外环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

目的：研究外环境对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)定向分化成心肌样细胞的影响。方法：取SD大鼠骨髓，通过贴壁法进行MSCs培养，经过多次传代后获得较纯的MSCs。用59氮胞苷进行诱导分化，显微镜下观察其形态变化，通过RT-PCR鉴定心肌特异基因心房利尿肽和脑钠肽表达。实验分I组为在玻片上的5-氮胞苷干预的MSCs移人到心肌细胞培养环境中；Ⅱ组为5-氮胞苷干预的MSCs；Ⅲ组为玻片上未用5-氮胞苷干预的MSCs移入到心肌细胞培养环境中；Ⅳ组为未用5-氮胞苷干预的MSCs。显微镜下观察4组形态变化，并通过免疫组化鉴别结蛋白和心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin，cTnI)表达及其出现时间的早晚。结果：RT-PCR显示诱导6周后有心房利钠肽，脑钠肽的表达。Ⅱ组MSCs诱导后10d可见细胞由原来扁平多角形变成长梭状，15d后部分细胞胞体明显增粗，可见到有些细胞间有融合样情况发生，20d左右类似肌管样细胞出现；而I组在17d左右可以看到类似肌管样细胞；Ⅲ，Ⅳ组未见上述形态改变。免疫组化表明Ⅲ，Ⅳ组未见阳性细胞出现；I，Ⅱ组可见阳性结果，且I组阳性结果出现的比Ⅱ组更早。结论：MSCs在体外的化学诱导物条件下可以诱导分化成心肌样细胞，心肌细胞培养环境对其定向分化成心肌样细胞有促进作用。     

脐血间充质干细胞体外定向诱导向心肌样细胞的转化

目的:观察脐血间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导在体外定向分化为心肌样细胞的形态学及分子生物学特征。方法:选取2003-05/2005-04在郧阳医学院附属十堰市太和医院妇产科患者12例,脐血来源者家属及本人知情同意。取脐静脉血50mL,分离并培养骨髓间充质干细胞,用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化。每日采用相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征,采用RT-PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结果:①形态学变化:5-氮杂胞苷诱导后,约1周出现短棒状或珠状结构,2周排列具有方向性,3周有肌管样结构形成。②超微结构:诱导四五周细胞内含大量线粒体,可见心房颗粒、肌丝形成。③RT-PCR检测:经5-氮杂胞苷诱导四五周骨髓间充质干细胞有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。且心房利钠肽出现3条阳性带。结论:经5-氮杂胞苷诱导脐血间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞,是细胞移植的优良供体。     

骨髓基质干细胞体内和体外分化为心肌细胞的条件

目的:探讨5-氮胞苷和心肌内环境对骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)向心肌细胞转化的影响。方法:体外分离培养纯化MSCs,用Brdu标记MSCs,用不同浓度的5-氮胞苷诱导MSCs3周后,计算心肌细胞转化率。利用免疫组化方法测定诱导后MSCs中心肌特异性抗体(肌钙蛋白Ⅰ,肌凝蛋白重链)的存在。在体实验中,将体外标记的MSCs分为对照组,未诱导组,诱导组,移植给正常鼠,于移植后第1,2和4周取鼠心肌组织的HE病理切片镜下观察,使用免疫组化法检测Brdu阳性细胞中心肌特异性抗体的存在并观察MSCs向心肌细胞转化情况。结果:5-氮胞苷可以在体外诱导MSCs分化为心肌样细胞,而且在5μmol/L浓度的情况下,心肌样细胞转化率最高。同时,心肌内环境也可以诱导MSCs分化为心肌样细胞,而且避免了5-氮胞苷的副作用。结论:MSCs在5-氮胞苷和心肌内环境的作用下均可以分化为心肌样细胞,并具有心肌特异性蛋白结构,可以作为心肌细胞移植的理想种子来源。     

