哺乳动物极性蛋白mInscuteable-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达与纯化

目的:构建哺乳动物极性蛋白mInscuteable C末端257～532位氨基酸结构域与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合蛋白GST-mInsc 257～532的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法:将已经构建好的mInsc 257～532位氨基酸序列克隆至原核表达载体pGEX-4T中,构建重组的质粒pGEX-4T/mInsc 257～532;将重组质粒转化感受态细菌BL21,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST蛋白;经谷胱甘肽-琼脂糖球珠分离纯化;产物经SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定。结果:获得高表达及纯化的pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白。结论:成功构建重组pGEX-4T/mInsc 257～532原核表达载体;诱导表达pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白并纯化。     

小鼠Foxp3融合蛋白的原核表达及纯化

目的克隆小鼠Foxp3(MFoxp3)基因,构建含该基因的原核表达载体,并表达、纯化出小鼠的Foxp3融合蛋白。方法RT-PCR方法从小鼠淋巴细胞扩增出小鼠Foxp3基因,连入T Easy Vector进行测序,然后将序列正确的小鼠Foxp3基因用酶切的方法从T Easy vector切下,并将其连接到用相同酶切,含有硫氧还蛋白(含6个组氨酸“标签”)的pET 32a( )原核表达载体中构建pET 32a( )-MFoxp3表达载体。用IPTG诱导转化pET 32a( )-MFoxp3表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并以镍螯合层析法纯化MFoxp3融合蛋白。结果经RT-PCR成功地克隆了1,290 bp的小鼠Foxp3基因,测序正确后转化大肠杆菌原核表达载体pET 32a( ),重组质粒在BL21(DE3)中成功表达出分子质量约为63 kD的融合蛋白,运用Ni-NTA方法纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白纯度达80%,并用Western Blotting检测蛋白的灵敏度和特异性。结论构建了小鼠Foxp3的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出小鼠Foxp3的融合蛋白。     

大鼠脑源性神经营养因子的克隆及原核重组表达载体的构建

目的:构建重组表达载体pGEX-脑源性神经营养因子(BDNF),探讨其原核表达BDNF的可行性。方法:大鼠BDNF进行密码子优化,人工合成BDNF的全基因序列,经回收、纯化、酶切后连接到pGEX原核表达载体中,将重组质粒pGEX-BDNF转化大肠杆菌BL21细胞中,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,利用ELISA方法鉴定其表达的活性。结果:PCR鉴定及测序显示BDNF序列完全正确,BDNF基因的克隆和表达载体构建成功,IPTG诱导表达目的蛋白经ELISA检测,其表达的目的蛋白具有一定的活性。结论:经密码子优化后经人工合成得到BDNF基因片段并成功构建pGEX-BDNF重组表达载体,具有一定的生物活性。     

促Treg细胞生成及活化重组分子的构建与表达

本研究旨在构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并鉴定其表达。应用RT-PCR获得人TGF-β1及HIV被膜蛋白gp120的C2-C4区基因并将其克隆至pCR2.1 T载体,酶切制备人TGF-β1及C2-C4区DNA片段,通过PCR定向连接两目的片段至原核表达载体pET-28a,生成pET-28a/C2-C4-Linker-hTGF-β1,转染E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使用0.1 mmol/L的IPTG诱导蛋白表达,以Western blot方法鉴定表达结果。结果表明,成功扩增人TGF-β1及C2-C4区基因并分别克隆入pCR2.1-T载体,经亚克隆构建了重组蛋白的原核表达质粒pET-28a/C2-C4-Linker-hTGF-β1,并转染E.coli BL21(DE3)感受态细胞获得工程菌株,通过IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式获得表达。结论:本研究成功构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并获得原核表达。     

人血浆蛋白S成熟肽基因在大肠杆菌中的融合表达

目的 构建人血浆蛋白S的原核表达载体并诱导其表达。方法 自行设计引物，采用PCR法，以现有人血浆蛋白S真核表达载体为模板，扩增人血浆蛋白S成熟肽的编码序列。PCR产物经EcoRI和BamHI双酶切后，克隆至GST融合表达载体pGEX-2T中，在E．coli BL21中诱导GST-人血浆蛋白S融合蛋白的表达。结果 对重组质粒的序列分析表明，插入片段的序列与Gen Bank登录的人血浆蛋白S基因编码序列完全一致。10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达分子量约为96kD的产物．并可通过GST亲和层析柱纯化。结论 人血浆蛋白S编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T，并在E．coli BL21中获得表达。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆及表达

