第一极体不能精确定位人卵母细胞纺锤体

目的 观测人卵母细胞纺锤体的确切位置,从而指导今后的生殖医学临床工作。方法 应用纺锤体成像系统观测体外成熟及体内成熟组人卵母细胞纺锤体,测量卵子中心、纺锤体与第一极体之间形成的角度。比较两组结果的差异。结果 体外成熟组纺锤体与第一极体形成角度和体内成熟组存在显著差异(P=0.006)。结论 人卵母细胞的位置并不能准确定位卵母细胞纺锤体的位置。体外成熟组纺锤体与第一极体形成的角度要明显小于体内成熟组。应用纺锤体成像系统可以安全、有效地观察人卵母细胞纺锤体。     

核抑制剂(Roscovitine)对促排周期人未成熟卵母细胞体外成熟安全性的初步研究

目的 观察核抑制剂(Roscovitine)对人未成熟卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)安全性的影响.方法 获取促排周期的GV期未成熟卵随机分为两组,实验组(经二步法):未成熟卵母细胞先用含有200 vmol/LRoseovitine的培养液培养6 h,然后转入IVM成熟培养液培养24～36 h;对照组:直接用IVM成熟培养液培养24~36h.观察两组卵母细胞成熟情况并应用激光扫描共聚焦显微镜观察培养成熟后MⅡ期卵母细胞纺锤体和染色体的形态.结果 实验组共获未成熟卵母细胞61个,经体外成熟培养后50个卵成熟,其中39个卵可观察到纺锤体与染色体,纺锤体的形态异常者为15个,染色体异常者11个;对照组共获未成熟卵母细胞60个,经体外成熟培养后43个卵成熟,其中32个卵可观察到染色体与纺锤体,纺锤体形态异常者14个,染色体异常者11个.结论 Roscovitine能可逆性抑制体外培养的人卵母细胞的核成熟,但未对纺锤体及染色体形态产生不良影响.     

小鼠窦前卵泡培养成熟后卵母细胞纺锤体的变化

目的小鼠窦前卵泡体外培养得到成熟卵母细胞,观察卵母细胞的染色体和纺锤体形态,分析其变化及原因。方法完整小鼠窦前卵泡培养12 d,得到的卵母细胞进行免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察纺锤体和染色体的形态和分布。结果经过体外培养,得到GV、M I、MⅡ期卵母细胞分别占总数27.9%、37.2%、34.9%;GV期卵母细胞存在完整的染色质圆环,11.8%的M I期卵母细胞显示正常纺锤体和染色体;38.5%的MⅡ期卵母细胞显示正常的纺锤体和染色体。结论小鼠窦前卵泡经体外培养后能够得到成熟的MⅡ期卵母细胞,但是其效率较低。原因可能是卵母细胞骨架结构的异常使染色体分离障碍,部分卵母细胞停留于M I期;同时成熟卵母细胞的受精率低也与纺锤体异常有关。     

蔗糖浓度对GV和MⅡ期冻融卵母细胞纺锤体结构的影响

目的 探讨蔗糖浓度对GV期和MⅡ期冻融卵母细胞纺锤体质量的影响.方法 运用纺锤丝观测仪(PolScope)、免疫荧光标记技术和激光共聚焦显微镜.对不同蔗糖浓度(0.1-0.6 mol/L)下GV期和MⅡ期冻融卵母细胞体外成熟后的纺锤体分别进行检测,以未冷冻处理的卵母细胞作为对照组.结果 与对照组比较,冻融组卵母细胞纺锤体的排列明显受到影响.蔗糖浓度为0.3 mol/L时,GV期冻融组卵母细胞纺锤体的正常率最高(P＜0.05);蔗糖浓度为0.5 moL/L时,MⅡ期冻融组卵母细胞纺锤体的正常率最高(P＜0.05);当蔗糖浓度继续升高时,冻融组GV期和MⅡ期卵母细胞纺锤体的正常率则显著下降(P＜0.05).冻融组卵母细胞纺锤体的正常率,MⅡ期显著高于GV期(P＜0.05).结论 一定浓度范围的蔗糖可提高冻融卵母细胞纺锤体正常率;MⅡ期冻融卵母细胞的渗透耐受性及其在渗透耐受范围内的冷冻效率均高于GV期卵母细胞.     

