乙型肝炎病毒前C/C基因准种与变异特点的研究

近年来的研究提出ＨＢＶ感染者体内存在有准种的假说 ,我们以前Ｃ/Ｃ基因为研究靶区域 ,应用多聚酶链反应(ＰＣＲ)技术扩增慢性乙型肝炎患者血清中的靶序列 ,随机选择克隆测序 ,比较其结果 ,证明了ＨＢＶ准种的存在 ,并发现多种基因突变形式。试验用 4例患者诊断为病毒性肝炎 ,乙型、慢性 ,临床检测ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗 ＨＢｃ阳性。提取 2 0 0 μｌ血清中的ＨＢＶＤＮＡ ,用于多聚酶链反应 (ＰＣＲ)。以甘人宝等发表的ＨＢＶａｄｒ亚型序列为依据 ,设计引物序列。其上游引物为 :5′ＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＣＴＴＴＴ…     

TT病毒的基因变异分析与基因分型

我们对 80例非甲～非庚型肝炎患者、血清ＡＬＴ升高以及长期维持性血透患者 (部分患者有输血史 )进行检测 ,对二十余例ＴＴＶ分离株进行测序研究 ,结果如下 :提取患者血清ＤＮＡ ,巢式ＰＣＲ扩增ＴＴＶ。参照Ｏｋａｍｏｔｏ等报道的Ｎ2 2分离株ＴＴＶ基因序列设计套式引物 :Ｔ15′ -ＡＣＡＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣ - 3′(1892～ 1913) ,Ｔ2 5′-ＧＧＡＴＡＣＣＴＡＴＴＡＧＣＴＣＴＣＡＴ - 3′(2 187- 2 2 0 7) ,Ｔ3 5′ -ＧＧＣＡＡＣＡＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＡＧＡＣ - 3′(1914- 1935 ) ,Ｔ45′ -ＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＡ…     

乙型肝炎核酸疫苗NV—HB／s肌注小鼠后HBsAg的表达和抗 …

目的 研究乙型肝炎核酸疫苗肌注小鼠后在体内的表达及小鼠体液免疫应答的规律,同时观察接种局部组织的病理变化。方法 以乙型肝炎核酸疫苗ＮＶ－ＨＢ／ｓ肌注小鼠,然后定期分批处死,采集肌注局部组织检测ＨＢｓＡｇ（ＡＢＣ免疫组化法）,采集外周血标本检测ＨＢｓＡｇ和抗－ＨＢｓ（ＥＬＩＳＡ法０,并常规病理检查。     

大鼠β-防御素rBD-1基因在皮肤和肾脏固有表达

设计大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ序列一对特异引物：Ｒ１５′→３′ＡＣＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣＣＧ;Ｒ２５′→３′ＣＣＣＴＴＧＣＴＴＧＴＣＣＴＴＴＡＴＧＴＣＣ。根据大鼠β－ａｃｔｉｎｃＤＮＡ序列设计一对阳性对照特异引物：Ｂ１５′→３′ＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧ;Ｂ２５′→３′ＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧ。引物由Ｇｉｂｃｏ公司合成。从Ｗｉｓｔａｒ大鼠皮肤、肾脏、气管、子宫颈、膀胱、小肠、脾脏、骨骼肌、骨髓及腮腺组织中提取总ＲＮＡ,行ＲＴ－ＰＣＲ扩增…     

广西不同人群庚型肝炎病毒感染状况的调查

目的 了解庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）感染在广西柳州地区不同人群中的感染状况，并比较静脉毒瘾者与健康体检者ＨＧＶ，乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）、丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）与ＨＧＶ共同感染的特点，方法 应用酶联免疫法（ＥＬＡ）检测抗－ＨＧＶ，抗－ＨＣＶ，ＨＢＶＭ（ＨＢｓＡｇ，ＨＢｓＡｂ，ＨＢｅＡｇ，ＨＢｅＡｂ，ＨＢｃＡｂ），并对抗－ＨＧＶ阳性者随机抽取２０例（１９％）进一步用逆转录套式ＰＣＲ（ＰＴ－ｎＰＣＲ）法检测     

