厚壳贻贝McCaspase 3-4基因的克隆及其在幼虫变态中的作用

为进一步了解细胞凋亡及其效应基因caspase-3在海洋贝类厚壳贻贝(Mytilus coruscus)变态中的作用, 研究通过RACE技术克隆并鉴定了一个厚壳贻贝caspase-3基因的cDNA全长, 并对该基因在幼虫变态中的作用进行了研究。碱基序列和氨基酸序列特征分析显示, 该基因编码的蛋白质具有典型的caspase P20和P10结构域, 但核心半胱氨酸活性位点QACXG五肽保守序列发生了突变。系统进化分析结果显示该基因与无脊椎动物Caspase-3聚在一起, 并与地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)caspase 3/7-4相似度最高, 因此将其命名为McCaspase 3-4。随后, 通过实时荧光定量PCR技术对该基因在成贝不同组织及幼虫变态不同时间点的表达水平进行了分析。结果显示, McCaspase 3-4在成贝外套膜和唇瓣中的表达量显著高于其他组织。肾上腺素诱导眼点幼虫变态12h后, McCaspase 3-4的表达水平出现显著上升, 并在刺激24h后达到最高, 表明该基因可能在幼虫变态早期发挥作用。利用RNA干扰技术敲降眼点幼虫McCaspase 3-4基因表达后的结果显示, 肾上腺素对眼点幼虫变态的诱导作用显著下降, 表明该基因在调控厚壳贻贝变态过程中具有重要作用。研究结果有助于理解细胞凋亡在厚壳贻贝幼虫变态中的作用及贝类变态的分子机制。     

铜绿假单胞菌PAO1 ku基因缺失菌株的构建及其对生物被膜耐药性的影响

【背景】铜绿假单胞菌是常见的条件致病菌,易形成生物被膜,具有基因突变率高、耐药性强的特点。非同源末端连接是DNA双链断裂的主要修复途径之一,修复过程会导致DNA突变产生。【目的】研究非同源末端连接对生物被膜中的铜绿假单胞菌基因突变率和耐药性的影响。【方法】通过基因无痕敲除的方法构建PAO1菌株的ku基因缺失突变株Δku并构建其回补株。对比研究突变株和野生菌株生物被膜形成能力、生物被膜状态下各菌的基因突变率以及对抗生素的耐受性。通过荧光定量PCR检测生物被膜中PAO1菌株ku基因的表达水平。【结果】各突变株生物被膜形成能力无显著差异;与野生菌株相比,突变株Δku在生物被膜中的基因突变率以及对环丙沙星和庆大霉素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)下降。荧光定量PCR结果表明,ku基因在生物被膜形成早期转录水平有明显上调。【结论】非同源末端连接修复途径对生物被膜中的铜绿假单胞菌基因突变率以及耐药性的提高有一定的作用。本研究将为后续进一步阐释铜绿假单胞菌耐药产生机制提供一定的理论依据。     