OPS玻璃化冷冻小鼠MII期卵效果观察

目的　以小鼠为研究模型 ,探讨MII期卵母细胞冷冻后纺锤体和染色体改变的有效观察方法。研究OPS玻璃化冻存成熟卵的可行性。　方法　运用激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM)的光学切片和三维图像重建技术 ,系统研究了OPS玻璃化冷冻对小鼠MII期卵纺锤体和染色体的影响。　结果　冷冻组卵复苏后存活率达 5 8% ,纺锤体和染色体形态正常率分别为 46%和 5 2 % ,与对照组 ( 76%和 70 % )相比 ,差异具显著性 (P <0 0 5 )。暴露组卵纺锤体和染色体结构正常率较对照组略有下降 ,但无统计学差异。　结论　LSCM能够清晰有效地观察冷冻对卵母细胞纺锤体和染色体影响。应用OPS玻璃化方法能够有效冻存卵母细胞     

蔗糖浓度对GV和MⅡ期冻融卵母细胞纺锤体结构的影响

目的 探讨蔗糖浓度对GV期和MⅡ期冻融卵母细胞纺锤体质量的影响.方法 运用纺锤丝观测仪(PolScope)、免疫荧光标记技术和激光共聚焦显微镜.对不同蔗糖浓度(0.1-0.6 mol/L)下GV期和MⅡ期冻融卵母细胞体外成熟后的纺锤体分别进行检测,以未冷冻处理的卵母细胞作为对照组.结果 与对照组比较,冻融组卵母细胞纺锤体的排列明显受到影响.蔗糖浓度为0.3 mol/L时,GV期冻融组卵母细胞纺锤体的正常率最高(P＜0.05);蔗糖浓度为0.5 moL/L时,MⅡ期冻融组卵母细胞纺锤体的正常率最高(P＜0.05);当蔗糖浓度继续升高时,冻融组GV期和MⅡ期卵母细胞纺锤体的正常率则显著下降(P＜0.05).冻融组卵母细胞纺锤体的正常率,MⅡ期显著高于GV期(P＜0.05).结论 一定浓度范围的蔗糖可提高冻融卵母细胞纺锤体正常率;MⅡ期冻融卵母细胞的渗透耐受性及其在渗透耐受范围内的冷冻效率均高于GV期卵母细胞.     

LH与hCG对昆明小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的研究促黄体素（LH）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）对昆明小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法小鼠经注射孕马血清促性腺激素（PMSG）48h后，摘取卵巢获得未成熟卵母细胞，分别在含不同浓度的LH和hCG的成熟液中，或将LH和hCG以不同的浓度组合加入到成熟液，进行体外成熟。结果经15.16h的成熟培养，5个浓度LH组中的极体率均高于对照组，其中200IU/mL组显著高于50IU/mL、400IU/mL、300IU/mL组和对照组（P〈0.05）；5个浓度hCG组的极体率与对照组极体率无显著差异（P〉0.05）；协同组中15IU/mL hCG＋200IU/mL LH组的极体率显著高于对照组和其它各处理组。结论LH对小鼠卵母细胞的体外成熟有一定的促进作用。     

Synaptotagmin1影响小鼠卵母细胞纺锤体组装和稳定

目的:确定Synaptotagmin1(Syt1)对小鼠卵细胞纺锤体组装和稳定的影响。方法:免疫荧光法检测Syt1在小鼠卵母细胞发育不同时期的亚细胞定位。用紫杉醇处理小鼠MⅠ期卵母细胞,明确Syt1与微管动力的关系。注射Syt1特定的寡聚核苷酸降调卵母细胞中Syt1的表达,免疫荧光法检测Syt1降调后卵母细胞纺锤体的形态变化、染色体异常以及中心体蛋白γ-tubulin定位变化。结果:Syt1在卵母细胞减数分裂成熟的不同发育阶段都有表达,主要集中分布皮质区和MⅠ和MⅡ期纺锤体的两极。Syt1在MⅠ和MⅡ期与中心体相关蛋白γ-tubulin共定位。紫杉醇实验发现Syt1集中定位于星体和高度集中的微管两极。降调Syt1表达后,染色体排列紊乱,纺锤体组装异常比例升高,且大多数为无极、单极或者多级纺锤体,其次有拉长纺锤体和形态各异纺锤体。并影响微管组织中心相关蛋白γ-tubulin的正确定位。结论:Syt1可能作为一种微管组织中心相关蛋白调节纺锤体的组装稳定。     