PCR-RFLP-SSCP及测序用于霍乱弧菌ctx-AB基因多态性的研究

建立ＰＣＲ ＲＦＬＰ ＳＳＣＰ及测序方法 ,用于分析霍乱弧菌肠毒素ＡＢ(ｃｔｘ ＡＢ)基因多态性。针对ｃｔｘ ＡＢ基因设计引物 ,扩增片段为 5 2 8ｂｐ ,包括ｃｔｘ Ｂ编码基因375ｂｐ ,引物序列为 5′ ＧＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧ 3′和 5′ ＧＧＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＣ 3′。ＰＣＲ产物经ＲｓａⅠ酶切为317ｂｐ和 2 11ｂｐ 2个片段。对酶切产物进行单链构象多态性 (ＳＳＣＰ)分析 ,银染作者单位 :5 10 5 15广州 ,第一军医大学流行病学教研室 (芮勇宇 ,俞守义 ,王红 ) ;广东省卫生防疫站 (蔡初的 ,李建基 ,钟豪杰 )…     

应用S基因转染的Sp2／0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫？…

构建编码ＨＢｓＡｇ蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,免疫接种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,以重组质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ转染的Ｓｐ２／０细胞作为靶细胞,采用＾５１Ｃｒ ４ｈ释放法,体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示,与空载体对照组相比较,ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠产生ＨＢＶ特生细胞毒性Ｔ细胞应答,提示以Ｓｐ２／０基因转染的细胞作为靶细胞,检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠淋巴细胞     

乙型肝炎病毒抗原诱导T细胞受体Vβ基因亚家族特 …

目的 对乙型肝炎疫苗注射前后及ＨｅｐＧ２２２１５上清ＨＢｓＡｇ，ＨＢｅＡｇ感染淋巴细胞，Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）Ｖβ基因亚家族表达特征及多样性，为研究识别机制提供依据。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹扫描，结果 乙肝疫苗注射后Ｖβ６，１４增高，ＨｅｐＧ２２２１５上清感染后Ｖβ６１５增高，结论 Ｖβｂ为两种抗原共同识别亚家族，Ｖβ１４，１５为各自的特异民生识别亚家族。     

乙型肝炎病毒抗原诱导T细胞受体Vβ基因亚家族特异性扩增与多样性

目的对乙型肝炎疫苗注射前后及ＨｅｐＧ２２２１５上清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ感染淋巴细胞，Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）Ｖβ基因亚家族表达特征与多样性，为研究识别机制提供依据。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹扫描。结果乙肝疫苗注射后Ｖβ６、１４增高，ＨｅｐＧ２２２１５上清感染后Ｖβ６、１５增高。结论Ｖβｂ为两种抗原共同识别亚家族。Ｖβ１４、１５为各自的特异性识别亚家族     

人B7-1(CD80)逆转录病毒表达载体的构建及其在人肿瘤细胞系的表达

应用分子克隆技术，构建了含全长人Ｂ７－１ｃＤＮＡ（８６７ｂｐ）的逆转录病毒表达载体ｐＬＮＣ－ｈＢ７－１。以ｐＣＤＭ８－ｈＢ７－１为模板，５＇引物为：ＡＣＣＣＴＡＡＧＣＴ，ＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣ，内含ＨｉｎｄⅢ切点及起始密码ＡＴＧ，３’引物为：ＣＴＴＣＴＧＣＧＴＴＡＡＣＴＧ－ＴＴＡＴＡＣＡＧＧＧＣＧＴＡＣ，内含ＨｐａＩ切点和终止密码ＴＡＡ，经ＰＣＲ扩增及电泳回收后得到纯化ＰＣＲ产物，用内切每ＨｉｎｄⅢ和Ｈｐａｌ消化后，定向插入经同样内切酶消化的ｐＬＮＣＸ载体，获得含人Ｂ７－１ｃＤ…     

中国广州人群中HBV感染与HLA-DRB1基因的相关性研究

ＨＬＡ系统在机体的免疫应答和免疫调节中发挥着重要的作用 ,Ⅱ类抗原递呈外源性抗原肽给ＣＤ4+ 辅助性Ｔ细胞 ,其多态性影响着个体的免疫应答和抗原多肽的递呈 ,与自身免疫性疾病和许多感染性疾病的易感性密切相关 ,是研究疾病易感性中不可忽视的遗传因素。本文采用经我们改进的套式ＰＣＲ ＳＳＰ方法对广州地区的 88名无血缘关系的乙肝患者 (ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｂ检测阳性 )和 83名无血缘关系健康个体样品进行了ＨＬＡ ＤＲＢ1基因分型 ,寻找与ＨＢＶ感染的相关性。外引物位于内含子内 ,5′引物 :5′ ＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧ…     