铜绿假单胞菌fur基因缺失突变株的构建及其表型分析

铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator, Fur)是控制铜绿假单胞菌铁代谢和毒力的关键调节因子。许多课题组尝试构建铜绿假单胞菌fur的缺失突变株均失败,因此铜绿假单胞菌的fur一直被认为是必需基因,这导致其生物学功能一直未得到全面的解析。【目的】构建铜绿假单胞菌fur的缺失突变株,并对该突变株的表型进行分析。【方法】以铜绿假单胞菌PAO1为亲本菌株,通过同源重组的方法构建fur缺失突变株,研究该基因对铜绿假单胞菌生长、铁载体生物合成、抗氧胁迫能力、鞭毛形成、生物被膜形成和毒力等的影响。同时,通过遗传分析对fur缺失突变株生长缺陷表型的原因进行探究。【结果】本研究成功构建了铜绿假单胞菌fur基因的缺失突变株,发现缺失突变fur极大地限制了铜绿假单胞菌的生长能力,并降低了该菌对限铁环境的生长适应性,但不影响该菌对高铁环境的生长适应性。铜绿假单胞菌Δfur的这种生长缺陷表型是细胞生长增殖变慢造成的,而不是诱导细胞死亡引起的。然而,其他异源的fur基因能完全互补Δfur的这种生长缺陷表型,暗示铜绿假单胞菌的Fur蛋白在功能上不存在独特性。尽管Fur与毒素-抗毒素系统PacTA存在功能关联性,但是铜绿假单胞菌Δfur的这种生长缺陷表型却与PacT毒素无关。除了影响铜绿假单胞菌的生长表型,缺失突变fur还使铜绿假单胞菌丧失了对铁载体生物合成的抑制作用,导致该菌对H₂O₂更敏感并丧失了鞭毛的形成能力,同时降低了该菌对大蜡螟幼虫的毒力。此外,缺失突变fur还显著提升了铜绿假单胞菌的胞内环二鸟苷酸(cyclic diguanylate, c-di-GMP)水平,从而诱导pelF和pslA基因的表达,进而促进铜绿假单胞菌生物被膜的形成。【结论】fur是可以缺失的非必需基因,在铜绿假单胞菌的正常生长、铁载体生物合成、抗氧胁迫能力、鞭毛形成、生物被膜形成和毒力等方面都发挥着十分重要的作用,这为针对铜绿假单胞菌的疫苗和抗菌药物开发奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌hmp基因缺失突变株的构建及抗一氧化氮能力分析

摘要：【目的】:构建金黄色葡萄球菌RN6390黄素血红蛋白(flavohaemoglobin, HMP)基因缺失突变株,研究其抗一氧化氮(Nitric Oxide, NO) 能力及其在细菌生物被膜形成中的作用。【方法】：根据同源重组技术的原理,利用PCR扩增RN6390的hmp基因上下游同源臂,经过抗生素和温度交替培养筛选hmp基因缺失突变株,利用基因组PCR、定量PCR对突变菌株进行鉴定。以硝普钠（SNP）为NO供体,检测了hmp基因缺失菌株的抗NO能力,并初步研究了hmp基因在生物被膜形成中的作用。【结果】：成功构建了RN6390的hmp基因缺失突变株,外源NO能够诱导菌株hmp基因的表达,hmp基因缺失菌株抗NO能力明显下降,但其生物被膜形成能力有明显提高。【结论】：获得了RN6390的hmp基因缺失突变株,该突变株的获得为进一步研究hmp基因的生物功能,以及细菌内源性NO的作用奠定了良好的技术平台。     

白假丝酵母菌突变株ORF19.2500的功能研究

目的筛选50株白假丝酵母菌基因缺失菌,寻找出对白假丝酵母菌生物被膜形成相关基因,进一步探究白假丝酵母菌生物膜的致病机制。方法利用培养生物被膜的方法筛选50株基因缺失菌;利用XTT法验证所筛选出的白假丝酵母菌突变株ORF19.2500生物被膜形成缺陷;进一步观察ORF19.2500基因缺失菌生长、菌丝形成。结果用XTT法证明白假丝酵母菌突变株orf19.2500生物膜形成缺陷,且生长曲线和滴琼脂平板的方法均提示其生长速率减慢。在spider培养基上白假丝酵母菌突变株orf19.2500不能诱导菌丝形成,但在YPD+10%小牛血清则菌丝形成正常。结论白假丝酵母菌突变株orf19.2500可利用spider培养基缺陷而影响其酵母、菌丝二态性的转化,及其生物被膜的形成。     

鼠伤寒沙门菌rtsB基因缺失株的构建及其生物学特性

【背景】鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是一种重要的人畜共患病原菌,严重危害养殖业及人类健康。调控蛋白在病原菌的生存及感染过程中发挥重要作用。【目的】构建鼠伤寒沙门菌调控基因rtsB缺失株和互补株,分析调控蛋白RstB对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病性的影响。【方法】利用Red同源重组的方法构建鼠伤寒沙门菌SAT52的rtsB基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株。然后比较分析野生株SAT52、缺失株?rtsB和互补株C?rtsB的生长特性、运动性、生物被膜形成能力、黏附入侵能力、胞内存活能力及致病性的差异。【结果】缺失rtsB基因不影响SAT52的生长速度,但导致运动能力增强,生物被膜形成能力减弱。细胞感染试验结果表明,rtsB基因有助于鼠伤寒沙门菌对Hela细胞的黏附入侵及RAW264.7细胞内的存活。动物试验结果表明rtsB基因缺失显著降低鼠伤寒沙门菌的致病力。【结论】rtsB基因在鼠伤寒沙门菌感染过程中发挥重要作用,可为阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制提供参考。     