目的对金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(SEA)进行克隆、鉴定与表达,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究SEA的功能奠定基础。方法用聚合酶链反应(PCR)扩增SEA基因,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T上,经测序反应确定无误,酶切后将SEA基因与原核表达载体pET42b( )构建表达SEA的重组质粒,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,经双酶切鉴定后,再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内,对转化菌株进行诱导后,破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果构建了表达载体pET42b( )-SEA,并获得高效表达,表达的蛋白质相对分子质量为27 000,重组蛋白(rSEA)在37℃、25℃经异丙基硫化-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导时均以包涵体形式存在。结论SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达,为制备单抗、诊断试剂及其致病机制研究奠定了基础。     

人Toll样受体4胞浆内段融合蛋白表达载体的构建与表达

目的：构建人Toll样受体4胞浆内段（hTLR4C)His融合蛋白表达载体并在原核表达与纯化，以研究其功能及鉴定与其相互作用的蛋白。方法：采用PCR方法扩增hTLR4基因编码区的胞浆内段，并将其重组于pET-DsbA2.0载体中。重组质粒经酶切、序列鉴定分析后，转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果：用异丙基β－D硫代半乳糖（IPTG）诱导产生hTLR4胞浆内段的His-DsbA融合蛋白，继而纯化获得了分子量约42kd的融合蛋白。结论：本研究成功地构建了hTLR4胞浆内段融合蛋白表达载体并获得高效表达，为进一步研究提供了重要的实验材料。     

弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆与原核表达

目的 克隆弓形虫RH株次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）基因，构建原核表达载体，并表达该重组蛋白。方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入BamHI和XhoⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫HXGPRT基因片段，插入克隆载体pMD18-T，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，插入原核表达质粒pET28a，重组子双酶切、PCR和测序鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株cD-NA中扩增出693bp的HXGPRT基因片段；含pET28a／HXGPRT的宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物，Western blotting提示重组蛋白能够被弓形虫患者血清中的IgG抗体识别，获得纯化的重组蛋白。结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取HXGPRT基因，构建pET28a／HXGPRT重组质粒，并高效表达．为进一步研究提供了条件。     

犬黑皮质素受体3原核表达载体的构建与表达

背景:近年黑皮质素受体家族在体内能量平衡中的作用越来越受到重视.黑皮质素受体3基因突变是引起体质量增加的重要因素之一,但是目前对黑皮质素受体3的深入研究很少,且未见在蛋白水平上检测其表达的单克隆抗体.目的:构建犬黑皮质素受体3基因编码区的原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达.方法:以Beagle犬基因组DNA为模板,设计特异性引物,经PCR技术扩增目的片段后,克隆到pMD18-T载体上,双酶切鉴定以后将目的基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coli DH5α,筛选阳性克隆,DNA测序检测插入序列的正确性.将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC3R转化到E.coli BL21内,经IPTG诱导后,利用Western blot检测犬黑皮质素受体3融合蛋白的表达.结果及结论:成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC3R,经DNA测序证实插入序列与Genebank上公布的序列一致.此重组体经诱导后能在E. coli BL21内表达犬黑皮质素受体3融合蛋白,为进一步获取犬黑皮质素受体3的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究大黑皮质素受体3蛋白的结构和生理功能提供帮助.     

构建胶质原纤维酸性蛋白原核表达载体及蛋白表达鉴定

背景:胶质原纤维酸性蛋白在神经损伤的发生发展过程中具有重要作用.目的:对胶质纤维酸性蛋白进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定.设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-09/1 1在上海市长征医院神经外科实验室完成.材料:中间载体pGEM-T Easy质粒购于Promega公司,原核表达质粒pGEX-4T-2由上海市长征医院神经外科实验室保存.方法:从人脑胶质瘤组织提取mRNA,采用反转录一聚合酶链反应的方法扩增胶质纤维酸性蛋白序列并表达,然后与载体pGEX-4T-2连接,转化宿主菌BL21构建重组质粒,诱导表达后纯化,Westem-blot鉴定.主要观察指标:总RNA鉴定结果,聚合酶链反应扩增产物分子质量的鉴定,重组表达载体的酶切鉴定,Western-blot鉴定.结果:抽提肿瘤组织总RNA后,电泳清晰可见rRNA28S、18S、5S 3条带.且总RNA的A260nm/A280nm值为1.903.聚合酶链反应结果显示,在约1 300 bp左右有一条特异性条带,与预期的胶质原纤维酸性蛋白基因大小一致.重组表达载体的酶切鉴定及测序结果与GenBank的胶质原纤维酸性蛋白序列一致,经Western-blot验证为目的蛋白.结论:用双酶切、DNA测序与Western.blot的方法证实原核表达载体构建成功.     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列，设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白，用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