乙型肝炎病毒新的免疫逃避株的S基因序列分析

目的分析乙型肝炎患者体内ＨＢＶＳ基因的变异情况及对乙型肝炎的免疫预防的现实意义。方法采用巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）、Ｍ１３噬菌体克隆和核苷酸序列分析方法对一例乙型肝炎免疫失败儿童患者体内ＨＢＶＳ基因序列进行分析。结果发现该患儿所感染ＨＢＶ的Ｓ基因上有一个重要的点突变,即第５５１位碱基由野生型的Ａ变为Ｇ。该突变使乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）１３３位氨基酸由甲硫（ＡＴＧ）变为缬（ＧＴＧ）。这一氨基酸替换恰恰发生在ＨＢｓＡｇ中和性α抗原决定簇区段（ａａ１２４～ａａ１４７）内。结论鉴于该患者接种乙型肝炎疫苗,其血清呈抗－ＨＢｓ阳性和ＨＢｓＡｇ阴性,推测其体内的ＨＢＶ为一个新的疫苗诱导的免疫逃避株     

深圳地区小儿肠道病毒感染的核酸检测分析

为了解深圳地区肠道病毒 (ＥＶ)的感染流行情况和病毒分型特征 ,我们采用检测ＥＶ的套式逆转录聚合酶链反应(ＲＴ ｎＰＣＲ)方法进行ＥＶ感染检测 ,并对临床分离株 5′端非编码区 ( 5′ＵＴＲ)基因序列进行分子进化树分析。采用ＴＲＩＺＯＬ ＬＳＲｅａｇｅｎｔ试剂从疑诊ＥＶ感染儿童大便、咽拭子和脑脊液中提取ＥＶ ＲＮＡ ,根椐ＥＶ 5′ＵＴＲ保守的基因序列设计两对特异性引物 ,引物序列分别为ＥＶＰ1 60 :5′ＣＡＡＧＣＡＣＴ(ＴＡ)ＴＴ(ＣＡ)ＣＣＣＣＧＧ3′,ＥＶＰ2 50 :5′ＴＡＣＴＴＧＡ(ＧＡ)ＣＣ ＴＡＧＴＡ3′,ＥＶＰ50 0 :5′…     

丙型肝炎病毒及恶性疟原虫复合多表位抗原基因与谷胱甘肽转硫酶基因的融合表达及其在小鼠中免疫应答的研究

目的：探讨复合多表位丙型肝炎病毒（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）及恶性疟原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ,Ｐｆ）双价疫苗的可行性。方法：将人工合成的复合多表位ＨＣＶ基因ＰＣＸ及Ｐｆ抗原基因ＡＢ（ＳＰｆ６６＋ＳＰｆ１０５）克隆到谷胱甘肽转硫酶（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ,ＧＳＴ）表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ中,并在大肠杆菌中高效表达ＧＳＴＨＣＶＰｆ复合抗原（ＧＳＴＣＡＢ）,分析表达产物的免疫特异性、免疫原性及安全性。结果：ＧＳＴＣＡＢ可被ＨＣＶ患者血清、鼠抗ＧＺＰＣＸ及鼠抗Ｐｆ抗体特异识别,可诱发小鼠产生针对ＧＳＴＣＡＢ、ＧＺＰＣＸ及ＰｆＡｇ的特异性体液免疫应答及针对ＧＳＴＣＡＢ、ＧＺＰＣＸ的迟发性超敏反应,免疫后ＣＤ８＋Ｔ细胞比例略为升高,免疫小鼠未见明显的毒副作用。结论：ＧＳＴＣＡＢ融合蛋白具有良好的ＨＣＶ及Ｐｆ免疫特异性,可诱发理想的体液及细胞免疫应答,可望成为ＨＣＶＰｆ双价疫苗的候选抗原。     

佐剂白细胞介素2对乙型肝炎病毒核酸疫苗免疫效应的影响

核酸免疫是指将编码外源蛋白的核酸表达载体直接导入机体以激发机体产生特异性免疫应答。由于核酸疫苗可诱导机体产生较强的细胞免疫应答 ,故有望应用于慢性病毒性感染如乙型肝炎的治疗。探讨如何增强乙型肝炎病毒核酸疫苗的免疫效应 ,尤其细胞免疫效应具有重要意义。为此 ,我们构建了编码乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ ,ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ)表面抗原蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ3 1 Ｓ作为ＨＢＶ核酸疫苗 ,研究了人白细胞介素 2 (ｒｈＩＬ 2 ,ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ 2 )对ＨＢＶ核酸疫苗诱导ＢＡＬ…     

