Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定

目的:繁殖及鉴定Presenilins双基因敲除小鼠,为进一步研究阿尔茨海默症(AD)奠定基础。方法:将引进的野生型及PS1/PS2双基因敲除小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功的子代小鼠基因型有野生型、杂合子和纯合子3种。提取子代小鼠鼠尾基因组DNA,用PCR法和琼脂糖凝胶电泳鉴定基因类型。结果:PS1/PS2双基因敲除小鼠的饲养和繁殖均获得成功,繁殖结果符合孟德尔遗传规律,同时获得更多基因型小鼠和Presenilins双基因敲除小鼠。结论:正确的饲养繁殖以及鉴定方法是获得PS1/PS2双基因敲除小鼠的有效途径。     

Grx-1基因敲除鼠的繁殖及子代基因型鉴定

目的探讨glutaredoxin-1(Grx-1)基因敲除小鼠的优化繁殖及子代鼠的鉴定方法,为进一步研究Grx-1在支气管肺发育不良(BPD)中的作用奠定基础。方法将从美国哈佛医学院引进的纯合子Grx-1基因敲除小鼠与野生型小鼠进行交配后得到的子一代小鼠同代间相互交配,繁殖出的子二代中将出现纯合子、杂合子以及野生型3种基因型。从出生起观察其生长发育情况,2周龄时剪尾提取基因组DNA,用PCR方法扩增目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳结果判定基因型。结果 Grx-1纯合子小鼠的饲养繁殖取得成功,获得了一批Grx-1基因敲除纯合子小鼠。结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法是获得Grx-1基因敲除纯合子小鼠的有效途径,为相关研究提供动物实验模型奠定了基础。     

去泛素化酶OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型的构建与表型分析

目的:建立OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型,初步分析其表型并研究OTUB1基因与肝脏代谢的关系。方法:利用Cre/Loxp系统构建条件性基因敲除小鼠模型,即将OTUB1~(fl/fl)转基因小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,子代自交,得到OTUB1肝特异性基因敲除小鼠并进行鉴定。取同窝对照小鼠(control,NC)和肝特异型基因敲除(hepatic-specific OTUB1 knockout,HCKO)小鼠,通过PCR和免疫印迹(Western blot),确证OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型是否成功构建。通过组织病理学方法,分析主要组织器官的形态以及是否存在自发的病变;通过血清生化指标检测肝脏脂代谢水平;通过血糖耐受实验(GTT)分析HCKO小鼠对血糖的控制。结果:基因组测序和Western blot检测结果显示HCKO小鼠肝脏中OTUB1被敲除,其他组织中OTUB1表达水平无变化,证明OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型构建成功。HCKO小鼠出生正常,各组织器官无异常,生化指标中总胆固醇水平明显降低,表明OTUB1影响肝脏脂代谢水平。糖耐受实验中HCKO小鼠血糖回落迅速,表明敲除OTUB1影响肝脏血糖调节稳态。结论:应用Cre/Loxp技术成功建立OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型,为研究OTUB1在肝脏的生理功能和调控机制提供了重要的动物模型。     

精胺对Azin1基因敲除小鼠体内Atp8a1基因表达调控的研究

目的 研究精胺对Azin1基因敲除小鼠体内Atp8a1基因表达的影响,并对其作用机理进行初步的探讨.方法 利用Real-time PCR检测正常小鼠和Azin1基因敲除小鼠体内Atp8a1基因的在mRNA水平上的差异表达情况;构建Atp8a1基因的启动子虫荧光素酶报告质粒;将启动子重组质粒转染NTH3T3细胞后,在细胞培养液中加入精胺,检测精胺对启动子活性的影响.结果 Atp8a1基因在Azin1基因敲除小鼠体内的表达量明显增加;精胺能够增强Atp8a1的启动子活性.结论 精胺能够通过增强Atp8a1的启动子活性而增强其在Ain1基因敲除小鼠体内转录水平的表达.     