基因ifi56在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化中的表达及其真核表达质粒的构建

本研究探讨ifi56基因在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化中的表达,构建人ifi56真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位情况。用RT-PCR技术检测APL细胞NB4经维甲酸处理不同时间后ifi56的表达,并从白血病细胞NB4中扩增ifi56全长编码序列,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,转染到293T细胞中,提取细胞蛋白,用Western blot方法检测蛋白表达情况,荧光显微镜检测IFI56的定位。结果表明,ifi56在未经处理的NB4细胞中几乎检测不到,当用维甲酸处理72小时后明显升高,并成功将ifi56插入到质粒pEGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为83 kD。IFI56重组蛋白在293T细胞内主要定位于细胞胞浆中。结论:ifi56表达随着APL细胞分化明显升高,成功构建ifi56基因真核表达载体,IFI56蛋白主要定位于细胞浆。     

携带双报告基因真核表达载体pHSV1-TK-IRES2-EGFP在小鼠骨髓间充质干细胞内的表达

背景：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（herpes simplex virus 1-thymidine kinase,HSV1-TK）与绿色荧光蛋白（EGFP）双报告基因共表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞内的表达研究报道较少。目的：构建pHSV1-TK-IRES2-EGFP真核表达载体,并检测其在体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞内的表达。方法：应用聚合酶链式反应从质粒pHSV106中扩增出HSV1-TK基因后与pMD18-T载体连接,构成重组质粒pHSV1-TK/18T。重组质粒以限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ进行双酶切,将其插入同样双酶切处理的pIRES2-EGFP载体内;并将新构成的重组质粒pHSV1-TK-IRES2-EGFP以脂质体法转染小鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论：酶切鉴定结果表明,扩增的HSV1-TK基因序列正确,大小为1130bp;重组质粒载体内的HSV1-TK序列与GeneBank报告的序列完全一致;骨髓间充质干细胞转染后在荧光显微镜下可以观察到有特异性绿色荧光出现,HSV1-TK的mRNA有表达。实验成功构建了pHSV1-TK-IRES2-EGFP真核表达载体,在体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞内能有效的表达。     

结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的　克隆结核分枝杆菌 (MTB)分泌蛋白ESAT6基因 ,并构建重组表达质粒。方法　根据Genbank中ESAT6基因序列 ,针对其编码区合成引物 ,采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因 ,并连接到T载体 ,然后定向克隆到原核表达质粒pGEX 4T 2 ,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果　经双内切酶消化所切下的片段 ,大小与预计相符 ;测序结果证实基因序列正确 ,符合表达框架。结论　成功构建了重组原核表达质粒 pGEX ESAT6。     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达

背景：研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。目的：应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。方法：构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和（或）外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21d后行矿化（钙）结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。结果与结论：①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。     

结核分枝杆菌rdESAT-6抗原在耻垢分枝杆菌中的制备及其血清学诊断研究

目的构建结核分枝杆菌(MTB)融合基因2×esat-6原核表达载体,利用耻垢分枝杆菌诱导表达、纯化早期分泌抗原ESAT-6重组二聚体(rdESAT-6),Western blot分析其抗原性,并评估其在结核病患者中的血清学诊断价值。方法以DNA疫苗HG856A2为模板扩增2×esat-6基因,构建pMF41-2×esat-6原核表达载体,电转化耻垢分枝杆菌,诱导表达rdESAT-6蛋白,Western blot分析其抗原性。收集126例确诊的结核病患者和42名健康体检者的血清,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和结核斑点金免疫渗滤试验(TB-DOT)检测血清结核抗体,评估rdESAT-6在结核血清学诊断中的价值。结果成功构建了pMF41-2×esat-6重组质粒,以包涵体形式表达了rdESAT-6蛋白,纯化的蛋白纯度在95%以上,可与小鼠抗ESAT-6血清发生特异性反应。126例结核病患者血清检测结果表明,rdESAT-6蛋白在MTB阳性组和阴性组患者血清学诊断的敏感性分别为79.75%(63/79)、61.70%(29/47),好于TB-DOT的62.03%(49/79)、44.68%(21/47)(P0.05)。2种方法对42名健康体检者血清诊断特异性均为95.24%(40/42)。结论 MTB的融合蛋白rdESAT-6用于结核病血清学检测具有较好的敏感性和特异性,可作为结核病血清学诊断的优选抗原。     

pcDNA-GPC3真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类GPC3重组真核表达载体。方法以人类肝脏cDNA文库为模板扩增出GPC3基因序列,应用T克隆载体及pcDNA真核表达载体重构,将质粒转化进入HLE人肝癌细胞系,进行荧光免疫方法检测。结果 测序结果序列正确,荧光染色转染质粒的HLE细胞可见细胞浆和细胞膜上有GPC3的表达。结论成功构建真核表达载体pcDNA-GPC3,并在真核细胞中可以表达。