骨髓基质干细胞体内和体外分化为心肌细胞的条件

目的：探讨5-氮胞苷和心肌内环境对骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)向心肌细胞转化的影响。方法：体外分离培养纯化MSCs，用Brdu标记MSCs，用不同浓度的5-氮胞苷诱导MSCs3周后，计算心肌细胞转化率。利用免疫组化方法测定诱导后MSCs中心肌特异性抗体(肌钙蛋白Ⅰ，肌凝蛋白重链)的存在。在体实验中，将体外标记的MSCs分为对照组，未诱导组，诱导组，移植给正常鼠，于移植后第1，2和4周取鼠心肌组织的HE病理切片镜下观察，使用免疫组化法检测Brdu阳性细胞中心肌特异性抗体的存在并观察MSCs向心肌细胞转化情况。结果：5-氮胞苷可以在体外诱导MSCs分化为心肌样细胞，而且在5μmol／L浓度的情况下，心肌样细胞转化率最高。同时，心肌内环境也可以诱导MSCs分化为心肌样细胞，而且避免了5-氮胞苷的副作用。结论：MSCs在5-氮胞苷和心肌内环境的作用下均可以分化为心肌样细胞，并具有心肌特异性蛋白结构，可以作为心肌细胞移植的理想种子来源。     

脐血问充质干细胞体外定向诱导向心肌样细胞的转化

目的：观察脐血间充质干细胞经5一氮杂胞苷诱导在体外定向分化为心肌样细胞的形态学及分子生物学特征。方法：选取2003-05／2005-04在郧阳医学院附属十堰市太和医院妇产科患者12例，脐血来源者家属及本人知情同意。取脐静脉血50mL，分离并培养骨髓间充质干细胞，用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化。每日采用相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征，采用RT-PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结果：①形态学变化：5-氮杂胞苷诱导后，约1周出现短棒状或珠状结构。2周排列具有方向性，3周有肌管样结构形成。②超微结构：诱导四五周细胞内含大量线粒体，可见心房颗粒、肌丝形成。③RT-PCR检测：经5-氮杂胞苷诱导四五周骨髓间充质干细胞有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。且心房利钠肽出现3条阳性带。结论：经5-氮杂胞苷诱导脐血间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞，是细胞移植的优良供体。     

骨髓间充质干细胞的生物学特性及其向心肌样细胞的分化

【目的】体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),分析其生物学特性;5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-aza)定向诱导其向心肌细胞分化。【方法】采用体外密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志;用含有5-aza(10μmol/L)的培养液培养第二代MSCs24h,诱导其向心肌细胞分化;诱导4周后采用免疫荧光技术检测心肌细胞特异性标志物Connexin 43和TroponinⅠ的表达。【结果】体外分离培养的细胞形态主要为纺锤形和长梭形,细胞表面抗原CD29、CD44表达为阳性,CD34、CD45表达为阴性;经5-aza诱导后细胞表达心肌细胞特异蛋白Connexin 43和TroponinⅠ。【结论】MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,体外经5-aza诱导可以定向分化为心肌样细胞。MSCs为心血管疾病的治疗提供了种子细胞。     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化及黄芪甲苷的协同作用（英文）

背景：大多学者使用5-氮胞苷作为诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化。目的：观察联合应用黄芪甲苷及5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化中心肌细胞相关受体的表达。方法：选用生长良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为4组。Ⅰ组：仅更换L-DMEM培养液;Ⅱ组：100mg/L黄芪甲苷＋5μmol/L5-氮胞苷诱导24h后,更换L-DMEM培养液。Ⅲ组：10μmol/L5-氮胞苷孵育24h后,更换L-DMEM培养液;Ⅳ组：5μmol/L5-氮胞苷孵育24h后,更换L-DMEM培养液。各组均每3d换液1次,诱导30d后对分化细胞进行鉴定。结果与结论：①Ⅲ组、Ⅳ组及Ⅱ组诱导后细胞心肌细胞特异性蛋白Nkx2.5、cTnT及Desmin的表达均为阳性,与Ⅰ组比较,差异有非常显著性意义（P〈0.01）。Ⅱ组及Ⅲ组诱导后2周,镜下见cTnT、Desmin表达数量高于Ⅳ组（P〈0.01）。Nkx2.5在两组表达亦高于Ⅳ组,其中Ⅱ组与Ⅳ组比较,差异有极显著性意义（P〈0.01）,Ⅲ组与Ⅳ组比较,差异有显著性意义（P〈0.05）。Ⅰ组无上述蛋白的阳性表达。②诱导后2周,镜下可见Ⅱ组、Ⅲ组细胞出现心肌细胞样的节律性跳动,证明部分细胞在诱导因素的作用下,已向心肌细胞分化。结果表明用100mg/L黄芪甲苷＋5μmol/L5-氮胞苷联合诱导可产生与10μmol/L5-氮胞苷相似的诱导效果,这可能与黄芪甲苷对细胞具有保护作用,促血管内皮细胞增殖作用,增强细胞对5-氮胞苷细胞毒性的耐受,上调心肌特异性蛋白的表达有关。     