Lats1基因敲除小鼠保种的研究

目的　以Lats1基因敲除小鼠为例 ,研究国家遗传工程小鼠资源库遗传小鼠的保种技术路线及方法。方法　采用了胚胎移植 ,目的基因检测 ,胚胎冷冻等技术。结果　在库内得到 2 4只Lats+ -小鼠 ,扩群后 ,冷冻保存 110枚胚胎。结论　上述方法能确保Lats1基因敲除小鼠资源库保种成功。     

内皮和造血系统特异性敲除Rictor基因对胎肝造血的影响

目的:研究Rictor基因对胚胎发育过程中胎肝造血的影响。方法:利用Cre-LoxP基因敲除系统,特异性在小鼠内皮(VEC-Cre)和造血(Vav1-Cre)系统敲除Rictor基因;通过流式细胞术分析特异敲除Rictor基因后小鼠胚胎第15 d胎肝中的各系细胞比例的变化,并进一步分析造血干细胞的变化。结果:利用VEC-Cre和Vav1-Cre小鼠敲除Rictor基因后,胎肝中各系细胞比例均有所减少,B细胞比例的减少较为明显,造血干细胞比例也明显减少。结论:Rictor基因敲除损害胎肝组织中造血干细胞的产生和各系细胞的分化。     

Muc2和DCN基因敲除小鼠食子现象的初步研究

目的探讨Muc2和DCN基因敲除小鼠繁殖能力和食子现象的异同。方法分别将Muc2和DCN基因敲除纯合子雌雄小鼠按1∶1或1∶2的合笼,观察1～3胎产仔量、胎次间隔时间、出生存活率和食子现象。结果Muc2基因敲除小鼠平均产子量5.80±0.95只,平均胎次间隔时间（42.29±2.28）d;DCN基因敲除小鼠平均产子量3.85±0.76只,平均胎次间隔时间（24.86±10.42）d。Muc2和DCN基因敲除小鼠在产仔量、胎次间隔时间、出生存活率和食子率差异均存在显著性。结论两组基因敲除小鼠繁殖性能有差异,揭示可能与Muc2和DCN基因有关。     

敲除NDRG2 基因的AD模型小鼠的构建与鉴定

目的:构建与鉴定NDRG2基因全身敲除的阿尔茨海默症(AD)小鼠模型。方法:将NDRG2-/-、APP/PS1进行饲养杂交繁殖,将通过PCR技术鉴定基因型为NDRG2+/-APP/PS1的子一代小鼠再与NDRG2-/-小鼠回交获得子二代小鼠,提取子二代小鼠的基因组DNA再利用PCR方法:扩增NDRG2和APP/PS1基因片段并进行琼脂糖凝胶电泳检测获得4种基因型的小鼠。结果:选取基因型为NDRG2-/-APP/PS1的小鼠即为全身NDRG2敲除且淀粉样蛋白基因过表达的阿尔茨海默症模型小鼠。应用PCR方法:鉴定NDRG2基因全身敲除的AD小鼠模型。成功获得NDRG2基因全身敲除的AD小鼠,该基因型小鼠有繁殖能力,其繁殖符合孟德尔遗传规律。结论:成功构建NDRG2基因敲除的阿尔茨海默症模型小鼠,为进一步研究NDRG2基因在阿尔茨海默症病理发展过程中的作用机制及新的治疗方法的研究提供模型基础。     

FKBP38肝脏特异敲除小鼠模型的构建

目的:构建FKBP38(FK506 Binding Protein 38)基因肝脏特异敲除小鼠。方法:利用胚胎注射法构建在FKBP38上携带lox P位点的转基因小鼠。在FKBP38基因位置携带lox P位点的小鼠的基础上,以肝脏实质细胞特异性表达的Alb-Cre介导FKBP38条件性敲除,以获得FKBP38基因肝脏特异敲除小鼠模型Alb-Cre:FKBP38~(fl/fl)。同时对FKBP38特异性敲除鼠进行鉴定。结果:(1)FKBP38肝脏特异敲除小鼠FKBP38~(-/-)肝脏中FKBP38基因的m RNA水平相对于同年龄同窝野生型小鼠具有统计学差异(P0.001)。(2)FKBP38肝脏特异敲除小鼠FKBP38~(-/-)肝脏中FKBP38基因的蛋白表达水平相对于同年龄同窝野生型小鼠具有统计学差异(P0.001)。(3)FKBP38肝脏特异敲除小鼠FKBP38~(-/-)肝脏中,转录和翻译相关蛋白水平未见显著差异,p70 S6K的磷酸化水平轻微上调,4EBP-1的磷酸化水平有轻微下调。(4)FKBP38肝脏特异敲除小鼠FKBP38~(-/-)肝脏中,凋亡相关蛋白Bcl-2未见差异化表达。结论:FKBP38肝脏特异敲除小鼠FKBP38~(-/-)肝脏中,FKBP38基因的m RNA和蛋白基本不表达,提示成功构建FKBP38基因肝脏特异敲除小鼠。     