细菌群体感应参与铜绿假单胞菌胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控

群体感应是细菌根据细胞密度变化调控基因表达的一种调节机制。铜绿假单胞菌中QS系统由lasI和rhlI合成的信号分子3OC12-HSL和C4-HSL以及各自的受体蛋白LasR、RhlR组成,它们以级联方式调控多个基因表达。【目的】研究细菌群体感应(QS)对聚羟基脂肪酸酯合成的调控。【方法】利用铜绿假单胞菌PAO1及其QS突变株为材料通过气相色谱、荧光定量PCR在生理和分子水平上研究QS对聚羟基脂肪酸酯合成的调控。【结果】QS信号分子合成抑制剂阿奇霉素处理铜绿假单胞菌PAO1和QS突变株导致胞内PHA积累量显著减少;铜绿假单胞菌PAO1中C4-HSL合成酶基因rhlI缺失突变株PAO210胞内PHA积累量与野生型无差别;而3OC12-HSL合成酶基因lasI缺失突变株PAO55、3OC12-HSL受体合成酶基因lasR缺失突变株PAO56以及lasI/lasR双缺失突变株PAO57胞内PHA含量与野生型相比明显减少;lasI和lasR的突变株体内PHA合成酶基因phaC1的表达量显著降低,信号分子3OC12-HSL回补实验使phaC1的表达量可恢复到野生株水平,但只可部分恢复lasI缺失导致的胞内PHA合成。【结论】由此推测,铜绿假单胞菌群体感应系统中lasI/lasR系统参与胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控。     

南海孔石藻可培养细菌多样性及代谢产物四溴吡咯研究

钙化藻和微生物在造礁石珊瑚幼虫的附着变态过程中扮演着重要角色,对珊瑚礁生态系统的健康具有重要意义。对南海珊瑚礁区钙化藻的共附生细菌进行分离培养,一方面有利于发掘南海珊瑚礁的微生物资源,另一方面有利于进行微生物与珊瑚、钙化藻等珊瑚礁框架生物的相互作用研究。本研究分离获得孔石藻(Porolithon onkodes)表面共附生细菌,基于16S rRNA基因序列进行系统发育分析,并通过高效液相色谱和质谱对分离得到的假交替单胞菌属菌株的代谢产物进行比较分析。从孔石藻分离获得的369株细菌菌株分别隶属于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)的5纲12目22科47属的97个种级类群。在属级水平上,假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)的菌株数量最多,分属于7个种。在假交替单胞菌属的代谢产物分析中,发现3株在系统发育树中聚为一簇的假交替单胞菌的代谢产物中存在四溴吡咯,而其余没有。研究结果不仅表明了钙化藻中含有丰富的可培养微生物和潜在新物种资源,还首次发现四溴吡咯在南海珊瑚礁区特定类群菌株的代谢产物中的存在,为珊瑚幼虫附着变态的化学信号研究提供基础。     