心血管疾病移植治疗的理想材料:骨髓间质干细胞在体外不同心肌细胞微环境中的定向分化研究

目的:研究兔骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外不同的仔鼠心肌细胞微环境中的定向分化情况,为心血管疾病细胞移植 治疗提供基础。 方法:体外分离培养兔MSCs,经5-氮杂胞苷诱导后分别与正常的及经阿霉素预处理的乳鼠心肌细胞一起置于Milliccll装置中共培养(正常组和阿霉素组),分别在共培养后的第14,21,28天,采用免疫细胞化学方法、反转录聚合酶链反应(RT-polymerase chain reaction;RT-PCR)鉴定,并用流式细胞仪检测横纹肌辅肌动蛋白阳性细胞所占百分比。取仅经5-氮杂胞苷诱导的MSCs作为对照组。 结果:14 d时仅正常组个别细胞横纹肌辅肌动蛋白、缝隙连接蛋白弱阳性;21,28 d 3组均可见阳性细胞;RT-PCR方法示可表达纹状肌球蛋白。但正常组免疫荧光阳性的细胞比例较对照组和阿霉素组大。 结论:MSCs是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞,在体外正常和病理性心肌细胞微环境均可分化为心肌样细胞,且微环境对其分化有促进作用。MSCs可能成为细胞移植治疗心血管疾病的又一种新的细胞来源。     

5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验

目的:观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的情况及GATA-4和Nkx2.5基因的表达,从而确定人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。方法:实验于2005-08/2006-05在解放军沈阳军区总医院心血管外科和中国医科大学实验技术中心一部完成。取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨,抽取骨髓。利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞,并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞表面抗原进行测定。应用10μmol/L5-氮胞苷对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24h,于诱导后1,2,3,4周,用反转录-聚合酶链反应检测GATA-4和Nkx2.5基因表达。结果:①3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定,表达CD29,CD44,不表达CD34,CD45。②以5-氮胞苷诱导培养24h后,骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化,诱导1周后,细胞体积增大,多呈长梭行,平行排列;诱导2周后,细胞变为短柱状,突起位于两端,相邻细胞的突起紧密接触;诱导3周后,短柱状细胞的突起相互连接,部分细胞可见类肌管样结构;诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。③诱导组细胞GATA-4和Nkx2.5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性,对照组为阴性,诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论:5-氮胞苷可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化,其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间。     

5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验

目的：观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的情况及GATA-4和Nkx2．5基因的表达，从而确定人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。方法：实验于2005—08／2006—05在解放军沈阳军区总医院心血管外科和中国医科大学实验技术中心一部完成。取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨，抽取骨髓。利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞，并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞表面抗原进行测定。应用10μmol／L 5-氮胞苷对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24h，于诱导后1，2，3，4周，用反转录-聚合酶链反应检测GATA-4和Nkx2．5基因表达。结果：①3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定，表达CD29，CD44，不表达CD34，CD45。②以5-氮胞苷诱导培养24h后，骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化，诱导1周后，细胞体积增大，多呈长梭行，平行排列；诱导2周后，细胞变为短柱状，突起位于两端，相邻细胞的突起紧密接触；诱导3周后，短柱状细胞的突起相互连接，部分细胞可见类肌管样结构；诱导4周后，细胞体积变小，可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构，③诱导组细胞GATA-4和Nkx2．5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性，对照组为阴性，诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论：5-氮胞苷可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化，其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间。     