Exonuclease-1缺失延缓端粒酶缺失小鼠造血微环境的衰老

目的研究Exo-1对端粒酶缺失小鼠造血微环境衰老的影响。方法以端粒酶基因敲除小鼠（Terc-/-）和Exo-1基因敲除小鼠（Exo-1-/-）杂交,并进一步互交产生第三代端粒酶基因敲除小鼠（G3Terc-/-）以及第三代Terc和Exo-1双基因敲除小鼠（G3Terc-/-Exo-1-/-）。以CD45.1野生型小鼠的骨髓细胞为供体,以2月龄G3Terc-/-或G3Terc-/-Exo-1-/-小鼠为受体,进行骨髓移植。在受体小鼠9月龄时,取骨髓、脾脏、胸腺、外周血等组织器官的细胞进行流式分析,研究G3Terc-/-和G3Terc-/-Exo-1-/-受体小鼠中的野生型供体来源的造血干细胞的发育分化。结果同G3Terc-/-小鼠相比,G3Terc-/-Exo-1-/-双基因敲除受体小鼠骨髓中野生型供体来源的B220＋细胞比例升高,前体B细胞的比例也明显升高;脾脏B220＋细胞的比例明显升高;胸腺发育正常;外周血中B220＋细胞比例升高。结论 Exo-1缺失延缓了端粒酶基因敲除小鼠造血系统微环境的衰老,从而逆转了端粒功能障碍引起的骨髓造血干细胞发育分化异常。     

SHBG基因敲除小鼠模型的建立及其表型分析

目的:建立性激素结合球蛋白(SHBG)基因条件敲除小鼠模型,为探讨胎盘组织中SHBG在体内的生理功能及其与妊娠期糖尿病发病关系提供实验手段。方法:首先运用生物信息学手段确定小鼠SHBG基因组序列,构建SHBG打靶载体,以电穿孔方法将其导入小鼠ES细胞,筛选培养阳性ES细胞并行PCR鉴定,并将正确同源重组的ES细胞注射进小鼠囊胚,移入受体小鼠子宫;将获得的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配,筛选后获得Flox小鼠,该小鼠与EIIa-Cre转基因小鼠杂交,子代多次自交获得SHBG全身基因敲除(SHBG~(-/-))的小鼠。结果:运用同源重组及ES细胞技术建立了SHBG基因的Flox小鼠,并利用Cre/Loxp重组酶系统建立了SHBG基因全身敲除小鼠模型,PCR方法从基因水平证明了SHBG基因Flox小鼠及SHBG基因全身敲除小鼠模型建立成功。对基因敲除鼠进行初步表型分析发现:SHBG基因全身敲除小鼠的生长发育与野生型小鼠相比无明显肉眼所见异常,SHBG基因全身敲除雌雄小鼠均具有生殖能力。结论:成功建立SHBG基因全身敲除小鼠模型,通过对基因敲除鼠进行初步表型分析,发现SHBG基因全身敲除小鼠外观上发育正常,为进一步研究SHBG在妊娠期糖尿病中的作用奠定了基础。     

Cramp基因敲除对小鼠骨髓造血干细胞的影响

目的研究Cramp基因敲除在衰老过程中对小鼠造血干细胞的作用。方法应用流式细胞仪分析3月龄及12月龄Cramp基因敲除小鼠及同窝野生型小鼠的骨髓造血干细胞的比例及不同发育阶段B淋巴细胞的比例。结果与野生型小鼠相比,12月龄Cramp基因敲除小鼠的骨髓长期造血干细胞增多,多潜能造血祖细胞减少;前体B淋巴细胞和未成熟B淋巴细胞减少,成熟B淋巴细胞增多。结论在衰老过程中,Cramp基因敲除对骨髓造血干细胞及B淋巴细胞发育有重要影响。     

少突胶质细胞条件性敲除FGF9基因小鼠模型的建立、鉴定及初步表型

目的建立少突胶质细胞特异性敲除成纤维生长因子9(FGF9)小鼠模型,进一步研究FGF9在神经发育中的作用。方法将Olig1-Cre转基因小鼠与FGF9转基因小鼠(FGF9~(flox/flox))杂交,选取雌性FGF9~(flox/wt)/Olig1-Cre~+与雄性FGF9~(flox/flox)合笼交配,F3代获得少突胶质细胞特异性敲除FGF9基因小鼠(FGF9~(flox/flox)/Olig1-Cre~+)。为了证实条件性基因敲除的特异性及有效性,提取鼠尾组织基因组DNA,通过PCR技术鉴定其基因型,利用蛋白电泳以及激光共聚焦验证FGF9蛋白的表达,并对其表型进行观察。结果从基因水平和蛋白水平证实了成功构建了FGF9~(flox/flox)/Olig1-Cre~+小鼠。初步表型分析显示,敲除组小鼠可活可育,生存期与对照组相同,但发育缓慢体重显著减轻。结论成功获得少突胶质细胞中特异性敲除FGF9基因小鼠,FGF9基因条件性敲除后引起小鼠发育缓慢。     

