用。     

Effect of using RNA interference to alter iNOS gene expression on the proliferation of tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113

This study used RNA interference (RNAi) to explore the effect of NO and inducible nitric oxide synthase (iNOS) on apoptosis and proliferation in the tongue squamous carcinoma cell line Tca8113. Tca8113 cells were transfected with the plasmid pGenesil-1, which expresses iNOS short hairpin RNA (shRNA), or the negative control plasmid pSilencer-HK, and the transfected cells were compared with untransfected cells. The expression of iNOS was detected by histochemistry, and apoptosis was detected by flow cytometry. The expression of iNOS was significantly lower in the pSilencer-iNOS group than in the pSilencer-HK and empty control groups. The apoptosis rate was significantly higher in the pSilencer-iNOS group than in the pSilencer-HK and empty control groups. Growth monitoring showed that proliferation was also inhibited in cells transfected with pSilencer-iNOS. RNAi gene silencing decreased iNOS gene expression, induced apoptosis, and suppressed proliferation in Tca8113 cells.     

RNA干扰XBP1基因表达对口腔鳞状细胞癌生物学特性的影响研究

目的:检测口腔鳞状细胞癌组织中X盒结合蛋白1(XBP1)的表达及观察抑制其表达后对人口腔鳞状细胞癌Tca8113增殖凋亡的影响,并探讨其机制。方法:RT-PCR检测42例口腔鳞状细胞癌及癌旁组织中XBP1基因的mRNA表达;NC-siRNA和XBP1-siRNA转染至Tca8113细胞内,不经任何处理的细胞作为空白对照组,48 h后,CCK8实验、流式细胞仪分别检测XBP1基因转染对细胞增殖、凋亡的影响;Western blot检测Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达的变化。结果:口腔鳞状细胞癌中XBP1基因的mRNA表达显著高于癌旁组织(P<0.01);转染XBP1-siRNA能够显著降低XBP1的蛋白表达,降低细胞的存活率,促进细胞的凋亡,上调Cleaved caspase3蛋白表达,下调β-catenin、Cyclin D1蛋白表达(P<0.01)。结论:RNA干扰沉默XBP1基因表达可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路降低Tca8113增殖及诱导细胞凋亡。     

神经钙黏素表达下调对舌鳞状细胞癌细胞生物学能力的影响

目的 研究神经钙黏素(N-cadherin)表达下调对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、细胞周期、凋亡以及迁移的影响,并探讨其可能的分子机制.方法 利用LipofectamineTM2000将神经钙黏素siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,将细胞分为3组:①未处理组;②对照siRNA组;③神经钙黏素siRNA组.分别收集转染后48 h的细胞,采用新型的细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK)8试剂分析转染神经钙黏素siRNA后对细胞增殖能力的影响;运用流式细胞术检测下调神经钙黏素表达对Tca8113细胞周期及细胞凋亡的影响;采用Boyden 小室实验分析下调神经钙黏素对舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞迁移能力的影响;进一步采用蛋白质印迹法检测神经钙黏素表达下调对细胞增殖、细胞周期以及细胞迁移相关基因表达的影响.结果 神经钙黏素siRNA能明显下调舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中神经钙黏素蛋白的表达,并显著抑制Tca8113细胞的增殖(P<0.05).细胞周期结果显示,神经钙黏素siRNA组中在G0/G1的细胞比率[(65.41±0.92)%]明显高于未处理组[(41.59±1.43)%]和对照siRNA组[(43.70±2.08)%],差异有统计学意义(F=216.839,P＝0.000).神经钙黏素siRNA组中细胞凋亡的比率[(25.66±1.36)%]明显高于未处理组[(2.38±0.14)%]和对照siRNA组[(2.81±0.12)%],差异有统计学意义(F=850.364,P=0.000).Boyden 小室体外侵袭实验结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中Tca8113细胞的迁移能力显著下降,差异有统计学意义(F=140.858,P=0.000).蛋白质印迹法结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)2和MMP-9明显下调,而p21明显上调,且差异有统计学意义(P<0.05).结论 神经钙黏素在舌鳞状细胞癌的发生发展中可能具有重要的作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of downregulation of N-cadherin expression on cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and cell migration in tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells. Methods N-cadherin siRNA was transfected into tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells and Tca8113 cells were divided into three groups: untreated group, control siRNA group and N-cadherin siRNA group. The cells were harvested 48 h after transfection with N-cadherin siRNA. Cell proliferation of Tca8113 cells was examined by cell counting kit(CCK)-8 after transfection with N-cadherin, and the effects of downregulation of N-cadherin on cell cycle and cell apoptosis of Tca8113 cells were investigated by flow cytometry.The effect of downregulation of N-cadherin expression on cell migration of Tca8113 cells was observed by Boyden chamber experiment, and further expression changes of gene-related cell proliferation, cell cycle and cell migration were detected by Western blotting. Results N-cadherin siRNA downregulated the N-cadherin expression and significantly inhibited cell proliferation of Tca8113 cells (P<0.05). The results of cell cycle revealed that the percentage of G0/G1 phase in N-cadherin group [(65.41±0.92) %] was significantly higher than that in untreated group [(41.59±1.43)%] or control siRNA group [(43.70±2.08)%], and there was significant difference among the three groups (F=216.839,P＝0.000).The percentage of cell apoptosis in N-cadherin group [(25.66±1.36)%] was significantly higher than that in untreated group [(2.38±0.14)%] or control siRNA group [(2.81±0.12)%], and there was significant difference among the three groups (F=850.364,P=0.000). The cell number migrated into memebrane in N-cadherin group was significantly lower than that in untreated group and control siRNA group, and there was significant difference among the three groups (F=140.858,P=0.000). Further, compared with untreated group and control siRNA group, the expressions of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 proteins were significantly downregulated and expression of p21 protein was significantly upregulated (P<0.05). Conclusions N-cadherin may play a role in occurrence and development of tongue squamous cell carcinoma.