干细胞：许旺细胞的新来源

背景：许旺细胞对神经系统损伤的修复与再生有着重要作用。然而,许旺细胞不易直接获取,使其在临床上的应用受到限制。目的：综述神经损伤及修复过程、许旺细胞的作用以及各种干细胞分化为许旺细胞的潜能。方法：使用计算机检索Pubmed数据库2000/2011有关许旺细胞参与神经损伤的修复、干细胞分化为许旺细胞验证及应用的文献,检索词为＂Schwann cells,nervous system,stem cells＂。排除重复性研究,对资料进行初审,并查看每篇文献及其引文。根据纳入标准,收集到29篇相关文献。结果与结论：许旺细胞通过分泌各种细胞因子和营养因子为受损的神经营造了适于修复与再生的微环境,从而促进轴突再生;同时通过增殖及分化等机制围绕新生轴突形成髓鞘。神经修复需要大量许旺细胞的参与,而许旺细胞不易直接获取。研究表明,各种干细胞,包括胚胎干细胞、间充质干细胞、神经嵴干细胞和嗅鞘细胞,能在一定诱导条件下分化为许旺细胞样细胞,为神经系统损伤的治疗带来了新的希望。其中,间充质干细胞的研究备受关注。     

卵圆细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞

背景:原代分离的肝卵圆细胞具有双向分化的能力和橫向分化的可塑性.目的:分离大鼠肝脏卵圆细胞,在化学诱导剂作用下使其定向分化为胰岛素分泌细胞.设计、时间及地点:对照观察细胞实验,于2007-05/2008-01在解放军总医院基础研究部,国家重点实验室完成.材料:SPF级SD大鼠,体质量(120±20)g.方法:采用改良梯度离心法分离、培养大鼠肝卵圆细胞,并行免疫组织化学鉴定.随后将卵圆细胞置于含有诱导剂Nicotimide和高浓度葡萄糖的RPMI 1640培养液继续培养,同时以不含诱导剂的RPMI 1640培养液培养的卵圆细胞作为阴性对照.主要观察指标:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附实验、放射免疫分析检测两组卵圆细胞胰岛素的表达.结果:改良的梯度离心方法分离的细胞具干细胞特点,可形成集落,并且OV6、CD34、Nestin染色呈阳性.分离的大鼠肝卵圆细胞,加入诱导剂Nicotimide和高浓度葡萄糖诱导培养l周后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附、RIA检测均显示胰岛素分泌量远高于不含诱导剂细胞(P<0.05).结论:化学诱导剂Nicotimide和高浓度匍萄糖可以在短时期内作用肝卵圆细胞可启动胰十二指肠同源盒基因-1基因,使之定向分化为胰岛素分泌细胞.     

体外诱导脂肪干细胞向内皮细胞及成血管的分化

背景：脂肪干细胞作为组织工程中种子细胞的选择,可以诱导为内皮细胞从而有效解决材料血管化困难的难题。目的：体外观察脂肪干细胞经诱导向内皮细胞转分化的可能性、以及在立体培养基上的血管形成情况。方法：切取人皮下脂肪,用酶消化法分离和培养脂肪干细胞,将传至第3代或第4代的脂肪干细胞用内皮细胞诱导液、同时在Matrigel三维培养基内诱导培养,观察细胞生长情况及变化。对脂肪干细胞和诱导细胞行免疫组织化学检查CD31的表达。结果与结论：免疫组织化学检测脂肪干细胞的CD31表达阴性,诱导细胞CD31可见阳性表达。在三维立体培养基内诱导的细胞24h逐渐迁徙成团,伸出伪足,诱导1周细胞形成网格样交叉,2周形成较长血管,后血管增粗,并出现分叉,CD31阳性表达。因此,脂肪干细胞体外可以被诱导向内皮细胞表型转分化,并形成血管,提示脂肪干细胞可以作为促进组织工程移植物血管化的种子细胞的理想选择。     