胸腺上皮细胞特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型的鉴定及免疫学特征观察

目的 构建并鉴定胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells, TECs)特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型,评价其免疫学特征。方法 采用小鼠胚胎干细胞(ES细胞,embryonic stem cells)打靶基因敲除技术,得到F0代的GSK-3β^flox/flox(GSK-3β^f/f)小鼠;再采用Cre-LoxP系统进行小鼠的繁殖;PCR鉴定,筛选出基因型为GSK-3β^f/fFoxN1-Cre^+/-(GSK-3β^-/-)小鼠,即为在TECs特异性敲除GSK-3β基因的小鼠。观察基因敲除鼠的一般生物学特征、繁殖能力和子代存活率。应用HE染色、流式细胞术及免疫荧光技术,比较基因敲除鼠和野生型小鼠免疫器官结构、胸腺、脾及外周血中免疫细胞比例及增殖能力差异。结果 成功构建TECs特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型。与野生型(wild type, WT)小鼠相比,GSK-3β^-/-小鼠一般生物学特征无明显差异,子代存活率> 90%;衰老进程中...     

Exo-1基因对端粒酶缺陷小鼠造血干细胞植入效率的影响

目的利用不同的造血干细胞移植方式,探讨Exo-1基因缺失对端粒酶基因敲除小鼠的造血干细胞植入效率的影响。方法以CD45.1小鼠的骨髓细胞或骨髓造血干细胞为供体,以端粒酶基因敲除小鼠或Exo-1基因和端粒酶基因双敲除小鼠为受体,在给予不同剂量X线照射或不照射的情况下,重复进行静脉注射全骨髓细胞或分选的骨髓造血干细胞(c-kit+、Sca-1+、lineage-,KSL),于移植后1个月取外周血,流式分析嵌合率。结果未经X线照射及1 Gy、2 Gy照射情况下,端粒酶基因缺陷受体小鼠的外周血中供体来源的细胞嵌合率较低;6 Gy照射后,供体来源的外周血细胞嵌合率仍低于50%,而且端粒酶基因缺陷受体小鼠在移植后1个月内死亡较多;3 Gy照射可形成较高嵌合率,Exo-1基因缺失对端粒酶缺陷小鼠的造血干细胞植入效率的影响不显著。结论以端粒酶缺陷小鼠作为衰老模型研究造血干细胞植入效率时,3 Gy X线照射能够有效地形成较高的外周血供体细胞的嵌合率,但是Exo-1基因没有进一步提高造血干细胞在端粒酶敲除小鼠的植入效率。     

Fmr1基因敲除小鼠脏器重量和脏器系数的比较分析

目的通过对Fmr1基因敲除小鼠雌雄两性和FVB小鼠的脏器重量和脏器系数进行比较分析,了解其脏器重量的差异,探讨Fmr1基因对动物生长发育等方面的影响。方法分别测定Fmr1基因敲除小鼠雌雄两性和FVB小鼠内脏器官的绝对重量和脏器系数,并进行统计学处理和分析。结果相同年龄的Fmr1基因敲除小鼠雄性的体重、心、肺、肝和肾的绝对重量均极显著的大于雌性（P〈0.01）。雌雄间脏器系数除肾脏（P〈0.05）和脑（P〈0.01）外,其余无显著差异。与FVB小鼠比较,Fmr1基因敲除小鼠心脏较轻（P〈0.01）,肾脏（P〈0.01）、体重和脑较重（P〈0.05）。脏器系数肾脏较大（P〈0.01）,心脏（P〈0.01）、脑和脾（P〈0.05）较小。结论Fmr1基因可影响动物的某些脏器重量和脏器系数。     