rpoS基因缺失突变对荧光假单胞菌胁迫耐受性、群体感应及腐败活性的影响

【目的】微生物活动是引起食品腐败的主要原因,研究食品腐败菌的腐败作用调控机制对于保证食品的质量和安全具有重要意义。荧光假单胞菌是一种代表性的食品腐败菌,本文旨在研究RNA聚合酶的选择性sigma因子Rpo S在荧光假单胞菌致腐败过程中的作用。【方法】运用同源重组的方法构建荧光假单胞菌冷藏鱼分离株的rpo S基因缺失突变株,比较野生型和突变株暴露于不同胁迫条件下的存活率;通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析野生型和突变株产生高丝氨酸内酯类(AHLs)群体感应信号分子的种类和含量;检测野生型和突变株接种于灭菌三文鱼汁后4°C贮存过程中的菌落总数和挥发性盐基氮的生成量。【结果】成功构建了荧光假单胞菌rpo S基因缺失突变株。rpo S基因的缺失导致荧光假单胞菌对10 mmol/L H2O2和15%乙醇的耐受性显著降低,对150μg/m L结晶紫和175 mmol/L醋酸的耐受性有一定程度增强,不影响其对47°C和20%Na Cl的耐受性。荧光假单胞菌在rpo S基因缺失突变后长链信号分子C_(10)-HSL、C_(12)-HSL和C_(14)-HSL的含量增加。在灭菌三文鱼汁中的腐败活性检测表明rpo S基因缺失可导致荧光假单胞菌挥发性盐基氮的生成量显著降低。【结论】荧光假单胞菌的Rpo S不仅调节细菌对多种胁迫条件的耐受性,还影响AHL群体感应和腐败活性。     

苏云金芽胞杆菌spoIIID基因缺失突变株的特点

摘要：【目的】构建苏云金芽胞杆菌spoIIID基因缺失突变株,并研究其与出发菌株的表型及性质差异。【方法】采用基因同源重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株中的spoIIID基因,构建了spoIIID缺失突变株,测定生长曲线,并通过扫描电子显微镜观察,芽胞计数分析及SDS-PAGE 蛋白电泳比较突变株与出发菌株的差异。构建遗传互补菌株,观察菌株性状的回复情况。【结果】通过温敏载体同源重组敲除技术获得了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株spoIIID基因缺失突变株,生长曲线测定表明,突变株较出发菌株在平稳期后期生长较缓和;扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变株基本丧失了形成芽胞的能力,但依然形成晶体。SDS-PAGE结果显示,在 SSM培养基中,突变株对伴胞晶体蛋白的形成量影响并不显著;在营养较富集的Luria-Bertani培养基中,突变株中伴胞晶体蛋白的形成量较野生型和互补株明显降低。利用载体pHT315携带spoIIID操纵子互补突变株,互补株恢复了产生晶体和芽胞的能力。【结论】本研究证明spoIIID基因是苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,同时与晶体蛋白的表达相关。     

副溶血性弧菌-霍乱弧菌混合生物被膜形成过程研究

【目的】研究副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)和霍乱弧菌(Vibriocholera,VC)混合生物被膜的形成过程。【方法】在4、8、12、24、36、48、60、72 h测定单独条件下VP、VC及其混合后生物被膜的形成情况,通过结晶紫染色法、平板菌落计数法、测定胞外多糖、胞外蛋白,通过荧光原位杂交(FISH)观察混合生物被膜形成。【结果】虽然形成的混合生物被膜量介于VC和VP之间,但混合生物被膜在形成过程中,成熟期后生物被膜量的变化较小,对环境的抗性增强。混合生物被膜中拥有更多的活菌,混合生物被膜形成过程中胞外蛋白和胞外多糖的变化体现出其可能在对抵御不适应环境中起重要作用,通过FISH可观察到不同时期生物被膜的变化过程。【结论】VC与VP共同形成生物被膜的过程中,混合生物被膜总量虽然减少,但混合生物被膜中拥有更多的活菌,这可能引起更大的危害。研究混合生物被膜形成过程中被膜的变化,可为有害生物被膜的控制提供基础。     