培养环境的温度变化与人MII期卵母细胞纺锤体形态学变化的关系

目的：观察环境温度的改变对MII期人卵纺锤体结构的影响，方法：40例非男性因素的不孕妇女，将常规体外授精后未受精的MII期卵子置于室温（23-250c）直至纺锤体消失，于纺锤体消失后，将卵子分成3个实验组：1组纺锤体消失后立即复温（n=8）；2组纺锤体消失后室温下静置5min再复温（n=6）；3组纺锤体消失后室温下静置10min再复温（n=6），卵子复温后5min，10min，2h分别观察纺锤体的复现情况。结果：20个未受精的MII期卵子置于室温下5min内纺锤体均消失，1组中的8个卵子，2组中的6个卵子复温后再次观测到了MII期纺锤体，3组中的6个卵子只有3个卵子再次出现了MII期纺锤体，对照组的18个卵子放置于37℃恒温板上观察30min，纺锤体均未见消失。结论：MII期卵子纺锤体对环境温度的改变非常敏感．温度降低将导致纺锤体消失，随着时间的延长，纺锤体复现几率明显减少。     

雌二醇和孕酮对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的 研究雌二醇(E2)、孕酮(R4)对昆明小鼠卵母细胞体外成熟的影响.方法 小鼠经注射孕马血清促性腺激素(PMSG)后48 h,摘取卵巢获得未成熟卵母细胞,分别在单独含不同浓度的E2或R4的成熟液中,或在同时含有不同浓度E2和P4的成熟液中,进行体外成熟,并对经过E2和P4处理成熟的卵母细胞进行体外受精.结果 经15～16 h的成熟培养,各E2处理组的卵母细胞第一极体排出率虽然均略高于对照组,但它们之间无显著差异;各组卵母细胞体外受精48 h后,1000 ng/mL E2处理组的卵裂率显著低于其他各处理组和对照组,但各组的囊胚率之间无显著差异.各P4处理组的极体率和卵裂率,与对照组相比无显著差异,但是各处理组的囊胚率均极显著低于与对照组;两种激素协同处理组中[1000 ng/mL E2 1000 ng/mL P4]组的极体率显著高于其他各处理组;而与对照组的极体率差异不显著.结论 P4对小鼠卵母细胞的后期发育能力有一定的抑制作用,而E2却对小鼠卵母细胞的成熟及其发育潜力无明显作用.     

用全染色体涂抹探针进行卵母细胞第一极体荧光原位杂交

 【目的】建立用全染色体涂抹探针（WCP）对卵子第一极体进行荧光原位杂交（FISH）检测染色体的方法。【方法】收集单精子卵胞浆内注射（ICSI）中不成熟卵母细胞经体外培养成熟和常规试管婴儿（IVF）中未能成功受精的成熟卵母细胞，活检第一极体，固定后行13、14号染色体的全染色体涂抹探针荧光原位杂交。活检后，一部分卵母细胞固定行FISH以分析卵子自身的13、14号染色体，其余行ICSI受精，观察受精和卵裂情况。【结果】共获得成熟母细胞93个，成功活检85个，成功固定78个，共29个第一极体处于分裂中期，均有FISH结果。卵母细胞体外培养成熟后立即取极体进行固定，90．5％（19／21）的极体处于分裂中期，而取卵后30-48h和72h后活检的第一极体处于分裂中期的比例分别为27．3％（6／22）和11．4％（4／35），3组相比有统计学差异（P〈0．01）。11个卵母细胞同时获得了极体和相对应卵细胞的FISH结果，其中10个极体和相对应的卵细胞分别有1条13，14号染色体，剩余1个卵母细胞的极体有2条14号染色体和1条13号染色体，相对应的卵细胞仅有1条13号染色体，二者互补。活检后行ICSI受精的卵母细胞受精率为78．6％（11／14），优质胚胎率45．5％（5／11）。【结论】全染色体涂抹探针对卵子第一极体进行遗传分析可以有效、准确地推测相对应卵母细胞的染色体构成，从而应用于女性染色体易位患者的植入前遗传诊断。     