β-防御素-2基因在子宫颈的固有表达

根据ＧｅｎｅＢａｎｋ大鼠β－防御素－２ｃＤＮＡ序列,设计特异引物：Ｒ１５′３′ＧＣＡＣＣＡＧＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧ;Ｒ２５′３′ＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧ。引物由Ｇｉｂｃｏ公司合成。取Ｗｉｓｔａｒ大鼠宫颈组织,用Ｑｉａｇｅｎ公司生产的ＲＮＡ提取试剂盒提取总ＲＮＡ,以此为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,按照试剂盒说明操作,扩增ｃＤＮＡ,反应条件下：５０℃保温３０ｍｉｎ,使ｍＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ;９４℃预变性２ｍｉｎ,然后进行３０个ＰＣＲ循环：９４℃３０ｓ,５８℃退火３０ｓ,６８℃延…     

21—羟化酶CYP21B基因I1e172→Asn错义突变

为了解先天性肾上腺皮质增生症患者的２１－羟化酶ＣＹＰ２１Ｂ其因中Ｉ１ｅ１７２→Ａｓｎ错义突变的发生率，根据放大受阻突变体系的要求，设计了３种引物：５′ｄ（ＴＴＧＧＧＡＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＣＴＣＴ）３′（共同引物），５′ｄ（ＡＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＡ）３′（正常引物），５′ｄ（ＡＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＴ）３′（突变引物），在７例患儿中进行了检测，发现具有本突变者３例。对其中一例进行了的家     

乙肝核酸疫苗NV—HB／s接种后小鼠体液免疫应答的初步研究

乙肝核酸疫苗ＮＶ┐ＨＢ／ｓ接种后小鼠体液免疫应答的初步研究赵连三秦山李水仙唐红刘丽周思亮雷秉钧将乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）主蛋白的编码基因Ｓ插入真核细胞表达质粒ｐＲｃ／ＣＭＶ／ＡＴＧ中的ＣＭＶ启动子下游，获得的重组质粒（ＮＶ－ＨＢ／ｓ）转染真核细...     

表达HBsAg和HBeAg小鼠成纤维胞膜型的建立

目的：建立表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）主要基因产物的细胞克隆，为研究ＨＢＶ的生物学性状及其致病机制提供细胞模型；方法：应用磷酸钙沉淀技术将环化的３．２ｋｂ ＨＢＶＤＡＮ和携带新霉素抗药基因的真核细胞表达载体ｐＣＮＣＸ，导入体外培养的小鼠成纤维ＮＩＨ３Ｔ３细胞；结果：成功地获得表达ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的小鼠成纤维ＮＩＨ３Ｔ３细胞克隆；结论：将ＨＢＶ基因组ＤＮＡ导入体外培养的非肝细胞，ＨＢＶ病毒的ＨＢ     

用热启动聚合酶链反应检测血清中乙型肝炎病毒DNA技术的建立和应用

建立了热启动聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测乙型肝炎病毒ＤＮＡ（ＨＢＶＤＮＡ）的技术。ＰＣＲ所有反应成分被２次加样。先加Ａ液（含ｄＮＴＰｓ、一对引物和ＭｇＣｌ＿２）与一粒石蜡珠。７０℃加热后冷却至室温，使蜡珠先融化后凝固形成蜡盖封住Ａ液，然后在向其上加入Ｂ液（含耐热性ＤＮＡ聚合酶、ＨＢＶＤＮＡ模板和ＫＣｌ）并开始循环扩增。当反应管内第一次变性温度升至６０℃以上时，中隔蜡层融化，蜡上浮形成防蒸发屏障，Ａ、Ｂ两液则由于热分子运动而混匀，从而保证引物与靶基因在较高温度下严格退火以减少错导非特异性扩增和引物聚体形成。提高了ＰＣＲ的特异性和灵敏性，应用这种技术对７６例肝炎血清进行了检测，结果ＨＢＶＤＮＡ检出率为６８％，其中ＨＢｓＡｇ（＋）、ＨＢｅＡｇ（＋）、抗－ＨＢｃ（＋）血清检出率为１００％；ＨＢｓＡｇ（＋）、抗－ＨＢｅ（＋）、抗－ＨＢｃ（＋）血清检出率为７０％；ＨＢｓＡｇ（＋）、抗－ＨＢＣ（＋）血清检出率为８９％；抗ＨＢＣ（＋）血清检出率为对％；标记全阴性血清检出率为３３％。