发酵乳杆菌CSC-19胞外粗多糖提取物抑制单核细胞增生李斯特菌生物被膜形成能力的研究

【目的】筛选能有效抑制单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)形成生物被膜的乳酸菌,分析其活性成分并进行功能表征。【方法】采用结晶紫染色法筛选抑制LM形成生物被膜的不同乳酸菌提取物;通过酸中和、蛋白酶处理及热处理,推测抑制生物被膜活性物质以胞外多糖(extracellular crude polysaccharide,ECP)为主;乙醇沉淀法提取目标乳酸菌分离株胞外粗多糖,分析其抑制生物被膜形成活性和对LM生长的影响;运用激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscopy,LCSM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)观察胞外粗多糖对生物被膜细胞形态和结构的影响。【结果】发酵乳杆菌CSC-19发酵上清液对1516-2LM生物被膜的抑制率为81.7%;经热和蛋白酶处理后,发酵上清抑制生物被膜形成的活性未发生显著变化(P>0.05),表明发酵上清液中抑制生物被膜形成的物质可能为胞外多糖;在不抑制LM生长的条件下所提取的胞外粗多糖抑制生物被膜形成能力具有浓度依赖性。激光共聚焦扫描显微镜和扫描电子显微镜结果显示,胞外粗多糖显著抑制了生物被膜的形成能力,生物被膜三维、有组织的蜂窝状结构被破坏,仅有少量的粘附细胞分散于细胞爬片表面。【结论】发酵乳杆菌CSC-19胞外粗多糖能有效抑制LM生物被膜的形成,有望应用于高效防控该菌污染食品。     

青枯雷尔氏菌胞外多糖合成缺失突变株构建及其生物学特性

【目的】由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的植物青枯病是一种毁灭性土传病害。胞外多糖(extracellular polysaccharides,EPS)是青枯雷尔氏菌关键的致病因子之一。通过构建胞外多糖缺失突变株,研究胞外多糖在青枯病致病中的作用。【方法】从青枯雷尔氏菌FJAT-91的基因组中克隆出胞外多糖合成结构基因epsD同源臂,克隆至自杀性质粒p K18mobsacB,再将庆大霉素抗性基因(Gm)插入同源臂中间,获得重组质粒p K18-epsD。将重组质粒转化至青枯雷尔氏菌FJAT-91感受态细胞中,通过同源重组敲除epsD基因,获得EPS合成缺失的突变株FJAT-91Δeps 。研究突变株与野生菌株在菌落形态、胞外多糖合成、运动能力、定殖能力的差异性。【结果】突变菌株FJAT-91ΔepsD与出发菌株FJAT-91相比:胞外多糖产量显著减少,生长较慢;泳动能力(swimming motility)和群集运动能力(swarming motility)显著降低;在番茄苗根部和茎部的定殖能力显著降低;弱化指数(AI)为0.905,鉴定为无致病力菌株。【结论】胞外多糖在青枯雷尔氏菌的致病中起着关键的作用,本课题研究成果为开发植物疫苗提供了优良的材料与研究基础。     

双组分系统rcsC基因影响禽致病性大肠杆菌的致病性及相关生物学特性

【目的】双组分系统Rcs感受外界环境变化,并调控细菌的适应性及生存等。本文探讨Rcs双组分系统传感器激酶RcsC对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)相关生物学特性及致病性的影响。【方法】采用Red同源重组的方法构建rcsC基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株,然后比较野生株、基因缺失株与互补株的生长特性、运动性、生物被膜、凝集沉淀能力、致病力及毒力基因转录水平的差异。【结果】rcsC基因缺失不影响APEC的生长速度,然而,缺失RcsC导致APEC的运动能力升高、生物被膜形成能力降低和凝集能力增强。凝集试验结果显示rcsC基因有助于APEC的凝集沉降。细胞黏附入侵结果表明,rcsC在APEC侵袭DF-1细胞过程中发挥作用,而对黏附能力无影响。动物感染试验结果表明rcsC基因缺失能显著降低APEC的毒力。荧光定量PCR检测结果表明,rcsC基因缺失株中ompA、aatA、fyuA和luxS基因的转录水平均显著降低,而fimC和tsh基因的转录水平显著升高。【结论】RcsC参与调控APEC的运动性、生物被膜形成、凝集沉降和致病力。     