Spontaneous activation of hamster oocytes in vitro

Ｔｈｅｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｓｐｅｒｍｉｎｊｅｃｔｉｏｎ(ＩＣＳＩ)ｔｈａｔｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｖｉａｂｌｅｐｒｅｇｎａｎｃｙｉｎ1992ｂｙＰａｌｅｒｍｏ,1ｈａｓｂｅｅｎｓｈｏｗｎｔｏｂｅａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｓｅｖｅｒｅｍａｌｅｆａｃｔｏｒｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙＴｈｅａｖｅｒａｇｅｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅｗｉｔｈｈｕｍａｎＩＣＳＩｗａｓ65p%,24　ａｎｄｔｈｅｒｅａｒｅｓｔｉｌｌ305%ｏｆｏｏｃｙｔｅｓｕｎｆｅｒｔｉｌｉｓｅｄａｆｔｅｒＩＣＳ…     

人MⅡ期卵母细胞极体及原核期形态分级对预测胚胎发育潜能的研究

目的对人MⅡ期卯母细胞的第一微体和D1双原核期的原核、核仁及胞浆进行形态分级,以预测胚胎发育潜能。方法以2009年6月-2012年6月在广西医科大学第一附属医院生殖医学研究中心接受卵胞浆内单精子硅微注射（ICS1）助孕治疗的269对不育夫妇（共269个移植周期）为研究对象。对所有获得的MⅡ期卵母细胞第一极体进行形态观察和分级,同时将D1双原核期的受精卵进行形态分级,分别比较其受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率及临床妊娠率。结果根据所移植的胚胎来自不同级别第一极体的MⅡ期卵和不同原核等级分为B组和C组,分别为102例和98例,其余为A组（69例）。移植来源于1～2级第一极体的MⅡ期卵母细胞且D1双原核期为Z1～Z2级的胚胎其受精牢、卵裂牢、种植率、优胚率及临床妊娠率均较高。结论人MⅡ期卵母细胞第一极体和D1双原核期受精卵的等级越高,胚胎发育的潜能就越好。从而提高ICSI的胚胎种植率及临床妊娠率。     

人卵母细胞冻融的研究与应用

冷冻卵母细胞与冷冻胚胎对于治疗不孕症都具有重要价值.冷冻胚胎技术于1983年首次成功用于人类胚胎的保存[1].这些年来精子及胚胎冷冻已普遍用于生殖领域,但卵母细胞冷冻仍未在临床上广泛应用.1986年澳洲Chent2]首次报告卵母细胞冷冻合并体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization embryo transfer,IVF-ET)成功妊娠1例.目前这方面成功的经验仍不多.     

小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育

[目的]观察小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育.[方法]昆明小鼠超排后获取体内成熟卵母细胞及卵丘细胞.成熟卵子去核后用将卵丘细胞核与精子直接注入,观察其受精和胚胎发育情况.[结果]卵子去核存活率为75.9%(362/477),注核存活率为39.8%(143/359),D1存活率为38.4%(138/359).39.9%(57/143)重构卵子成功排出一个极体并形成两原核,其卵裂率为80.7%(46/57).大部分重构胚发育到2～3细胞停滞,其中2个分裂至4细胞,无囊胚形成.[结论]将小鼠卵丘细胞核、精子同时移植到小鼠的体内成熟卵浆中,可以诱导极体排出,形成2原核 1极体的重构胚胎.重构胚胎大部分发育到2～3细胞即发生停滞,最多到达4细胞期,发育潜能差.     

The role of brain-derived neurotrophic factor in mouse oocyte maturation <Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis>

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) can promote developmental competence in mammalian oocytes during in vitro maturation (IVM),but the role of BDNF in oocyte maturation at cellular level is not still clear.In this study,mouse cumulus-enclosed oocytes subjected to IVM were fertilized and cultured to blastocyst stage.Meiotic spindle configuration and cortical granules distribution during oocyte maturation in vitro were assessed by using immunofluorescence and laser confocal microscopy.The results showed that BDNF contributed to the complete preimplantation development of mouse oocytes compared to the control oocytes (13.78% vs.5.92%;P<0.05).Further,BDNF did not accelerate nuclear maturation of IVM oocytes.For the BDNF-treated oocytes at meiosis Ⅰ,Meiotic spindle areas were significantly smaller and the number of cytoplasmic microtubule organizing centers was greater than that in the control,and the percentages of oocytes showed spindles positioned near the oolemma and a well-formed cortical granule-free domain were significantly higher than that of the control.These morphological characteristics of the BDNF-treated oocytes were much closer to the oocytes matured in vivo than those of the control oocytes.In conclusion,BDNF can promote the developmental competence of mouse IVM oocytes,by improving the meiotic spindle configuration and location and cortical granules distribution at meiosis Ⅰ.     