1α羟化酶活性和血钙水平对24羟化酶基因表达的影响

目的:研究肾脏24羟化酶基因表达的影响因素。方法:采用两种基因敲除小鼠。每种小鼠又分两种饲养方式。用生化分析仪测定小鼠血钙浓度。用半定量RT-PCR法研究小鼠肾脏组织中1α羟化酶和24羟化酶基因的表达。结果:1α羟化酶基因敲除小鼠体内血钙低于野生型小鼠(78±10.4 mg/Lvs111±16.5 mg/L,P<0.05.),测不出24羟化酶基因表达。维生素D受体基因敲除小鼠有很高的1α羟化酶表达,小鼠血钙也显著低于野生型小鼠(68±9.8 mg/Lvs111±16.5 mg/L,P<0.05),测不出24羟化酶表达。但给予高乳糖饲料后,两种基因敲除小鼠血钙都上升到与野生型小鼠一致水平。此时,24羟化酶基因的表达与野生型也基本一致。结论:血钙是调节24羟化酶基因表达的直接因素,1α羟化酶对24羟化酶的正向调节作用是通过升高血钙来实现的。     

利用细菌人工染色体同源重组对小鼠基因进行条件型敲除

目的:探索通过细菌人工染色体(BAC)同源重组系统构建条件基因敲除载体的高效率方法,提高条件基因敲除小鼠(Flox小鼠)的构建效率。方法:利用作者自己构建的噬菌体重组酶系统,通过BAC同源重组进行条件型基因敲除载体构建工作。首先通过亚克隆构建了一系列载体含有同源臂的靶向质粒,线性化后,打靶片段经电穿孔法转入大肠杆菌内,与相应的BAC同源重组,再经过三步同源重组和一步位点特异性重组,构建小鼠条件型基因敲除载体。结果:高效率构建了小鼠基因的最终条件基因敲除载体。结论:通过BAC同源重组高效构建条件基因敲除载体,为条件基因敲除载体的构建提供了全新思路,并为FLox小鼠的建立,及相应基因在发育、生理、致病机制等方面的功能研究奠定了基础。     

乳腺上皮细胞特异性敲除Scrib基因杂合子小鼠的制作与鉴定

目的利用Cre．LoxP重组酶系统构建乳腺上皮细胞特异性敲除Serib基因杂合子小鼠,并进行鉴定,为进一步在动物整体水平研究Scrib基因在乳腺癌中的作用提供研究平台。方法将Scrib条件敲除杂合子小鼠（Scrib＋/ft小鼠）进行繁殖并鉴定,然后将鉴定结果为阳性的子代Scrib＋/ft小鼠与乳腺上皮细胞特异性表达Cre重组酶的MMTV．Cre纯合子小鼠进行杂交,鉴定其子代小鼠的基因型。结果成功繁育Scrib条件敲除小鼠和MMTV．Cre小鼠,并通过鉴定得到Scrib＋/ft小鼠,与MMTV-Cre小鼠杂交并繁殖,获得基因型为Scrib＋/ft;MMTVCre＋/-小鼠5只。结论本研究利用Cre．LoxP重组酶系统成功构建了乳腺上皮细胞特异性敲除Scrib基因杂合子小鼠,为进一步研究极性蛋白Scrib表达下调在乳腺癌发生中的作用提供了良好的动物模型。     

应用CRISPR/Cas9技术构建YOD1基因敲除小鼠

目的:应用CRISPR/Cas9技术构建去泛素化酶YOD1基因敲除小鼠。方法:针对YOD1基因设计单链向导RNA(sg RNA)识别序列,构建sg RNA质粒,与Cas9质粒体外转录、纯化后注射入受精卵,通过PCR和测序验证得到F0代阳性小鼠。配繁两代后,取同窝对照的野生型(WT)和敲除(KO)小鼠的主要组织器官研磨,使用免疫印迹(WB)技术检测各组织YOD1蛋白的表达,确证YOD1敲除小鼠模型是否成功建立。统计YOD1杂合子(HET)自交存活后代各基因型比例,分析是否有胚胎致死表型。解剖小鼠分析主要组织器官的表型,进一步利用H.E.染色分析KO小鼠是否存在自发的病理改变。通过血糖耐受实验(GTT)分析KO小鼠的血糖调控能力。结果:基因组测序和WB检测结果显示KO小鼠中YOD1被明显敲除,YOD1敲除小鼠模型成功建立。YOD1杂合子自交后代各基因型比例符合孟德尔定律,提示KO小鼠非胚胎致死。YOD1敲除小鼠肝脏显著小于WT小鼠。GTT结果表明敲除YOD1不影响小鼠的血糖稳态。结论:应用CRISPR/Cas9技术成功构建YOD1基因敲除小鼠。KO小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷。与WT小鼠相比,KO小鼠肝脏显著减小,但无显著的自发病理变化,KO小鼠血糖控制亦无显著差异。