一株肠膜明串珠菌的分离鉴定及其抑菌特性

[背景] 水产病原细菌严重威胁水产动物健康且制约水产养殖业发展,细菌性鱼病的有效防治成为水产养殖领域亟待解决的问题。[目的] 筛选对水产病原细菌有抑制效果的菌株,并研究其抑菌特性及其在水产细菌病害防治中的实际效果。[方法] 通过16S rRNA基因测序、构建系统发育树和生理生化鉴定确定筛选菌株的进化地位,通过乙酸乙酯萃取获得抑菌物质粗提物,通过偶氮酪蛋白法检测菌株胞外蛋白酶活力,采用结晶紫染色法对菌株的生物膜形成能力进行测定,通过浸浴攻毒模型确定所筛菌株对维氏气单胞菌的防治作用。[结果] 从泡菜发酵物中筛选出一株乳酸菌DH,经16S rRNA基因测序、发育树分析和生理生化鉴定确定其为肠膜明串珠菌,该菌分泌的胞外抑菌物质对鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、杀鲑气单胞菌、希瓦氏菌和维氏气单胞菌表现出抑菌效果,其抑菌物质能被乙酸乙酯萃取并且具有热稳定性。菌株DH能够显著抑制待测菌株的蛋白酶产量和生物膜形成能力,并且对维氏气单胞菌浸浴攻毒有防治作用。[结论] 肠膜明串珠菌DH通过分泌抑菌物质抑制水产病原细菌的生长,能够为细菌性鱼病的防治提供一定的理论和应用潜力。     

基于高通量共聚焦激光扫描显微镜方法定量分析副溶血性弧菌生物被膜结构

【目的】副溶血性弧菌是水产品中常见的食源性致病菌,生物被膜的形成对副溶血性弧菌的环境生存和传播至关重要。这项工作的目的是评估临床和环境中分离出的44株副溶血性弧菌菌株形成的生物被膜的结构多样性。【方法】该研究基于共聚焦激光扫描显微镜的高通量方法,使用与高分辨率成像兼容的96孔微量滴定板,结合结构分析软件ISA-2来研究生物被膜形成和结构,分析22株食品与22株临床来源的副溶血性弧菌菌株形成的生物被膜结构参数(生物体积、平均厚度、粗糙系数)。【结果】CLSM图像显示,44株副溶血性弧菌菌株在培养48h后能够形成3D结构,进一步比较分析了临床来源菌株与环境来源菌株形成的生物被膜结构异同,发现临床菌株生物被膜的变异系数比环境菌株生物被膜的变异系数小,且同时携带tdh和trh两种毒力因子的菌株生物被膜变异性最小。凝聚层次聚类分析结果显示,副溶血性弧菌生物被膜可以分为致密且表面光滑(39%)、斑驳且表面粗糙(27%)、疏松且表面坑洼(34%),临床菌株易形成致密且表面光滑和斑驳且表面粗糙的生物被膜,而环境菌株易形成致密且表面光滑和疏松且表面坑洼的生物被膜。【结论】该研究深入了解了副溶血性弧菌生物被膜结构差异性,为今后对临床和环境来源的副溶血性弧菌生物被膜采取不同的防控和清除措施提供了理论支撑。     

基于xkdB假基因座位的瓦雷兹芽孢杆菌FZB42超折叠GFP标记研究

【目的】利用一个GFP的超折叠变体SfGFP(superfolder GFP)对瓦雷兹芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FZB42菌株进行标记,以期确立一种瓦雷兹芽孢杆菌及近缘芽孢杆菌通用的高亮GFP标记手段,同时,为了方便后续生物膜和分子互作的相关研究,测试SfGFP基因插入位点,假基因xkdB,作为外源基因表达座位的可行性。【方法】利用基因工程技术构建了一系列质粒,然后通过同源重组的方式,分别获得xkdB敲除菌株FBS373和SfGFP标记菌株FBS374,分别测试这些菌株在生长速度、碳源利用、荧光亮度、生物膜形成、swarming运动性等方面的差异。【结果】本研究成功构建了SfGFP标记的瓦雷兹芽孢杆菌FZB42,其荧光亮度是gfp+变体标记菌株的5倍以上;xkdB基因敲除对瓦雷兹芽孢杆菌FZB42生长速度、不同碳源利用、生物膜形成和运动性等方面无明显影响。【结论】通过本研究我们确认了xkdB基因位点作为瓦雷兹芽孢杆菌FZB42基因组上外源基因表达的中性位点的可行性,同时,通过在xkdB基因座位表达了SfGFP基因,成功对FZB42进行了高亮标记,对同类菌株的标记...     