诱导间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:目前很多体内外实验都已表明间充质干细胞具有向心肌样细胞或心肌细胞分化的能力,这使间充质干细胞治疗心脏疾病成为可能。目的:比较诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化实验方法的异同及存在的问题。方法:以"mesenchymal stem cells,cardiomyocyte,differentiation;间充质干细胞,心肌细胞,诱导;分化"为检索词,应用计算机检索2000-12/2010-12 PubMed数据库与万方数据库,与间充质干细胞诱导分化为心肌细胞相关的文章。结果与结论:间充质干细胞向心肌细胞分化的方法主要有:①心肌细胞条件培养液:间充质干细胞在体外经药物诱导或模拟体内心肌微环境能定向诱导分化为心肌样细胞。②与希望诱导成的目的细胞共同培养:间充质干细胞可经药物诱导诱导分化为心肌细胞,也可不经任何诱导在心肌微环境中分化为心肌细胞。虽然间充质干细胞在体外心脏病理条件下可分化为心肌细胞,使间充质干细胞治疗心脏疾病成为可能,但其研究有待进一步完善。     

Tumors of Schwann's cells and pigmented skin cells

Both melanocytes and peripheral nerve sheath cells have an established origin from the neural crest. Benign and malignant neoplasms of these cells have distinctive ultrastructural features, but there is a group of tumors that has some characteristics of both cell types. The distinguishing feature of melanocytic neoplasms is the presence of cytoplasmic premelanosomes, which indicates cellular synthesis of melanin. Nerve-sheath neoplasms may show ultrastructural variation, but are generally found to have long cell processes associated with basal lamina-like material. Immunocytochemistry can be used to help distinguish tumors of melanocytic and Schwann's cells from unrelated neoplasms.     

NK 细胞上清液提高CTL 细胞对肝癌细胞杀伤力的研究

目的：研究用白细胞介素2（IL‐2）联合IL‐12、IL‐18以及三者共同活化NK细胞所提取的上清液与肝癌细胞共培养是否能提高AFP特异性的细胞毒性T细胞（CTL）对小鼠肝癌细胞的杀伤性。方法提取NK 细胞,分别用IL‐26000 IU／mL、IL‐26000 IU／mL＋ IL‐1210 ng／mL、IL‐26000 IU／mL＋IL‐l8100 ng／mL、IL‐26000 IU／mL＋IL‐1210 ng／mL＋IL‐18100 ng／mL活化NK细胞,3 d后提取上清液,ELISA检测上清液IFNγ表达量,然后将上清液与Hepa1‐6细胞培养过夜,流式细胞仪检测肿瘤细胞表面I类组织相容性抗原（M HC I）表达,以其为靶细胞检测AFP特异性的CTL细胞对 Hepa1‐6细胞杀伤率。结果NK＋IL‐2＋IL‐12、NK＋IL‐2＋IL‐18、NK＋IL‐2＋IL‐12＋IL‐18上清液的IFNγ含量高于NK＋IL‐2上清液的IFNγ含量（P＜0．05）,并且上述三组能有效提高小鼠 Hepa1‐6细胞表面M HC I的表达（P＜0．05）,从而显著提高了AFP特异性的CTL细胞对靶细胞的杀伤活性,然而阻断IFNγ分泌,AFP特异性的CTL细胞对靶细胞的杀伤活性降低。结论 NK 细胞上清液能够增强AFP特异性的CTL对肝癌细胞的杀伤作用。     

制作胚胎干细胞饲养层细胞条件的优化

背景:研究表明小鼠胚胎成纤维细胞的制作受多种因素的影响.目前对这些因素的研究均建立于半经验的基础上,缺乏客观定量的数据支持.目的:对小鼠胚胎成纤维细胞制作胚胎干细胞饲养层细胞条件进行优化.方法:用两种不同方法从孕13.5 d昆明小鼠胚胎中分离胚胎成纤维细胞,采用锥虫蓝染色计数,比较两种分离方法在细胞活性和数量方面的差异.对分离得到的胚胎成纤维细胞用0.05%胰酶在室温下消化不同时间,分析胰酶消化时间解离贴壁细胞能力和其对细胞活性影响;采用梯度浓度国产丝裂霉素灭活饲养层细胞2 h和2.5 h并制作细胞生长曲线,探索丝裂霉索最佳浓度和处理时间;通过不同冻存方法比较复苏后胚胎成纤维细胞活性,筛选出适合小鼠胚胎成纤维细胞最佳冻存方法.结果与结论:胚胎成纤维细胞对胰酶极其敏感,短时间多次消化法方法显著提高细胞活性和数量;室温下4～6 min胰酶消化时间有利于保存细胞活性:10 mg/L 2.5 h和20 mg/L 2 h丝裂霉素灭活适合制作饲养层细胞;程序性降温使细胞更能适应温度变化,显著提高解冻后细胞活性和数量.     