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法，研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口，首先将第一极体挑出．再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞，去除包含有MⅡ期染色体．纺锤体复合体的最少量细胞质。随后，将直径为10～12mm的C57BL／6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下，构建供体核．卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合．并对重组胚激活。体外培养72h．对重组胚发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s；Hoechst 33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核；去核成功率为95．5％，注核成功率为76．7％，供体核．卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2％和62.2％；重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4-8细胞和桑椹胚期的比率分别为57．5％、39．1％和27．6％；用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物，扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段，表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法，不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核，去核成功率高，而且操作简便，去核迅速，对卵母细胞损伤小．是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。     

不同体外受精周期所获生殖泡期卵母细胞体外 成熟后结果比较

 【目的】 研究对比体外受精-单精子卵胞浆内注射(IVF-ICSI)周期所获生殖泡期(GV)不成熟卵母细胞以及体外成熟(IVM)周期所获GV期卵母细胞体外培养成熟后的胚胎发育情况&#65377;【方法】 163个IVF-ICSI周期中所获987个成熟卵为Ⅰ组,所获GV期卵进行体外培养后成熟的132个卵为Ⅱ组, 另有37个IVM周期中所获GV期卵体外培养后成熟的235个卵为Ⅲ组&#65377;对3组均进行ICSI,并对其受精率&#65380;卵裂率及胚胎发育进行比较&#65377;【结果】 Ⅰ组的受精率&#65380;卵裂率以及优质胚胎率均显著高于Ⅱ组及Ⅲ组(分别为84.9%,98.1%和61.6%;72.0%,90.5%和22.1%; 75.3%,94.4%和25.1%)&#65377;Ⅰ组的胚胎卵裂球数目及胚胎形态评分均显著优于Ⅱ组及Ⅲ组(P < 0.05);Ⅱ组与Ⅲ组相比差异无统计学意义&#65377; 【结论】 体内成熟卵形成的胚胎形态好于生殖泡期卵体外培养成熟者,IVF-ICSI周期的生殖泡期不成熟卵形成的胚胎形态学上与IVM周期的类似&#65377;     

点突变Uchl1不影响小鼠卵母细胞成熟

目的 通过观察突变蛋白与野生蛋白过量对卵母细胞成熟过程的影响,分析Uchl1在小鼠卵母细胞离体成熟中发挥的作用及其作用方式。方法 通过原核重组蛋白技术制备点突变（C90S和I93M）和野生型Uchl1蛋白,通过蛋白微量注射技术将突变蛋白与对照蛋白注射到未成熟卵母细胞,或体外培养液中添加突变蛋白与野生型蛋白,分析野生型Uchl1过量,或突变Uchl1-I93M蛋白添加,或泛素水解酶活性缺失的Uchl1-C90S突变蛋白添加,对于卵母细胞体外成熟的影响。结果 显微注射UCHL1融合蛋白的各组之间以及与注射PBS之间, GVBD率差异没有达到统计学显著性;同时培养液中添加Uchl1的GST融合蛋白,相对于无注射对照组,也没有统计学显著差异（P>0.05）。注射GST-C90S融合蛋白组少量GV期卵母细胞体外发育为MII期卵母细胞后呈现极体偏大于对照组。I93M点突变小鼠与WT小鼠比较,GV期卵母细胞体外GVBD率无显著差异。结论 在小鼠卵母细胞中,添加外源性Uchl1,或者有毒性作用的I93M突变体,或者水解酶活性结构改变的C90S突变体,均不影响卵母细胞成熟的GVBD进程。即使构建的I93M点突变小鼠卵母细胞GVBD率无异常。但是,其水解酶活性位点突变影响极体的形成。