信号分子AI-2合成关键基因luxS对副溶血性弧菌生物学特性的影响

[背景]副溶血性弧菌是全球范围重要的食源性病原菌,能引起急性肠胃炎。群体感应系统LuxS/AI-2影响细菌的生物学特性,为研究副溶血性弧菌的传播机制和控制技术提供了新的途径。[目的]探讨群体感应信号分子AI-2合成关键基因luxS对海产品中分离的副溶血性弧菌Vp2009027生物学特性的影响。[方法]利用自杀质粒同源重组技术敲除信号分子AI-2合成关键基因luxS,构建副溶血性弧菌Vp2009027的luxS基因缺失株,通过比较野生株与luxS基因缺失株的生长曲线、AI-2活性、运动能力、生物膜形成能力和耐药性,分析LuxS/AI-2系统对副溶血性弧菌生物学特性的影响。[结果]构建了副溶血性弧菌Vp2009027的luxS基因缺失株,野生株和luxS基因缺失株的生长无明显差异,luxS基因的缺失导致AI-2合成受阻、运动能力和生物膜形成能力增强、四环素耐药性降低。[结论]luxS基因对副溶血性弧菌的生物学特性具有重要的调控作用,为进一步研究副溶血性弧菌的传播机制和研发控制技术提供基础。     

藤椒精油对腐败解淀粉芽孢杆菌DY1a生物被膜的抑制作用

【背景】芽孢杆菌是豆制品的重要腐败菌,在气液界面形成生物膜,对产品生产带来持续污染。【目的】探讨藤椒精油(Zanthoxylum armatum DC.essential oil,ZA-EO)对腐败解淀粉芽孢杆菌DY1a菌体及生物被膜的抑制作用与机制。【方法】采用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)分析藤椒精油主要成分与相对含量,通过二倍稀释法测定藤椒精油对菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC),并分析精油对腐败菌胞外蛋白酶活性、腐败菌生物被膜形成抑制及成熟生物被膜的清除作用,采用扫描电镜结合三维光学显微镜分析生物被膜形貌结构变化,测定生物被膜胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)多糖与蛋白质含量变化;并通过细菌运动能力、细胞黏附及自聚集能力、细胞表面疏水性和Zeta电位来初步探讨藤椒精油对生物被膜的抑制机理。【结果】藤椒精...     

牛支原体LRR5蛋白原核表达及其在牛支原体入侵宿主细胞过程中的作用分析

致病性支原体具有入侵宿主细胞的能力,这是其发挥致病作用的关键。介导支原体入侵宿主细胞的自身功能蛋白可能是一种潜在的药物或疫苗靶标。【目的】克隆表达牛支原体(Mycoplasmabovis) MBOVPG45_0564基因编码蛋白(命名为LRR5蛋白),并探究其在M. bovis入侵宿主细胞过程中的作用。【方法】利用NCBI数据库对MBOVPG45_0564基因进行同源性分析,用Discovery Studio Client系统对LRR5蛋白进行蛋白结构预测;原核表达LRR5蛋白并制备其小鼠多克隆抗体,利用免疫电镜对LRR5蛋白进行亚细胞定位;通过平板计数、激光共聚焦显微镜观察LRR5抗体封闭后M. bovis对胎牛肺(embryonic bovine lung, EBL)细胞入侵率的变化;将LRR5蛋白偶联至荧光微球表面后,以激光共聚焦显微镜及高内涵活细胞成像系统观察微球进入EBL细胞情况。【结果】MBOVPG45_0564基因在牛支原体属中为保守基因,其编码蛋白LRR5为膜相关蛋白,空间构象呈典型的月牙状,多个重复的亮氨酸基序以超螺旋方式组装并形成螺线管蛋白质结构单元。LRR5抗体封闭后,M. bovis对EBL细胞的入侵率显著降低(P<0.05),荧光微球偶联LRR5蛋白后,荧光微球可成功进入EBL细胞。【结论】MBOVPG45_0564基因编码的LRR5蛋白定位在M. bovis膜上,在M. bovis入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。