人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性

目的:通过体外诱导分化实验,评价人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力.方法:实验于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.①对象:经产妇知情同意,无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离,D-Hank's液冲洗后剪成碎片,加入含有0.2 g/L乙二胺四乙酸的0.5 g/L胰蛋白酶溶液,离心、消化、过滤,收集滤液,加入胎牛血清终止消化,重复消化2次.合并3次消化所得的细胞悬液,离心后将细胞沉淀悬浮于L-DMEM培养基中,按1.25×108 L-1密度接种,常规培养3 d后更换培养基,待细胞达80%~90%融合后用胰蛋白酶 乙二胺四乙酸联合消化,终止后离心弃上清,细胞沉淀用培养基重新悬浮,按1×107 L-1密度传代.③实验评估:用流式细胞仪鉴定人羊膜上皮细胞表型;使用10 μmol/L 5-氮杂胞苷和1 mmol/L抗坏血酸磷酸盐诱导第2代人羊膜上皮细胞,免疫荧光染色法检测诱导后细胞中特异蛋白结蛋白和α-辅肌动蛋白的表达,RT-PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA-4和心肌特异性收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA的表达.结果:①人羊膜上皮细胞的免疫组化特征:人羊膜上皮细胞几乎不表达CD44,不表达波形蛋白,表达角蛋白19.②人羊膜上皮细胞α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达肌系细胞标志α-辅肌动蛋白和结蛋白.③人羊膜上皮细胞Nkx2.5、GATA-4和α-肌球蛋白重链mRNA的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达心肌特异性转录因子Nkx2.5 mRNA和GATA-4 mRNA，心肌特异的可收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA未见表达.结论:通过胰蛋白酶消化法分离获得的人羊膜上皮细胞具有向心肌样细胞分化的特性,可能成为细胞心肌成形术的候选供体细胞.     

骨髓基质细胞向神经样细胞的分化

目的:有研究表明,在诱导剂β-巯基乙醇或二甲基亚砜与丁羟茴醚的作用下,80%骨髓基质细胞可诱导分化成神经样细胞,并表达神经元特异性蛋白,一些神经营养因子也能诱导骨髓基质细胞分化为神经样细胞.实验拟以三磷酸胞苷二钠为诱导剂,验证其诱导骨髓基质细胞分化为神经样细胞的可行性.方法:实验于2006-03/12在白求恩国际和平医院实验室完成.[1]实验材料:SD大鼠,体质量50～60g,雌雄不限,由河北医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.[2]实验方法:分离大鼠骨髓基质细胞进行体外培养,传代至第3代时实验组加入三磷酸胞苷二钠诱导剂诱导,对照组不加诱导剂.[3]实验评估:观察细胞分化为神经样细胞的形态变化,并进行免疫组织化学染色鉴定,计算阳性细胞百分比.结果:刚分离的骨髓基质细胞呈圆形,胞体透亮.接种24h后,少量细胞贴壁,72h后大部分细胞贴壁,形态为梭形、圆形、多角形,8～10d细胞达到90%融合,细胞呈长梭形排列呈栅栏状,传代后的细胞约24h完全贴壁,3～7d基本铺满瓶底.诱导后的骨髓基质细胞胞体变圆,突起逐渐伸长,并互相连接成网状,10d后免疫组织化学染色鉴定实验组表达神经元特异性烯醇化酶、神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞百分比明显高于对照组.结论:三磷酸胞苷二钠在体外可诱导骨髓基质细胞分化为神经样细胞.